chap3二代测序数据分析
二代测序数据分析
用Blast在GenBank中查询序列 GAATTCCAATAGA，命中了什么数据库序列
S和t的长为l的比对，把该比对拆成两部分，一 个从列1到列k，另一个从列k+1到l。计分系统 的什么性质保证对任意的k整个比对的计分是 其部分比对计分的和
acg $ac a acg aac g $ac aca a cg$ acg $ aca caa c g$a 5cg$ a caa 6g$a c aac
X=L[0] i=0
LF[0]=6, L[6]=c i=6 二代测序数据分析
LF[6]=5, L[5]=a i=5
BW Tranform 重构
恢复原序列
aacg $acaacg aacg$ac acaacg$ 3acg$aca caacg$a 5cg$acaa 6g$acaac
caacg $acaacg 1aacg$ac acaaCg$ 3acg$aca caacg$a 5cg$acaa 6g$acaac
LF[5]=3, L[3]=a i=3
LF[3]=1, L[1]=c i=1
循环转换
0a c a a c g $ 1 caa c g$a 2 aac g $ac 3 acg $ aca 4 cg$ a caa 5 g$a c aac 6 $ac a acg
字典方式排序
6$acaacg 2aacg$ac 0acaacg$ 3acg$aca 1caacg$a 4cg$acaa 5g$acaac
二代测序数据分析
短片段Mapping
输入
一个参考基因组 大量(10-1000M)的25~100bp的reads
输出
成功map到参考基因组上的每一个位点信息 未成功map比例
二三代测序技术的介绍和比较
二三代测序技术的介绍和比较二代测序技术（也称为高通量测序技术）和三代测序技术是目前最常用的两种DNA测序技术。
下面将对这两种技术进行详细介绍和比较。
1.二代测序技术：二代测序技术的代表性平台包括Illumina HiSeq、Ion Torrent PGM 等。
其工作原理是将DNA样本切割为较短的片段，并通过PCR扩增产生大量的拷贝。
然后，这些片段被连接在测序芯片上，每个片段都被反复地鸟嘌呤（A）、胸腺嘧啶（T）、胞嘧啶（C）、鸟嘧啶（G）四种碱基中的一种互补的碱基识读，并记录下与之相对应的碱基序列。
这些碱基序列最后被计算机软件组装为完整的DNA序列，进而获取样本的遗传信息。
优点：（1）高通量：可以同时测序数百万个DNA片段，获得庞大数量的数据。
（2）成本低廉：通过并行测序的方式，可以大大减少测序成本。
（3）高精度：二代测序技术的错误率较低，可以达到0.1%以下。
（4）测序速度快：每天可获得几百GB的数据。
缺点：（1）仅适用于短序列：由于二代测序技术的局限性，只能测序相对较短的DNA片段，对于长序列的测序存在困难。
（2）高度依赖参考序列：在组装过程中，需要有可靠的参考序列作为基础，否则可能出现组装错误。
（3）无法解析复杂的基因组结构：由于只能产生相对较短的序列片段，二代测序技术无法很好地解析复杂的基因结构，例如重复序列。
2.三代测序技术：三代测序技术的代表性平台包括PacBio SMRT、Oxford Nanopore等。
三代测序技术的特点是可以直接测量DNA单分子的临床序列。
该技术中的样本DNA被引入到小孔中，随后测序设备会通过测量DNA分子在小孔中的电信号变化来捕捉和记录碱基序列。
这种技术可以完整地获取较长的DNA片段，从而提供了更全面和准确的基因组信息。
优点：（1）长读长：能够测序较长的DNA片段，可以获得更全面和准确的基因组信息。
（2）无需参考序列：三代测序技术不需要依赖已知的参考序列，可以直接解析未知基因组。
二代测序数据分析简介
• The Solexa pipeline (i.e., the software delivered with the Illumina Genome Analyzer) earlier used
Quality
Encoding
• Sanger format can encode a Phred quality score from 0 to 93 using ASCII 33 to 126 • Illumina's newest version (1.8) of their pipeline CASAVA will directly produce fastq in Sanger format • Solexa/Illumina 1.0 format can encode a Solexa/Illumina quality score from -5 to 62 using ASCII 59 to 126 • Starting with Illumina 1.3 and before Illumina 1.8, the format encoded a Phred quality score from 0 to 62 using ASCII 64 to 126 • Starting in Illumina 1.5 and before Illumina 1.8, the Phred scores 0 to 2 have a slightly different meaning
二代测序数据分析简介
童春发 2013.12.23
主要内容
• • • • 重测序的原理及流程 数据结构与质量评估 SRA数据库及数据获取 Bowtie2、BWA和SAMtools软件使用
重测序的原理及流程
一代测序二代测序以及三代测序的优缺点及应用对比
一代测序二代测序以及三代测序的优缺点及应用对比一代测序（Sanger测序）是最早的测序技术，使用DNA聚合酶扩增特定区域的DNA片段，并通过合成带有不同碱基的荧光标记引物进行测序。
一代测序的优点是高可靠性和准确性，能够得到较长的读长，适用于小规模的基因组测序和位点测序。
不过，一代测序存在的缺点是昂贵、耗时且无法进行高通量测序，适用于较小规模的实验。
二代测序（高通量测序）是目前最为常用的测序技术，如Illumina和Ion Torrent等商业平台。
二代测序基于串联的扩增反应，DNA模板被分成数百万小片段，每个片段通过扩增、聚合和测序步骤进行处理。
二代测序具有高通量、较低的成本和快速的测序速度等优点，能够同时测序多个样本。
缺点是读长比较短，通常为几百个碱基对。
二代测序主要应用于全基因组测序、转录组测序、表观基因组测序等大规模测序项目。
三代测序（单分子测序）是较新的测序技术，如PacBio和Oxford Nanopore等商业平台。
三代测序通过直接测量单个DNA分子的顺序来进行测序，不需要扩增反应。
三代测序的优点是具有极长的读长，可以达到几十万个碱基对，能够测序重复序列和大的结构变异。
缺点是较高的错误率和较低的测序准确性。
三代测序主要应用于长读长测序、基因组组装和变异检测等需要长reads的研究。
总结起来，一代测序适用于小规模的实验，提供高质量的数据，但成本昂贵和耗时。
二代测序适用于大规模的测序项目，具有快速、高通量和较低的成本等优点，但读长较短。
三代测序适用于长读长测序和大结构变异的分析，但错误率较高。
根据研究需求选择合适的测序技术，或者结合多种技术来获得更全面的基因组信息。
第三代测序技术(单分子实时DNA测序)与第二代测序技术(高通量测序技术)简介
第三代测序技术（单分子实时DNA测序）与第二代测序技术（高通量测序技术）简介第三代测序技术(单分子实时DNA测序)与第二代测序技术(高通量测序技术)简介第三代测序技术简介如果有人告诉你用显微镜实时观测单分子DNA聚合酶复制DNA，并用它来测序，你一定会认为他异想天开，没有一点生物的sense。
我最初就是这样认为的，然而它不仅可以实现，而且已经实现了～这个就是被称为第三代的测序技术，Pacific Biosciences公司推出的“Single Molecule Real Time(SMRT) DNA Sequencing”(单分子实时DNA测序)。
我有幸在NIH听到了这个技术发明人Stephen Turner博士的讲座，根据自己粗浅的理解记录整理一下。
要实现单分子实时测序，有三个关键的技术。
第一个是荧光标记的脱氧核苷酸。
显微镜现在再厉害，也不可能真的实时看到“单分子”。
但是它可以实时记录荧光的强度变化。
当荧光标记的脱氧核苷酸被掺入DNA链的时候，它的荧光就同时能在DNA链上探测到。
当它与DNA链形成化学键的时候，它的荧光基团就被DNA聚合酶切除，荧光消失。
这种荧光标记的脱氧核苷酸不会影响DNA聚合酶的活性，并且在荧光被切除之后，合成的DNA链和天然的DNA链完全一样。
第二个是纳米微孔。
因为在显微镜实时记录DNA链上的荧光的时候，DNA链周围的众多的荧光标记的脱氧核苷酸形成了非常强大的荧光背景。
这种强大的荧光背景使单分子的荧光探测成为不可能。
Pacific Biosciences公司发明了一种直径只有几十纳米的纳米孔[zero-mode waveguides (ZMWs)]，单分子的DNA聚合酶被固定在这个孔内。
在这么小的孔内，DNA链周围的荧光标记的脱氧核苷酸有限，而且由于A，T，C，G这四种荧光标记的脱氧核苷酸非常快速地从外面进入到孔内又出去，它们形成了非常稳定的背景荧光信号。
而当某一种荧光标记的脱氧核苷酸被掺入到DNA链时，这种特定颜色的荧光会持续一小段时间，直到新的化学键形成，荧光基团被DNA聚合酶切除为止(见图)。
二代和三代测序原理及技术详解
二代和三代测序原理及技术详解二代测序（Second Generation Sequencing）和三代测序（Third Generation Sequencing）是现代生物学中常用的两种高通量测序技术。
二代测序技术主要包括Illumina测序技术和Ion Torrent测序技术，而三代测序技术则由PacBio和Oxford Nanopore等公司开发。
本文将详细介绍二代和三代测序的原理和技术。
二代测序技术采用了不同的原理，但其基本步骤相似。
首先，DNA 或RNA样本需要经过一系列的前处理步骤，如DNA片段化、连接测序指示子、PCR扩增等。
然后，将样品片段化的DNA或RNA分子固定到测序平台上，通过荧光标记的碱基依次加入到模板上，并经过图像采集系统进行扫描和记录。
最后，根据荧光信号的强度和位置确定每个碱基的序列，并通过计算机算法进行基因组的重建和分析。
Illumina测序技术是目前应用最广泛的二代测序技术之一。
其基本原理是通过将DNA片段固定到测序芯片上的特定位置上，然后通过反复的循环扩增和碱基加入的方式进行测序。
在每个循环中，只能加入一种荧光标记的碱基，并记录荧光信号，之后通过去除荧光信号并进行图像分析来确定碱基的序列。
Illumina测序技术具有高通量、高准确性和较低的测序成本，并广泛应用于基因组学、转录组学和表观遗传学等领域。
Ion Torrent测序技术是另一种常用的二代测序技术。
其原理基于DNA聚合酶催化链延伸反应，该反应会释放出质子，通过测量质子释放的情况来确定碱基的序列。
Ion T orrent测序技术具有高通量和较低的测序成本，但由于其测序误差率较高，主要应用于低复杂度的基因组测序和个体检测等领域。
与二代测序技术相比，三代测序技术具有更长的读长和更高的速度。
PacBio是其中一种代表性的三代测序技术。
PacBio测序技术基于单分子实时测序（Single-Molecule Real-Time Sequencing）原理，通过将DNA聚合酶与荧光标记的碱基一起加入到DNA模板上，通过测量聚合酶引发的荧光信号来确定碱基的序列。
第二代测序数据分析原理
第二代测序数据分析原理第二代测序技术是近年来迅速发展起来的高通量测序技术，能够产生大量的DNA序列数据。
与第一代测序技术相比，第二代测序技术具有更高的产量、更快的速度和更低的成本，成为当前基因组学研究和医学诊断的重要工具之一第二代测序数据分析原理是指对产生的高通量测序数据进行处理和解读的过程。
该过程涉及到数据的质控、序列比对、变异检测和功能注释等多个步骤，以获取对生物学问题回答所需的信息。
下面将详细介绍第二代测序数据分析的原理。
1.数据质控数据质控是第二代测序数据分析的第一步，其目的是剔除低质量的序列，保证后续分析得到的结果的准确性。
主要的质控步骤包括去除低质量碱基、去除接头序列和过滤冗余数据。
这些步骤可以通过使用不同的软件工具来实现，如Trimmomatic、FastQC等。
2.序列比对序列比对是将测序数据与参考基因组进行比对的过程。
参考基因组可以是已知的基因组序列，也可以是人工合成的探针序列。
序列比对主要采用两种方法：短序列比对和长序列比对。
短序列比对常用的算法有Bowtie、BWA等，长序列比对常用的算法有BLAST、GSNAP等。
3.变异检测变异检测是根据测序数据中的变异信息来鉴定样本中存在的单核苷酸多态性（SNP）、插入缺失（indel）等变异类型。
变异检测的过程主要包括变异鉴定、变异筛选和变异注释。
变异鉴定的方法包括泛素缺失、泛素纯化和下一代序列法。
变异筛选使用一系列的过滤条件来减少假阳性的产生，如频率过滤、质量过滤和功能过滤等。
变异注释是将检测到的变异与已有的数据库进行比对，以获取变异的生物学功能信息，如GEMINI、ANNOVAR等。
4.功能注释功能注释是将检测到的变异与基因、通路等功能元件进行关联，从而了解变异对生物学功能的影响。
功能注释的方法包括基因本体论（GO）、通路分析、蛋白质相互作用网络分析等。
这些方法可以帮助研究者理解变异的生物学意义以及变异在特定疾病中的作用机制。
综上所述，第二代测序数据分析原理包括数据质控、序列比对、变异检测和功能注释等多个步骤。
第二代测序中的数据分析-转录组
Step2: create a file called assemblies.txt that lists the assembly file for each sample.
Step3: $ cuffmerge -g genes.gtf -s genome.fa -p 8 assemblies.txt
• SAM tools
–
• TopHat software
–
• Cufflinks software
–
• CummeRbund software
–
*Linux, 64bit CPU, 16G memory
6.3 分析准备
6.3.1 Read alignment with TopHat
6.3.1 Read alignment with TopHat
3. Identify differentially expressed genes and transcript s
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LF mapping
? LF (last-first) mapping: 字符在最后一列与第 一列的出现次数位置保持不变
SA seq
06 $acaacg 0
1 2 a a c g $ a c 1 $0
20 acaacg$ 2
a1
33 acg$aca 3
4 1 c a a c g $ a 4 c4
5 4 c g $ a c a a 5 g6
? 恢复原序列
aacg $acaacg aacg$ac acaacg$ 3acg$aca caacg$a 5cg$acaa 6g$acaac
caacg $acaacg 1aacg$ac acaaCg$ 3acg$aca caacg$a 5cg$acaa 6g$acaac
LF[5]=3, L[3]=a i=3
65 g$acaac 6
LF mapping
? LF[i] = C[L[i]] + ri，C[L[i]]是L[i]在BWT中的起 始位置，ri是L[i]出现的次数
? LF[0] = C[L[0]] + 1 = 6 + 1 -1 = 6 ? LF[1] = C[L[1]] + 1 = 4 + 1 -1= 4 ? LF[2] = C[L[2]] + 1 = 0 + 1 -1= 0 ? LF[3] = C[L[3]] + 1 = 1 + 1 -1= 1 ? LF[4] = C[L[4]] + 2 = 1 + 2 -1= 2 ? LF[5] = C[L[5]] + 2 = 1 + 3 -1= 3 ? LF[6] = C[L[6]] + 2 = 4 + 2 -1= 5 ? LF[] = [6 4 0 1 2 3 5]
短序列片段
? 长度：35 - 120bp
? 碱基测序质量：Phred Quality Score
? ASCII表示 ? P是base-calling错误率
Q ? ?10log10 P
ASCII码表
内容
? 短片段序列 ? 短片段Mapping ? 基因型估计 ? 关联分析
短片段Mapping
? 输入
速，但对于空隙和错配，缺乏敏感度
BW Transform
?X→B
acaacg$
$acaacg aacg$ac acaacg$ acg$aca caacg$a cg$acaa g$acaac
BWT
gc$aaac
Burrows-Wheeler Matrix (BWM)
BW Transform
? 循环转换
? +HWI-EAS209_0006_FC706VJ:5:58:5894:21141#ATCACG/1 efcfffffcfeefffcffffffddf`feed]`]_Ba_^__[YBBBBBBBBBBRTT\]][]ddd d`ddd^dddadd^BBBBBBBBBB%的氨基酸，能否说2PAM矩阵平均改变2%
? 用Blast在GenBank中查询序列 GAATTCCAATAGA ，命中了什么数据库序列
? S和t的长为l的比对，把该比对拆成两部分，一 个从列1到列k，另一个从列k+1到l。计分系统 的什么性质保证对任意的k整个比对的计分是 其部分比对计分的和
LF[3]=1, L[1]=c i=1
acaacg $acaacg 1aacg$ac acaacg$ 3acg$aca 4caacg$a 5cg$acaa 6g$acaac
LF[1]=4, L[4]=a i=4
BW Transform
? BW Transform是可逆的 ? 时间复杂度为O(n) ? 重构时间复杂度为O(n)，空间复杂度为O(n)
? 一个参考基因组 ? 大量(10-1000M)的25~100bp的reads
? 输出
? 成功map到参考基因组上的每一个位点信息 ? 未成功map比例
短片段Mapping
? 问题
? 不唯一位置 ? 不确切位置
? 方法
? 哈希表：迅速，需要完美匹配 ? 阵列扫描：无法处理空隙 ? 动态规划：Indels，最优，但速度慢 ? Burrows-Wheeler Transform (BW Transform): 快
acg $ a c a ac g a a c g $a c a c a a cg $ a c g $ ac a c a a c g$ a 5c g $ a ca a 6g $ a c aa c
X=L[0] i=0
LF[0]=6, L[6]=c i=6
LF[6]=5, L[5]=a i=5
BW Tranform 重构
BLAST
BLAST
BLAST
二代测序数据分析
2019/9/25
测序数据分析流程
? 短片段序列 ? 短片段Mapping ? 基因型估计 ? 关联分析
短序列片段(fastq) Mapping (BWA, Bowtie)
基因型估计 (Bayes) 关联分析
短序列片段
? Fastq格式
? 文本文件 ? 包含短片段序列（reads）和碱基测序质量
0a c a a c g $ 1 caa c g$a 2 aac g $ac 3 acg $ aca 4 cg$ a caa 5 g$a c aac 6 $ac a acg
? 字典方式排序
6 $ ac a acg 2 a ac g $ac 0 a ca a cg$ 3 a cg $ aca 1 c aa c g$a 4 c g$ a caa 5 g $a c aac
? 示例
? HWI-EAS209_0006_FC706VJ:5:58:5894:21141#ATCACG/1 TTAATTGGTAAATAAATCTCCTAATAGCTTAGATNTTACCTTN NNNNNNNNNTAGTTTCTTGAGATTTGTTGGGGGAGACATTTT TGTGATTGCCTTGAT
BW Transform 重构
? 恢复原序列: X = L[ LF(i) ] + X; i = LF(i)
g $acaacg aacg$ac acaacg$ acg$aca caacg$a cg$acaa g$acaac
cg $a c aacg aa c g$ac ac a acg$ ac g $aca ca a cg$a cg $ acaa 6g$ a caac