分子病理学技术新进展
分子病理学技术新进展
?病理学的发展与使用的工具和方法的更新密切相关：
解剖刀剪等—进行尸体检查—器官病理学
显微镜—发明百年之后—细胞病理学
电子显微镜—发展—超微病理学
免疫组织化学—促进—免疫病理学
分子生物学—带动—分子病理学
计算机及网络—走进—信息病理学
病理学技术就是如何应用新工具的方法和措施。
从发展过程看，在新工具面前必须首先解决使用的技术及其相应措施，才能在理论上有所发现。所以，我们必须关注那些新工具、新方法，才能得以用于解决病理学中的问题。
病理学技术包括传统病理学技术和现代新技术
?传统：Formalin固定，石蜡切片和HE染色及特殊染色技术—病理学的基本技术。
?新技术：免疫组化、原位杂交、原位PCR、凝胶电泳技术、核酸杂交技术（包括FISH、CGH）、PCR技术、基因重组技术、基因测序技术、细胞凋亡检测技术、细胞培养技术、流式细胞技术、激光共聚焦、显微切割技术、组织芯片技术、DNA芯片技术等等。
?根据科研和临床病理诊断的需要，不断建立和开展新技术，把传统技术和新技术相结合，不断提高病理学技术水平，逐步与国际水平接轨。
常规病理技术
?近20余年来，常规病理技术也得到较大发展：
微波方法缩短组织脱水、浸蜡时间；
新的化学试剂取代传统的甲醛、二甲苯；
逐步向自动化发展（全自动封闭式组织脱水机、全自动染色封片系统、全自动特殊染色机等）
细胞病理学技术：传统的涂、刮片逐步向
薄层液基细胞学发展
TCT 液基细胞学检测
新柏氏超薄细胞检测仪
特殊染色技术
?HE染色虽是一种快捷、经济、且易于掌握的方法，但它不能回答病因学、组织发生及发病机制等许多方面的问题。为了显示与确定组织或细胞中的正常结构或病理过程中出现的异常物质、病变及病原体等，需要分别选用相应的显示这些成分的染色方法进行染色，固称特殊染色。?在过去的20年里，由于免疫组织（或细胞）化学技术的迅速发展与广泛应用，特染的应用日趋减少，人们感到以组织化学为基础的特染方法似乎有些过时，但实际上它在诊断病理学及研究中仍然有着不可忽视的作用。
特殊染色的方法很多，常用的一些特殊染色的方法介绍如下：
1、网织纤维染色（reticulin stains）
显示网织纤维及基底膜物质。传统的网织染色以银染为基础，有Gomori法,Wilder及Gordon 和Sweet法等，
它们在肿瘤病理诊断中具有鉴别诊断作用：
1）区别上皮与非上皮肿瘤；
2）区别某些间叶组织肿瘤；
3）区别原位癌与浸润癌。
2、PAS染色(periodic acid-schiff)
可以显示糖原、中性粘液物质、基底膜、霉菌与寄生虫。
3、微生物特染
最常用者是革兰氏阳性及革兰氏阴性细菌染色法（B&B）、分枝杆菌染色、霉菌染色。
4、嗜银及亲银染色不需外加还原剂，在黑暗中即有还原银盐的能力，称为亲银性(argentaffin),代表方法Fontana-Masson法。而需外加还原剂或在光线存在时才有还原能力，称为嗜银性（argyrophilic）, 代表方法是非改良的Grimelius法。
5、淀粉样染色刚果红（congo red）是最可靠且实用的检测淀粉样物质的方法。
6、三色染色（trichrome stains）可分别显示细胞核、细胞浆及细胞外胶原。
7、磷钨酸苏木素染色（PTAH染色）
一种三色染色的特殊类型，用于显示肌组织及胶质细胞胞浆内的微丝。
8、含铁血黄素、黑色素及钙染色显示含铁血黄素首选Perls普鲁士兰反应(Prussian blue)。Fontana-Masson 法是用含氨盐溶液显示黑色素的方法。在显示钙的染色中，von Kossa 法常用。
9、中性脂质染色油红（Oil red）是最常用的染色方法，但不能用于石蜡包埋的组织。中性脂质（lipids）最常用于肿瘤的诊断与鉴别，可区别卵巢纤维瘤及泡膜细胞瘤、皮脂腺癌与鳞状细胞癌等。
10、粘液染色（mucin stains）粘液染色法中，阿尔辛蓝(Alcian blue)和PAS联合可显示中性、轻度酸性及高度酸性粘液物质，故是最好的全粘液(pan- mucin)染色法。
11、Giemsa染色常用于涂片及切片染色。可清楚的显示并区分不同分化阶段的淋巴造血细胞，并可将肥大细胞浆染成紫红色颗粒，故在上述瘤性及反应性增生的诊断中有重要作用。12、髓鞘（myelin）染色分正常髓鞘染色和变性损伤髓鞘染色。最常用的方法为Luxol坚固蓝(Luxol fast blue)法。
13、弹性纤维（elastic fibers）染色最常用Weigert法及V erhoeff van Gieson (VVG) 法，一般认为前者特异，后者快速且清楚。
实践篇
准备阶段
?（一）抗体购买
试剂公司的选择
?北京中杉、福州迈新
?Leica、BioGenex(北京英硕力代理)、Santa Cruz （北京中杉代理）
?上海太阳、上海长岛
?武汉博士德、北京博奥生
?（二）组织处理
1、组织要新鲜
冰冻切片离体后尽快冻存
石蜡切片要尽快固定
2、主要病灶区取材
3、组织块V：1×1×0.2cm
?（三）标本固定
1、10％的中性福尔马林为常用的固定剂，对蛋白损伤少，能保存大部分组织结构。
2、固定时间6－12小时，以不超过48小时为宜。
3、固定液的量一般应为组织块总体积的4~5倍,也可达15~20倍。
（四）脱水、透明、包埋
1、脱水透明室温条件即可。
2、浸蜡包埋温度根据蜡的熔点确定（60－70度）。
（五）载玻片处理与切片制作
1、新载玻片硫酸浸泡过夜，流水冲洗，蒸馏水洗涤，置37℃温箱内烘干。
2、将载玻片浸入现配的1：50APES丙酮液1分钟，入纯丙酮溶液洗除未结合的APES，自然晾干。
3、切片厚度3－5μm，65℃温箱烤片2－4小时。
操作阶段
?热修复：高压、微波等
?双暴露：酶+热修复
抗体浓度
常用0.01mol/L pH7.4 的PBS 或TBS 缓冲液作抗体稀释液。选择最佳一抗、二抗稀释浓度。对照选择
?用PBS液代替一抗做阴性对照；
?用已知阳性的组织切片做阳性对照。
证明和肯定阳性结果的特异性，排除非特异性疑问。
结果判断
特异性反应产物常分布于特定的部位，如胞浆内，也有分布在细胞核和细胞表面的，即具有结构性。特异性染色表现为在同一切片上呈现不同程度的阳性染色结果。
非特异性染色表现为无一定的分布规律，常为某一部位成片的均匀着色，细胞和周围的结缔组织均无区别的着色。常出现在干燥切片的边缘，有刀痕或组织折叠的部位。
免疫组化结果的判断原则：
?1、必须设对照
?2、抗原表达必须在特定部位
?3、阴性结果不能视为抗原不表达
?4、免疫组化与HE切片诊断应
以HE切片诊断为准
细胞浆阳性表达
膜阳性表达
细胞核阳性表达
提高IHC方法敏感性的辅助手段
免疫组化染色过程中存在的问题、
原因分析及对策
?无色片（即无阳性信号）
?“杂音”染色片（有阳性信号）
1、全片着色
2、切片边缘着色
3、“阴阳脸”着色
4、灶片状着色
5、间质着色
6、细胞浆着色
7、细胞核着色
免疫组化染色影响因素
?影响免疫组化染色质量的因素有很多，在实验中应注意组织的取材和固定，选择质量好的商品化抗体，恰当地选择和使用封闭和抗原修复手段，严格的技术操作和对照等。
?注意组织的取材和固定
?假阴性问题
?假阳性问题
免疫组化自动染色仪
分子病理学相关技术
?原位杂交
?荧光原位杂交(FISH)
?多聚酶链式反应技术（PCR）
?原位PCR
?显微切割技术（micro-dissection）
?基因测序技术
?生物芯片技术
Southern印迹杂交法
?1975年首先由苏格兰爱丁堡大学Southern报告
?1981年Korsmeyer等首先将其应用于基因重排
?其原理是：两条单链DNA碱基可与人工合成的互补单链DNA探针相结合（一般用同位素标记）。
原位杂交
?原位杂交(in situ hybridization，ISH)是核酸分子杂交的一部分，是将组织化学与分子生物学技术相结合来检测和定位核酸的技术。根据所选用的探针和待检靶序列的不同，有DNA-DNA 杂交、DNA-RNA杂交和RNA-RNA杂交。
原位杂交技术的应用
?①细胞特异性mRNA转录的定位，可用于基因图谱、基因表达和基因组进化的研究；
?②感染组织中病毒DNA／RNA的检测和定位，如EB病毒mRNA、人乳头状瘤病毒（HPV）、乙型肝炎病毒(HBV)和巨细胞病毒DNA的检测；
?③癌基因、抑癌基因及各种功能基因在转录水平的表达及其变化的检测；
?④基因在染色体上的定位；
?⑤检测染色体的变化，如染色体数量异常和染色体易位等；
?⑥分裂间期细胞遗传学的研究，如遗传病的产前诊断和某些遗传病基因携带者的确定，某些肿瘤的诊断和生物学剂量测定等。
HPV原位杂交结果
HPV原位杂交结果
HPV原位杂交结果
原位杂交和免疫组化染色技术比较
?IHC使用的是抗体，其检测对象是抗原，机制是抗原—抗体的特异性结合，是蛋白质表达水平的检测；
?ISH使用的是探针，遵循碱基互补配对的原则与待检靶序列结合，是DNA或mRNA水平的检测。
荧光原位杂交
(fluorescence in situ hybridization，FISH)
用已知的标记单链核酸为探针，按照碱基互补的原则，与待检材料中未知的单链核酸进行特异性结合，形成可被检测的杂交双链核酸。由于DNA分子在染色体上是沿着染色体纵轴呈线性排列，因而可以探针直接与染色体进行杂交从而将特定的基因在染色体上定位。FISH技术的特点
FISH探针的种类
FISH技术在临床中的应用
?血液病检测
?产前诊断
?实体瘤检测
多聚酶链反应扩增(PCR)
?1985年首先由美国Mullis 等设计成功
?目前临床开展的PCR检测项目主要应用于遗传病的产前诊断、致病病原体的检测、癌基因的检测和诊断、DNA指纹、亲子关系鉴别及法医物证等方面。
?随着PCR技术的不断发展，针对各种需要，衍生出许多类型的PCR方法，包括巢式PCR 、复合PCR 、反向PCR 以及实时定量PCR 等，尤其是实时定量PCR，通过监测PCR反应过程中荧光信号描绘扩增曲线，对起始模板进行定量，现在也已经广泛地
应用于临床，如病毒的拷贝数等。
原位多聚酶链式反应技术(PCR in situ)
?原位PCR技术是多聚酶链式反应技术的一个类型，是将PCR的高效扩增与原位杂交的细胞及组织学定位相结合，在冷冻或石蜡包埋组织切片、细胞涂片或培养细胞爬片上来检测和定位核酸。其敏感性比原位杂交高出2个数量级，是形态学和分子生物学前沿交叉的产物。
原位PCR技术的应用
?原位PCR技术能用于低拷贝的内源性基因的检测和定位，在完整的细胞样本上能检测出单一拷贝的DNA序列，可用于基因突变、基因重排和染色体易位等的研究和观察；
?外源性基因的检测和定位，如对各种感染性疾病病原的基因检测，如EB病毒、人乳头状瘤病毒、肝炎病毒、巨细胞病毒和人免疫缺陷病毒基因组及结核、麻风杆菌基因的检测等
?临床上还可用于对接受了基因治疗患者体内导入基因的检测等。
显微切割术(microdissection)
?显微切割术是90年代初发展起来的一门新技术，它能够从组织切片或细胞涂片上的任一区域内切割下几百个、几十个同类细胞，甚至单个细胞，再进行有关的分子生物学方面的研究，如PCR，PCR-SSCP及比较基因组杂交等。
?冰冻或石蜡包埋组织切片或细胞涂片。
?切片的厚度可为4～l0 m ；冰冻切片需经甲醛或乙醇固定；组织切片还必须染色：1％～2％的甲基绿、0.1％的核固红、3.6％的瑞氏染液或2％的苏木素等，也可用免疫组织化学染色?显微切割的方法：手工操作法和激光显微切割法（LCM）
激光捕获显微切割(1aser capture microdissection，LCM)技术
?原理：利用激光束照射需要切割的区域，该区的EV A膜受激光照射后，瞬间温度升高并与其下方的细胞相粘连，但不损伤细胞，当将EV A膜揭起来时，与之相连的细胞也随之被完好地从切片上切割下来；将带有细胞的EV A膜放人试管内经蛋白酶消化使细胞与膜分开，同时也将细胞裂解，获得待提物质，如DNA、RNA或蛋白质等。
冰冻切片的激光显微切割
?显微切割术的特点是可获得某一特定的同类细胞或单个细胞，尤其适用于肿瘤的分子生物学研究，如肿瘤的克隆性分析、肿瘤发生和演进过程中各阶段细胞基因改变的比较研究和肿瘤细胞内某些酶活性的定量检测等。
?该技术的不足之处是使用手工操作的技术难度较大；用LCM虽然操作简便，耗时少，取材准确，但需特殊的设备，激光器造价高
生物芯片技术
?生物芯片技术(biochip technique)是近年来才发展起来的生物医学高技术
基因芯片
蛋白质芯片
组织芯片
基因芯片
?由美国斯坦福大学医学中心生化系Brown教授领导的研究小组在1995年首先报道的。?表达谱芯片；
?诊断芯片；
?检测芯片；
?SNP芯片；
基因表达谱芯片检测原理示意图
基因芯片的应用
?在基础研究方面
?临床上
?利用基因芯片可以大规模、高通量地对成千上万个基因同时进行研究，从而解决了传统的核酸印迹杂交技术操作复杂、自动化程度低、操作序列数量少和检测效率低等问题。通过设计不同的探针阵列和使用特定的分析方法使该技术具有广阔的应用前景。应用基因芯片技术要求实验材料是从新鲜组织或培养细胞中提取的mRNA。
HPV-DNA检测
?PCR技术
?Southern 杂交技术
?基因芯片技术
HPV与宫颈癌的关系
?宫颈癌为女性第二常见肿瘤
?中国每年新发宫颈癌病例13万
?99.7％宫颈癌的发生与HPV感染有关
?WHO将HPV列为肿瘤致病因子
?宫颈癌的发生过程：
尖锐湿疣，CIN I CIN II CIN III 原位癌早期浸润癌宫颈浸润癌?宫颈浸润癌之前任意时期及时终止，均可治愈
蛋白芯片(protein microarray)
?是继基因芯片之后发展起来的对基因功能产物表达水平检测的技术。
?是在一个载体上点布高密度不同种类的蛋白质，再用荧光标记的已知抗体或配体与待测样本中的抗体或配体一起同芯片上蛋白质竞争结合，在扫描仪上读出荧光强弱，再经计算机分析计算出待测样本结果。
?高通量分析平台蛋白芯片技术的建立将为蛋白质功能及其相关的研究提供快速、高信息量和更为直接的研究方法，与其他的分子生物学分析方法相比，蛋白芯片技术具有快速、平行的优越性。该方法的建立和应用将有助于人类揭示疾病发生的分子机制及寻找更为合理有效的治疗手段和途径。
组织芯片(tissue microarray)
?由Kononen等在1998年首次提出的，将数十个至数百个小的组织片整齐地排列在某一载体上(通常是载玻片)而成的微缩组织切片。
基因测序技术
基因测序技术在癌症基因研究及临床治疗领域的应用将不但使我们能更快速可靠地对癌症进行诊断, 对其发生的内在分子机理也将有更深入的了解, 同时也将对癌症治疗药物的开发提供极大帮助。
?病理形态绝顶碱基形态
?细胞有形态
?DNA有形态
?专家的形态学观点在弱化
?主观诊断转化客观诊断
?若不掌握现代的基因检测技术，分子病理会被边缘化
?Nature 2001，409，p853 提出一个新概念：所有癌症都是由基因造成的
其它相关技术
?细胞凋亡检测技术
?RT-PCR技术
?Western-blot技术
?ELISA技术
?细胞培养
?药敏实验
?等等
分子病理学技术在临床诊断、个体化治疗
及医学科研中的应用
分子病理学的诞生
近十几年来，医学获得了分子生物学理论和实验的充实，建立起许多完全崭新的临床检验方法，甚至部分替换某些旧的传统检测方法。
从广度上-----扩大了临床观察视野
从深度上-----达到基因分析境界
分子病理学在此基础上诞生并发展起来。分子病理学作为病理学的一个现代分支，为国内外所公认。
分子病理学的发展
分子病理学的发展由始即以拥有大量实验、技术逐日进步为特征，并彼此相辅相成。分子生物学家不熟悉疾病，临床学家忙于临床防治疾病，使分子生物学当代理论和实验及时的引进、提炼并为临床诊断、认识疾病服务，这一历史任务，落在病理学工作者的肩上。?一项覆盖了9个国家和地区，1217例病人的泛亚洲科研显示：没有相关的靶标却接受了靶向治疗，死亡风险将增加185%。
——新英格兰医学杂志.2009.9.v361(10).
?“我知道每个患者不一样，而且需要个体化治疗，但我更需要知道他们有何不一样，如何根据这些不一样来实施个体化治疗。”
——一位中国临床肿瘤医生, 2009
分子靶向治疗的概念
靶向治疗与个性化治疗
基因诊断的定义
基因诊断是通过直接探查基因的存
在状态或缺陷对疾病作出诊断的方法。基
因诊断的探测目的物是DNA或RNA。
DNA----反映了基因的存在状态
RNA----反映了基因的表达状态
探查基因的分类
?内源基因----机体自身的基因
用于诊断基因有无病变
?外源基因-----如病毒，细菌等
用于诊断有无病原体感染
分子病理学诊断
?相对于其他疾病，肿瘤临床治疗的有效率目前仍然偏低。随着人类基因组学、药物基因组学及肿瘤分子生物学研究的不断深入和发展，人们对肿瘤多成因、异质性的特点有了更加全面的认识。个体化治疗已经成为肿瘤临床治疗的发展方向和最有效的手段。
?但是，如何识别具有相同肿瘤发生部位、相同病理类型及病期的不同患者之间存在的差异成为实施个体化治疗的主要障碍。大量的临床研究和试验结果表明：特异肿瘤分子标志物（靶标）是识别患者个体差异的重要依据，实现对这些靶标的检测是实施肿瘤个体化治疗的前提和基础。
用于识别肿瘤患者个体差异的靶标大致可归纳为三类：
?1）肿瘤治疗性药物的作用靶标:
如HER2基因拷贝数和EGFR基因突变；
?2）肿瘤药物代谢相关的靶标:
如UGT1A1和CYP2D6等基因多态性；
?3）肿瘤药物作用路径的相关靶标:
如KRAS基因突变和ERCC1基因mRNA表
达水平。
?随着抗肿瘤药物的不断增加以及研究的深入，与作用路径有关的靶标越来越多。检测也从以前的单一靶标发展为多靶标联合进行。通过针对不同癌种的系统靶标检测，筛选适合患者个体的药物，提高治疗的针对性和有效率。
分子病理学用于基因诊断的常用手段
常用的靶向药物
?美罗华（利妥昔，Rituximab）
?赫赛丁（曲妥珠单抗，Trastuzumab）
?帕妥珠单抗（Pertuzumab,Omnitarg）
?格列卫（伊马替尼，Imatinib）
?西妥昔（Cetuxamab）
?特罗凯（厄洛替尼，Erlotinib）
?易瑞沙（吉非替尼，gefitinib）
?贝伐单抗（Bevacizumab）
靶向治疗应用较为广泛的肿瘤
?淋巴瘤（CD20阳性）
?乳腺癌（HER2阳性）
?胃肠间质瘤（CD117/CD34阳性）
?肺癌
?胃肠癌
?隆突性皮肤纤维肉瘤
易瑞沙治疗肺癌的机理
?靶向药物吉非替尼能够与EGFR细胞内的A TP结合位点上的三磷酸腺苷竞争,阻断其酪氨酸激酶活性,进而阻断EGFR的信号传导通路,阻碍肿瘤的生长、转移和血管生成,并可诱导肿瘤细胞的凋亡
血管内皮细胞生长因子VEGF作用机理
?内皮抑制素
1 核仁素（nucleolin）
2 整合素（integrin）
?Endostatin
抑制VEGR诱导的NO合成和内皮细胞迁移，促进凋亡；与pro-MMP2结合，抑制MMP2等。
?VEGF-R
通过Ras-Raf-MEK-ERK/MAPK及PI3K-AKT通路
更为重要的是肿瘤的分子分型
?肿瘤细胞的分型已不单纯是形态学，更有基因标型。
临床医师的机遇与挑战
?传统的病例诊断没有过时，但要与时俱进！
?目前，是从规范化治疗到个性化治疗的过渡时期。
?当前我们面临严峻的挑战和难逢机遇，临床医师与病理不会错过、发展的大好机会！
FISH技术在临床中的应用
FISH检测在临床中的应用
?血液病检测
?产前诊断
?实体瘤组织检测
FISH在实体肿瘤应用的目的
个体化治疗方案确定
肿瘤诊断
预后判断
肿瘤的形成
细胞内肿瘤相关基因发生异常（癌细胞）
细胞功能发生改变
细胞形态发生改变
癌细胞不断异常增殖
肿瘤形成
肿瘤发生过程
在乳腺癌检测中的应用
我国女性的乳腺癌发病率为20.1/10万
乳腺癌的流行病学调查
?欧美为高发地区，发病率在60～80/10万左右，位列女性恶性肿瘤发生的第一位，且逐年上升。?而乳癌的死亡率大约占女性恶性肿瘤死亡的15％左右，仅次于肺癌（25％）。
?我国的乳癌发病率在20/10万左右，在女性恶性肿瘤中位列第三位，而且发病率也成逐年上升的趋势。在一些大城市如上海，1999年的调查显示，乳癌的发病率已经达到52.9/10万。
乳腺癌治疗新进展
?新的治疗理念
剂量密度和剂量强度
?新的治疗药物
蒽环类药物新的应用
以紫杉醇为代表的传统药物
以赫塞汀为代表的靶向药物
HER-2基因扩增检测
药物的选择
应用遗传药理学的原理靶向性地选择药物
?1998 年美国FDA批准第一个专门针对p185高表达乳腺癌的抗体治疗药物Herceptin上市,在全世界开创了单抗类分子靶向药物治疗肿瘤的新时代。
?①下调细胞表面的HER一2蛋白
?②减少血管内皮生长因子的产生
?③介导对过度表达HER一2的肿瘤细胞的抗体依
赖性细胞毒作用(ADCC)
?④抑制HER一2蛋白与受体酪氨酸激酶超家族的
其他成员发生交联形成异质二聚体
?⑤减弱细胞生长信号的传递
?⑥通过诱导P27kipi和RB相关蛋白P130而大量减
少s期细胞数目
?⑦增强化疗所致细胞毒性
Her-2的概况
◆Her-2: 又名C-erbB-2, Her-2/neu
◆属于EGFR家族成员
◆为原癌基因,编码跨膜型酪氨酸激酶生长因子受体
◆25~30%的乳腺癌为Her-2基因的扩增/过度表达
◆Her2基因扩增的乳腺癌被认为对内分泌治疗相对不敏感
HER-2基因扩增检测
?约有25%的乳腺癌病人HER2蛋白呈过度表达。
?人类表皮生长因子2，是由原癌基因编码的HER2受体,HER2在调控正常细胞的生长和发育和分化中起重要作用。
?HER2原癌基因扩增导致HER2受体在细胞表面过度表达。
分子靶向治疗
?赫赛汀(Herceptin)是针对肿瘤细胞Her-2基因靶点的第一个分子靶向药物，为乳腺癌临床治疗带来了新的突破。
?赫赛汀二线或三线单药治疗总有效率为19%。
?一线治疗总有效率可达35 %。
?中位生存期为24.4个月，且具有良好的耐受性。
?内分泌治疗HER2阳性患者相对耐药
?CMF方案HER2阳性患者相对耐药
?蒽环类对大剂量蒽环类相对敏感
?紫杉类药物相对敏感
中国抗癌协会乳腺癌诊治指南与规范（2007版）
乳腺癌石蜡组织标本
什么是乳腺癌HER-2基因扩增？
?HER-2基因定位于17q11.2-q12
?由于17号染色体非整倍体造成的HER-2基因增加不是HER-2基因扩增，与赫赛汀治疗效果不相关；
?只有HER-2基因自身扩增才是真正的HER-2扩增
HER-2基因扩增示例图1
HER-2基因扩增示例图2
HER-2扩增检测的临床意义
?指导临床赫赛汀的使用
?指导临床常规化疗药物的应用
?风险预测
TOP2A基因异常检测
TOP2A Aberrations in
Breast Cancer
TOP 2A拓扑异构酶α
?由于TOP2A基因也定位与17q染色体，并且与Her-2基因相隔很近，而且，拓扑异构酶II α是蒽环类抗生素的靶酶，因此有推断称使用TOP2A基因状态来预测患者对含蒽环类药物治疗方案，更为准确。
什么是TOP2A基因异常?
?TOP2A基因定位于17q21.1，是DNA拓扑异构酶Ⅱ的基因；
?TOP2A基因异常包括扩增和缺失两种情况。
蒽环类药物治疗的机制
?蒽环类药物是一种拓扑异构酶抑制剂，研究表明它可能是通过抑制肿瘤细胞DNA拓扑异构酶的活性而抑制肿瘤细胞的分化发育。
检测TOP2A基因的意义
?TOP2A基因异常的病人预示着更短的无复发生存期（recurrence-free survival ，RFS）但总生存期并无改变，TOP2A缺失的病人预后更差
?由于TOP2A基因也定位与17q染色体，并且与Her-2基因相隔很近，而且，TOP2A基因所编码的蛋白拓扑异构酶II α是蒽环类抗生素的靶酶，研究发现使用TOP2A基因状态来预测患者对含蒽环类药物治疗方案，更为准确；
检测TOP2A基因的意义
?在对晚期乳腺癌的研究中发现,Topo Ⅱα的基因表达和肿瘤细胞对拓扑异构酶抑制剂的敏感性明显相关TOP2A基因异常的病人可以明显受益于含有拓扑异构酶抑制剂的辅助化疗方案；TOP2A扩增的病人使用CEF方案进行治疗可以降低61%的复发风险和51%的死亡风险，而没有TOP2A扩增的患者使用CEF方案只能降低6%的复发风险和10%的死亡风险。
TOP2A与HER-2的相关性
?TOP2A和Her-2/neu原癌基因在染色体上的位置非常邻近，均定位于17q11.2-22区域；?研究证实，在乳腺癌中Her-2/neu基因扩增又与其邻近位点上的TOP2A基因改变呈正相关；?当Her-2/neu基因在乳腺癌中过度表达时，通过多种途径参与跨膜信号的转导及促进细胞的增殖，这可能是TOP2A基因扩增的原因；
TOP2A与HER-2的相关性
?研究表明，对于her-2扩增阳性的乳腺癌患者，使用赫赛汀后会得到更好的预后效果，并且，使用大剂量蒽环类药物的治疗效果要优于常规剂量的治疗效果，这可能是由于HER-2与TOP2A的正相关性原因所致；
?尽管大部分her-2扩增的患者都存在TOP2A基因的扩增，但并不能使用her-2状态来预测TOP2A基因的状态；而且，并不是所有存在TOP2A基因扩增的患者都会有topo II α蛋白的高表达，如果使用topo II α蛋白对肿瘤的增生状态进行评测，结果将会收到一定的影响
TOP2A基因异常检测试剂盒临床意义(一)
预测含蒽环类药物治疗方案的疗效
TOP2A基因异常检测试剂盒临床意义(二)
对患者预后进行判断
TOP2A基因异常检测
?预测含蒽环类药物治疗方案的疗效
?对患者预后进行判断
在膀胱癌中的应用
?概述
?FISH技术
?膀胱癌FISH探针
?方法学
?FISH结果分析和判断
膀胱镜检查及细胞形态学检测是诊断及监测膀胱癌最重要的二种手段。然而，细胞形态学检测敏感性低，膀胱镜检查病人痛苦，难以接受。从尿液中检测与膀胱癌发生相关的抗原虽灵敏性高于细胞形态学检测，但特异性较低，不能成为可靠的诊断指标。
随着对膀胱癌遗传学改变的深入研究，人们发现9号染色体部分（如p16位点）或全部丢失是最常见遗传学改变，且这一改变与膀胱癌的早期发生密切相关。此外，膀胱癌的发展与染色体不稳定性也紧密相连，特别是与3号、7号及17号染色体的非整倍性密切相关。目前的临床研究显示，对尿液或膀胱冲洗液中细胞进行以上遗传学改变的检测对膀胱癌的早期诊断及病程监测有很大的价值，其灵敏度高于细胞形态学检测，特异性则与细胞形态学检测相当。
检测以上遗传学改变标准方法为FISH技术。故在欧美等国，由于尿液检测的非创伤性及非痛苦性FISH技术已成为排除血尿病人患膀胱癌的最有效的方法之一。
有报道,FISH检测膀胱癌的灵敏度大约80%, 特异性大约96%
膀胱癌检测FISH探针
膀胱癌FISH 探针组(二)
?分析方法
?阈值建立
?结果判断
?临床意义
分析方法
检测每组探针在间期细胞中信号.确定结果是否为阳性或阴性
在子宫颈癌早期诊断中的应用及治疗策略探讨
*早在十九世纪四十年代，一位意大利医生Regoni Stern最早提出结婚与否与宫颈癌的发生可能有关；
*60－70年代，人们的主要研究对象是HSV,HCMV等病原体；
*1974年zur Hausen首次提出HPV感染与宫颈肿瘤有密切关系；
*1977年Laverty在电镜中观察到宫颈癌活检组织中存在人乳头状瘤病毒（Human papillomavirus，HPV）颗粒；
*1995年IARC专题讨论会：高危型HPV持续感染是宫颈癌的主要病因。
--- 99.7％的宫颈癌患者都能发现高危型HPV感染。
HPV的致癌机理
?HPV以游离态感染上皮细胞后，可以持续存在于染色体外，不引起任何病变，或引起良性病变和低度病变，如尖锐湿疣或轻度不典型增生等。而癌变则与病毒DNA整合入宿主染色体密切相关。
?高危型HPV DNA链通常在E1或E2的开放读码框内断裂，使HPV DNA整合入染色体脆弱区。E6和E7具有促进和维持整合状态的功能
?HPV E6蛋白间接抑制p53活性，阻碍细胞对DNA损伤的反应。（负向调节细胞的生长和分化）?HPV E7蛋白与pRb结合后使其功能失活，改变细胞周期的正常调控
型别：已发现100多种不同的亚型（如果DNA序列同源性小于90％，则定为新的亚型）。其中超过35种可以感染人类的生殖器官，约30种与肿瘤有关。
1）低危型：宫颈上皮内低度病变，引起外生殖器湿疣等良性性病（HPV 6、11、42、43、44 ）；2）高危型：宫颈上皮内高度病变，与宫颈癌的发生有关（HPV 16、18、31、33、35、39、45、51、52、53、56、58、59、66、68、73、83、MM4 ）；
分布：有些亚型和地区、宫颈癌的病理类型有关。
HPV45在非洲西部很常见，HPV39和59在美洲中部和南部常见，HPV52，58在中国常见。在宫颈鳞状上皮细胞癌中以HPV16（占51％），在腺癌和腺鳞癌中HPV18分别占56％和39％。hTERC基因与宫颈癌
子宫颈细胞hTERC位点扩增检测试剂盒
FISH在宫颈癌诊断中的应用
?宫颈癌发生及发展阶段
正常→ASCUS→CIN1→CIN2→CIN3（原位癌）→浸润癌
?人类染色体端粒酶（hTERC）基因，GLP TERC: 3q26.3
有效进行子宫颈癌前病变的病理分级
卫生部多中心临床试验
FISH检测子宫颈上皮细胞hTERC基因扩增的临床应用研究：
宫颈癌FISH检测临床意义
?伴有hTERC基因扩增的癌前病变的病人有52%－96%的恶变可能。
?可预测CIN1/CIN2 向CIN3发展的风险因素，其灵敏度是100% ，特异性是70%. ?FISH是进行筛查，早期诊断和风险预测的有效手段
TERC基因检测的临床意义
子宫颈癌筛查及诊断程序
FISH检测技术
在产前、产后诊断中的应用
出生缺陷（birth defects）：是指胚胎或胎儿在发育过程中发生解剖学和功能上的异常。
国家人口和计划生育委员会发布:
我国每年有2000万名新生儿，出生缺陷患儿占全部出生人口的4%～6%,占全世界500万出生缺陷儿的1/5。
出生缺陷性疾病
染色体病：13三体综合征、18三体综合征、唐氏综合症T urner综合征（45，X）、克氏综合症(47,XXY)等。
单基因遗传病：血友病、假性肥大性肌营养不良等。
多基因遗传病：神经管畸形
可以检测的疾病
唐氏综合症（21 三体）
面部扁平、发育迟缓、智力低下;20~24岁,发病率1/800
Patau 综合症（13 三体）
智力严重缺陷，兔唇，易发心脏病；发病率1/8000
Edward 综合症（18 三体）
早夭，智障，残指等；发病率在1/2000到1/8000，第二大染色体疾病
T urner 综合症(45，X)
先天性卵巢发育不全；活产女性新生儿发病率大约为 1 / 2500
Klinefelter 综合症（47，XXY）
先天性睾丸发育不全
FISH检测的临床特点
FISH可以准确且快速的检测出13、18、21、X和Y染色体的数目异常，24小时出结果。 FISH对样本要求比较低，不需要细胞培养，间期细胞即可检测。
FISH在产前诊断中的应用(一)
FISH技术在欧美国家产前诊断中起重要作用，独立应用FISH检测占50%，与细胞学互补检测广泛应用。
2000年美国医学遗传学院（ACMG）宣布，FISH技术产前诊断结果可靠，与细胞染色体分析价值等同。
2004年英国国立监测委员会（UKNSC）建议唐筛高危孕妇，不需要常规核型分析，单纯应用21，18 和13的探针进行FISH诊断。
FISH在产前遗传性疾病中的应用(一)
在50多家产前诊断中心完成有效病例总计5558例。
?FISH诊断成功率100%。
?核型分析8例羊水细胞培养失败。
?8例羊水细胞培养失败的病例，经FISH诊断，1例为21-三体，1例为47,XXY，其余6例诊断正常。两例异常病例后被核实，诊断正确。
产前染色体数目检测临床意义
针对唐氏筛查阳性结果快速检测。
核型分析和FISH检测是产前诊断的双重保险。
用于意外流产的胎儿的流产原因检测？？
FISH荧光原位杂交平台
--基因检测有力工具
基因测序技术在临床中应用
?基因测序技术在癌症基因研究及临床治疗领域的应用将不但使我们能更快速可靠地对癌症进行诊断, 对其发生的内在分子机理也将有更深入的了解, 同时也将对癌症治疗药物的开发提供极大帮助。
与临床医学及病理密切相关的基因检测项目
?P53
?BRCA1 、BRCA2
?APC
?K-ras
?ApoE
?EGFR
?C-kit
?FV
?YMDD
?HNPCC片段分析
?尿路肿瘤微卫星片段分析
临床应用
?肿瘤诊断：肝癌、乳癌、膀胱癌、胃癌、肠癌、前列腺癌、肺癌、食道癌、卵巢癌、脑肿瘤、软组织肉瘤、骨肉瘤、白血病、淋巴瘤。
?癌前及癌相关家族：萎缩性胃炎、大肠息肉、腺瘤、宫颈异型增生、乙肝和丙肝、子宫内膜不典型增生、痰、膀胱、粪便中异型细胞、乳腺囊性增生症及腺病等、骨髓异常增生综合症、低恶肉瘤、淋巴造血疾病等。
?药物分子靶点和耐药基因：P53蛋白丢失，肿瘤细胞侵袭性增强，化疗凋亡作用受抑。某些肉瘤如脑肿瘤和癌的分子药物基因靶点治疗和化疗效果不佳。检出P53基因突变，有利于对昂贵且毒副作用大的治疗方案进行科学调整，有突变者用P53腺病毒（今又生）治疗更有针对性。?临床预后分析：P53基因突变癌症患者的生存预期短，易复发转移且家族血亲之间具肿瘤易感性。
BRCA1基因
?BRCA1外显子约5.2KB全长序列，可分成44项完成全基因组检测。
?BRCA2基因位于13q12-13，BRCA1抑癌基因位于染色体17q21，是目前极受重视与乳腺癌明确相关的易感基因，BRCA癌基因异常者在一生中患乳腺癌的理论概率为100％。
临床应用
肿瘤诊断：
?BRCA1基因突变：主要为乳腺癌、卵巢癌，同时也有胰腺癌、胃癌、胆囊癌、恶性黑色素瘤、白血病、前列腺癌、子宫癌等。其中60％为1-5bp的缺失框移，19％为小插入，14％为无义突变，也有大缺失或插入及剪接子突变。
?伴卵巢癌的乳癌家系约有80%是由BRCA1的异常引起
?BRCA2基因突变：主要与家族性乳癌和男性乳癌发病有关，另也有上述其它系统的恶性肿
瘤发生概率。
?癌的分化：
BRCA1的突变及杂合子缺失与乳癌的中－低分化生物学行为有关，临床上多表现为Ⅲ－Ⅳ期及早－晚期患者。
?癌前及症前诊断：
主要用于乳癌、卵巢癌及消化系统癌症家族患者的基因突变检测。
APC基因
?APC 基因位于第五号染色体的长臂（5q21-22），长达120KB，共有21个外显子。
?APC基因突变主要位于基因中段的第9-11外显子，其中密码子第1061，1309的突变占了20%。患者可次序发生1000个以上的息肉，年龄轻，癌变早。
?APC基因前、后段的基因突变与数量较少的小息肉有关，发病年龄较晚。可伴有纤维瘤病，后者与第1444位密码子突变有关。如在第386和1465位的突变，对野生型APC基因干扰弱，息肉少，发病年龄较晚。
?APC基因突变分为有害（轻，中，重），多态性，和意义不明性。须结合病理形态诊断来评估基因突变的临床病理意义
临床应用
?家族性腺瘤性息肉病（FAP）：APC致病基因突变，几乎100%的预示该家族成员的息肉存在（WHO资料）恶变可能，需密切复查肠镜病理检查。
?Gardner 综合征：除了肠腺瘤外，病人还有表皮样囊肿，骨瘤，牙疾和纤维瘤病。
?特克综合征（Turkot syndrome）：多发性肠腺瘤伴脑髓母细胞瘤。
?减性家族性腺瘤性息肉（Atteneuated FAP）:腺瘤少于100个，发病晚，癌变率较低。
?其他：APC基因突变相关的疾病和肿瘤还有遗传性大肠癌组织APC基因突变率高达70% -90% 以上，散发性大肠癌组织中也有30%以上的突变率.
?癌组织体细胞APC基因突变，意味着癌变的早期分子事件，肿瘤的亚克隆选择，去分化恶性演进，浸润转移耐药等生物学行为暂未发生，预后尚好。
?肺癌、胃癌、食道癌、肝癌、乳腺癌等也有不同比例的APC基因突变。
注意事项：
?检查材料主要是肠镜病理活检息肉或肿瘤组织，石蜡包埋病变组织，血液等。
?APC基因与NHPCC微卫星不稳定都是早期癌基因检测互补项目，最好结合应用。
?大肠多发性腺瘤性息肉病APC基因突变测序，也可检测胃癌，乳腺癌，胰腺癌及癌前病变和少数肉瘤的APC癌基因突变。它反映早期的癌变趋势。
Ras基因
?Ras基因家族由H-ras、K-ras和N-ras组成。
?我们检测K-RAS最常突变第一外显子点突变常位于第12、13、59或61密码子处，不同的ras基因突变在不同的肿瘤中呈优势激活。
临床应用：
?肿瘤诊断：
K-ras突变：肠癌、胃癌、胰腺癌、肺癌等为主
H-ras突变：急慢性淋巴造血系肿瘤为主
N-ras突变: 泌尿系肿瘤为主
?癌前及家系检查：
癌前疾病患者ras基因突变提示细胞早期的恶性转化。
癌病家族受检者ras基因突变提示正常细胞的恶性演进和癌变。
ApoE基因
?APOE（载脂蛋白E）基因位于19q，全长3.7 Kb，含有4个外显子，产生的APOE功能蛋白是低密度脂蛋白、极低密度脂蛋白和乳糜微粒受体的配基。既进行脂质代谢，也活化水解脂肪的酶类。
?APOE表型异常患者表现为脂质代谢疾病（高胆固醇症）、心脑血管病、高血压、肥胖、糖尿病、脑卒中和冠心病、神经再生退行性变（老年性痴呆）和免疫调节紊乱（桥本甲状腺功能低下和肿瘤易感）、它汀降脂类耐药及高血压耐药等。
?APOE基因在正常人群中呈多态性表现，即人群中有不同的APOE类型，导致人类发病种类和危险频率呈明显的差异性。
?APOE在同一基因座位有三个不同的等位基因（ε 2 ε 3 ε4）可编码成三个纯合子（ε2/2 ，ε3/3、ε4/4）和三个杂合子（ε2/3 、ε2/ 4 ε3/4 ），形成6种不同的基因型，从而表现出不同的致病状态。
?APOE的等位基因中ε 3 频度最高达60-80％，ε 4 的频度约10％，ε 2 频度小于10％，这正是人类检测APOE多态性的目的意义。
临床应用：
?预报老年性痴呆发病率可能概率，特别是家族性受检者。
?检查高脂血症发病和分型，治疗疗效和耐药。
?监测脑血管病复发性出血（脑梗塞）并作出警示性预报。
?监测冠心病发病状况。
?监测糖尿病和肾病发病状况。
?对原发性高血压可评估家族性发病，治疗耐药及内脏器质损害现象。
?对绝经和更年期妇女进行激素替代治疗。ε 2 基因者可使总胆固醇明显升高，故需事先检测APOE基因。
?评价妇女绝经期综合征。
?ε4/4 基因型者比ε3/4者老年痴呆尤其是血管型痴呆发病率更高，且发病年龄明显提前，程度加重，对治疗AD的他克林类药呈耐药性，并且是早发冠心病中年猝死的独立致病因子。缺血性心脑血管病（ICVD）也呈高发，对调脂的他汀类呈耐药性。ε4/4 基因型者Ⅳ型高脂血症明显增高并与高TC、LDL-C和APOB水平密切相关。
?ε3/4 基因型者是高胆固醇血症和遗传易感性高危因子，发生心肌梗塞的年龄提前，且老年性痴呆的发病率比非ε 4 者高3倍以上。高血压呈耐药性。
?ε2/4 基因型有中等量的脑复发出血梗塞率和糖尿病肾病综合症发生率。高血压呈一定耐药性。
?ε3/3 基因型者为缺血性脑血管病低发性保护因子，尚使保护性高密度脂蛋白呈高水平，故属优良的APOE基因型。但可在脑缺血脑梗塞患者中致复发致死性出血。高血压患者经适当药物保护可明显减少内脏器质病变。
?ε2/3 基因型老年痴呆发病率低，发病年龄晚，与长寿有关，属保护性基因型。但可发生缺血性脑病（ICVD）。妇女更年期后激素替代治疗时总胆固醇可明显升高。
?ε2/2 基因型者几乎均为Ⅲ型高脂血症，早期发生动脉硬化，但对心脏呈保护性，对糖尿病呈低发性，但有糖尿病的治疗性胰岛素抵抗。女性绝经激素替代治疗时总胆固醇明显升高。EGFR基因
?EGFR基因家族最常应用为Her1（受体酪氨酸激酶TK）和Her2（Cerb-B2）两类，其中EGFR-TK 调控癌细胞的浸润，分化，转移。
?近年来针对该基因的靶向药物Iressa（易瑞沙）和Tarciva（它西瓦）治疗非小细胞肺癌为首的上皮性肿瘤起到神奇的疗效。最关键的机理已经明确，当EGFR第18，19，21外显子发生各种突变时，易瑞沙疗效达90％以上,而没有化疗的毒副作用。
临床应用：
?各种非小细胞肺癌占肺癌发病率80％以上，尤其是在经过Ⅲ、Ⅳ期晚期癌症化疗后病人，转
移的病人，体弱的老年性病人；
?特别适合检测亚洲妇女肺腺癌和不吸烟者，突变率高达26-40％；各种恶性上皮性肿瘤如大肠癌，乳腺癌，前列腺癌，甲状腺癌，胃癌，食道癌，肝癌；
?体检发现EGFR基因突变，意味着机体细胞的增生/凋亡比例发生异常，需立即对机体相关器官进行医学检查和随访，比如提示子宫平滑肌瘤的增生。
c-kit基因
?C－kit基因t（8；21）（q22；q22）的慢粒患者有BCR/ABL融合基因疾病而受体酪氨酸激酶通路突变，主要是C-kit基因的第8外显子常发生突变及缺失。针对该类基因靶点的药物格列卫（Gleveev伊马替尼）可以修饰上述基因缺陷，也可抑制BCR/ABL融合基因肿瘤细胞。
?近来发现在抑制PDGF受体SCF（干细胞）和C－kit基因突变的其他肉瘤和胃肠间质瘤有明确的疗效，主要依赖于C-KIT基因的突变，因此疗效直接依赖基因测序的结果。
临床应用：
?胃肠道间质瘤的术前术后的单药治疗，该类肿瘤除了手术切除外，不能进行有效的化疗，而服用40ng/日的格列卫可达到良好的疗效；
?对胃肠道外的间质细胞肿瘤某些所谓的平滑肌瘤也有良好的疗效；
?对慢性粒细胞白血病（CML）的急变期，母化期和干扰素治疗失败后的慢粒患者，甚至某些骨髓纤维化的患者也有相当的疗效；
?对上述患者的恶性程度提高的恶性转化应用有效。
FV基因
?FV基因位于染色体1q21－25，全长为80Kb，包含25个外显子和24个内含子。
?FV的功能是多方面的，一方面通过参与构成凝血酶原复合物而促进凝血；另一方面通过APC 途径而抑制凝血。后者包括FV可直接被APC灭活以及FV参与APC对FⅧ的灭活两个方面。临床应用
?大手术病人，骨科手术病人，肿瘤病人，长期卧床病人和长途飞行者，如携带F5基因突变，易发生肺、脑梗死意外。
尿路肿瘤微卫星片段分析
?根据WHO尿路上皮癌诊断标准，按照遗传学稳定和不稳定把尿路癌分为浸润型和非浸润型，依据中国，日本等亚洲国家遗传学特点，设计了D9S283、D9S162、IFNA、D4S243、D17S695、D9S171、TGFbRⅡ，BA T25，BA T26微卫星位点，由Applied Biosystems公司合成并标记PET(红色)、FAM(蓝色)、VIC(绿色)或NED（黑色）。
临床意义
?可作为检测小便脱落细胞早期癌变，癌细胞治疗后复发，灌注化疗疗效评估等基因变化指标。
分子生物学的研究及发展
分子生物学的应用及发展 摘要：本文在文献检索的基础上，对分子生物学的发展简史，基本原理，研究领域等作了简单介绍，阐述了分子生物学在人们日常生活中的应用并结合药学专业着重讨论了其在药学及中药开发发面的应用，并进一步对分子生物学未来的研究技术、方向和前景做了展望。 一前言 生物以能够复制自己而区别于非生物。生命现象最基本的特征是进行“自我更新”。进行“自我更新”体现了一种最高级和最复杂的运动状态。这种运动就是生物机体从环境中摄取物质和能量，以更新本身的物质组成，而山现生长、繁殖，在这样的过程中保证了将自身的特征传给历代；同时也不断地向环境输送一些物质和释放能量。在生物机体的组成物质中，防水分外，有各种无机盐类和各种有机化合物。其中生物大分子——核酸和蛋白质在进行自我更新运动中，以其功能的重要性占第一位。为探索生命现象的本质问题，产生了分子生物学这一学科[1]。 分子生物学(molecular biology)是从分子水平研究生命本质为目的的一门新兴边缘学科，它是研究核酸、蛋白质等生物大分子的形态、结构特征及其重要性、规律性和相互关系的科学，是当前生命科学中发展最快并正在与其它学科广泛交叉与渗透的重要前沿领域[2]。 分子生物学的最终目标是远大的，从产生基本细胞行为类型的各种分子的角度，来理解这五类行为类型：生长、分裂、分化、运动和相互作用。即分子生物学力图完整地描述细胞大分子的结构、功能和相互联系，从而理解细胞为什么要采取这种方式[3]。 分子生物学作为一门新兴的边缘学科。它的迅速发展及其在整个生命科学领域的广泛渗透和应用，促使人们对生物学等生命科学的认识从细胞水平进入分子水平。在农业、畜牧、林业、微生物学等领域发展十分迅速，如转基因动植物等。在医学领域，为医学诊断、治疗及新的疫苗、新药物研制等开辟了新的途径，使医学科学中原有的学科发生分化组合，医学分子生物学等新的学科分支不断产生，使医学科学发生了深刻的变革，不认识到这一点就很难跟上科学发展的步伐。 分子生物学的发展为人类认识生命现象带来了前所未有的机会，也为人类利用和改造生物创造了极为广阔的前景。 二分子生物学发展简史 分子生物学的发展大致可分为三个阶段[4-7]：
分子生物学前沿技术
分子生物学前沿技术 The Standardization Office was revised on the afternoon of December 13, 2020
激光捕获显微切割Laser capture microdissection (LCM) technology是在不破坏组织结构，保存要捕获的细胞和其周围组织形态完整的前提下，直接从冰冻或石蜡包埋组织切片中获取目标细胞，通常用于从中精确地分离一个单一的细胞。 背景：机体组织包含有上百种不同的细胞，这些细胞各自与周围的细胞、基质、血管、腺体、炎症细胞或相互粘附。在正常或发育中的组织器官内，细胞内信号、相邻细胞的信号以及体液刺激作用于特定的细胞，使这些细胞表达不同的基因并且发生复杂的分子变化。在状态下，如果同一类型的细胞发生了相同的分子改变，则这种分子改变对于疾病的发生可能起着关键性的作用。然而，发生相同分子改变的细胞可能只占组织总体积的很小一部分；同时，研究的目标细胞往往被其它组织成分所环绕。为了对疾病发生过程中的组织损害进行分子水平分析，分离出纯净的目标细胞就显得非常必要。1996年，美国国立卫生院（NIH）国家肿瘤研究所的[2]开发出激光捕获显微切割技术（Laser capture microdissection ， LCM ），次年，美国Arcturus Engineering公司成功研制激光捕获显微切割系统，并实现商品化销售。应用该技术可以在显微镜直视下快速、准确获取所需的单一细胞亚群，甚至单个细胞，从而成功解决了组织中细胞异质性问题。这项技术现已成为美国“肿瘤基因组解剖计划”的一项支撑技术[1]。 原理：LCM的基本原理是通过一低能脉冲激活热塑膜———乙烯乙酸乙烯酯（ethylene vinylacetate，EVA）膜（其最大吸收峰接近
组织病理学技术
组织病理学技术 组织病理学技术 一. 实验综述 组织病理学切片技术是融解剖学、组织胚胎学及技术、病理学及技术和临床于一体的综合性课程。是一门新兴的学科。在当今不断发展、变革的社会中，在学科相互融合，知识相互渗透，技术不断发展、概念不断更新的时代，在时代要求综合素质人才辈出的今天，组织病理学切片技术的兴起尤为必要和重要。主要任务是：使学生获得和掌握学会观察人体重要器官的解剖学特征、组织学结构、病理学变化并联系相关功能，从而在形态上观察、机能上分析、综合上判断和科学上研究疾病。同时联系病变器官的代谢和机能的改变，探讨疾病的病因、发病机制以及病理变化与临床表现的内在联系和相互的关系。为由基础走向临床打下坚实的基础。 二. 实验目的 1. 掌握病理组织切片的基本制作过程步骤 2. 掌握病变器官的代谢和机能的改变 3. 明白病理组织切片制作过程中的注意事项 4. 了解病理切片的制作程序及仪器的操作和注意事项 二.实验材料 1. 实验材料：手术盘、镊子、手术刀、石蜡、小鼠病理组织、纱布、烧杯、脱水机、塑料包埋盒、水浴锅、切片机、染色机、载玻片、盖玻片、铅笔、标签 2. 实验试剂：福尔马林、酒精（50% 55% 70% 75% 80% 85% 95% 无水浓度）、二甲苯、苏木素、盐酸酒精、伊红染液、树胶 四.实验步骤 （一）取材 从尸体解剖材料或临床手术切除的待检材料上选取供作切片标本的病理组织切块，称为取材。 1. 取材要全面具有代表性，能显示病变的发展过程。为此要选取病变显著的区域和可疑 灶，在统一组织块中最好包括病灶及其周围的健康组织，并应包含该器官的主要结构部分。较大而重要的病变可从病灶中心到外周的不同部位取材，以反映病变各阶段的形态学变化。
第十五期分子生物学常用技术与研究进展学习班
第十五期分子生物学常用技术与研究进展学习班 分子生物学实验技术是当今生命科学领域应用最广泛和最重要的手段之一，为推广分子生物学实验技术，满足临床医技人员、教学科研人员、在读研究生及其它有需要人员的要求，北京市理化分析测试中心已举办了十四期“分子生物学常用技术与研究进展学习班”，并得到了全体学员的一致好评。应广大学员的强烈要求，理化中心将于2016年11月19日至11月22日在北京开办本年度唯一一期分子生物学常用技术学习班，欢迎各位学员前来参加。本期学习班包括理论讲座与实验操作两部分内容，力求使每位学员在4天时间内都能学有所值、学有所用。 一、培训单位： 主办单位：北京市理化分析测试中心 协办单位：华斯泰生物医学科技有限公司 二、培训日程：
三、培训安排 时间：2016年11月19日-22日 地点：北京市海淀区永丰产业基地丰贤中路7号孵化楼B座四层 报到：北京康复瑞假日酒店西山店2016年11月18日14:00-18:00
四、住宿安排 1、交通、住宿、午餐及晚餐费用自理。如需会务组预定午餐，请各位学员在回执表内注明（午餐均为快餐，发票均为手撕发票）。 2、酒店预订：会务组协助提供协议酒店，但培训人员需自行预定，预定时请说明“百欧美生公司预定”即可享受协议价。 协议酒店：北京康福瑞假日酒店西山店（北京市海淀区北青路与永丰路交叉口往南800米路东），房间优惠价：单人间298元/天/间，双人标准间380元/天/间，均含早餐，电话：。 五、注册方式 1、报名时间 报名从即日起至2016年11月14日截止。为了保证教学质量，本次培训班限额40人，招满为止。 2、注册费 共计3200元/人，同一单位两人以上参会优惠至3000元/人。 3、缴费方式（电子汇款） 账户名称：北京市理化分析测试中心 账户号： 开户行：工商行紫竹院支行 汇款用途处务必请标明：学员姓名+分子培训班 4、联系人 姓名：马老师联系电话： E-mail：网站： 报名者请填写以下回执，并于2016年11月14日前E-mail至联系人邮箱。如有其它需要，请在备注中说明。
病理学技术考点总结
酶组织细胞化学技术 酶组织化学技术的基本原理及方法 1、金属沉淀反应，如硫代胆碱铜法，可证明胆碱酯酶和酯酶； 2、藕联偶氮色素法 3、色素形成与染色法 一碱性磷酸酶（AKP） AKP最适宜PH值为9.2-9.4，可被金属阳离子或某些氨基酸激活，多见于活跃的部位，如小动脉、肾小管上皮等。 ?AKP染色方法: 1、Gomri钙钴法：AKP为黑色 注意事项：此法对含铁血黄素和钙盐也可形成棕黑色沉淀，必要时应予以鉴别。并且用于透明的二甲苯为AR级别。 2、Gossrau偶氮吲哚酚法：酶活性部位呈暗褐色（坚牢蓝VB）、浅红色（坚牢蓝BB）、蓝色（坚牢紫B） 二酸性磷酸酶（ACP） ACP前列腺活性最强，在肝脏内毛细胆管旁活性最强。 ?ACP染色方法: 1、Berry硝酸铅法：ACP为棕黑色，特异性抑制酶是氟化钠。 2、Leder-Stutt改良萘酚AS-TR磷酸酯法：ACP为红色。 三三磷酸腺苷酶（ATP） ATP分为三类：膜性ATP、肌球蛋白ATP、线粒体ATP，以上三种酶不可用甲醛固定，用冷冻法。 ?ATP染色方法： 1、Wachstein-Meisel镁激活酶法：ATP为棕黑色。 2、Dubowitz-Brooke钙激活酶法：ATP为棕黑色。 注意事项：镁激活的ATP正常肝定位于毛细胆管；钙激活ATP区分于红肌纤维和白肌纤维有意义，对于区分神经性肌萎缩和肌源性肌萎缩有价值。
四胆碱酯酶（CHE） 广义胆碱酯酶分为胆碱酯酶和乙酰胆碱酯酶，胆碱酯酶的活性中心是丝氨酸，主要分布于血浆、胰腺和唾液腺；乙酰胆碱酯酶主要分布于神经肌肉接头等处。 CHE染色法 1、Snell-Garrett胆碱铜法：CHE呈黄色或棕黄色。 2、Karnovsky-Roots铁氰化铜法：CHE呈红棕色或深棕色。
组织病理学技术
组织病理学技术 一．实验综述 组织病理学切片技术是融解剖学、组织胚胎学及技术、病理学及技术和临床于一体的综合性课程。是一门新兴的学科。在当今不断发展、变革的社会中，在学科相互融合，知识相互渗透，技术不断发展、概念不断更新的时代，在时代要求综合素质人才辈出的今天，组织病理学切片技术的兴起尤为必要和重要。主要任务是：使学生获得和掌握学会观察人体重要器官的解剖学特征、组织学结构、病理学变化并联系相关功能，从而在形态上观察、机能上分析、综合上判断和科学上研究疾病。同时联系病变器官的代谢和机能的改变，探讨疾病的病因、发病机制以及病理变化与临床表现的内在联系和相互的关系。为由基础走向临床打下坚实的基础。 二．实验目的 1.掌握病理组织切片的基本制作过程步骤 2.掌握病变器官的代谢和机能的改变 3.明白病理组织切片制作过程中的注意事项 4.了解病理切片的制作程序及仪器的操作和注意事项 二．实验材料 1.实验材料：手术盘、镊子、手术刀、石蜡、小鼠病理组织、纱布、烧杯、脱水机、塑料包埋盒、水浴锅、切片机、染色机、载玻片、盖玻片、铅笔、标签 2.实验试剂：福尔马林、酒精（50%、55%、70%、75%、80%、85%、95%、无水浓度）、二甲苯、苏木素、盐酸酒精、伊红染液、树胶 四．实验步骤 （一）取材 从尸体解剖材料或临床手术切除的待检材料上选取供作切片标本的病理组织切块，称为取材。 1.取材要全面具有代表性，能显示病变的发展过程。为此要选取病变显著的区 域和可疑灶，在统一组织块中最好包括病灶及其周围的健康组织，并应包含该器官的主要结构部分。较大而重要的病变可从病灶中心到外周的不同部位取材，以反映病变各阶段的形态学变化。 2.取材时要尽量保持组织的自然状态与完整性，避免认为变化。为此，切取组 织块的剪刀要锋利，切取时勿使组织受挤压、拉扯胡揉搓。 3.组织块的大小要适当，通常其长、宽、厚以1.5×1×0.4cm为宜，必要时可 增大到2×1.5×0.5cm，以便于固定液迅速浸透。尸体剖检时采取病理组织块可切得稍大些，待固定几小时后在家以修整，切到适当的大小。 4.对于特殊病灶要做适当标记。 5.注意避免类似的组织块混淆。 6.制片的组织块，越新鲜越好。 7.接受送检标本时，须依据送检单详细检查送检物。 （二）固定和固定液 将组织浸在固定液内，使细胞组织内的物质成为不溶性，让固有形态和结构得以保存叫作固定。固定是为了保持组织、细胞与生活时的形态相似。 1. 本次试验的固定液为：10%福尔马林液（实验室常用固定液） 福尔马林 100ml 自来水 900ml
分子生物学主要研究内容
分子生物学主要研究内容 1. 核酸的分子生物学。 核酸的分子生物学研究 核酸的结构及其功能。由于 核酸的主要作用是携带和传 递遗传信息，因此分子遗传 学是其主要组成部分。由于 50年代以来的迅速发展，该 领域已形成了比较完整的理 论体系和研究技术，是目前分子生物学内容最丰富的一个领域。研究内容包括核酸/基因组的结构、遗传信息的复制、转录与翻译，核酸存储的信息修复与突变，基因表达调控和基因工程技术的发展和应用等。遗传信息传递的中心法则是其理论体系的核心。 2. 蛋白质的分子生物学。 蛋白质的分子生物学研究执行各种生命功能的主要大分子──蛋白质的结构与功能。尽管人类对蛋白质的研究比对核酸研究的历史要长得多，但由于其研究难度较大，与核酸分子生物学相比发展较慢。近年来虽然在认识蛋白质的结构及其与功能关系方面取得了一些进展，但是对其基本规律的认识尚缺乏突破性的进展。 3.细胞信号转导的分子生物学。 细胞信号转导的分子生物学研究细胞内、细胞间信息传递的分子基础。构成生物体的每一个细胞的分裂与分化及其它各种功能的完成均依赖于外界环境所赋予的各种指示信号。在这些外源信号的刺激下，细胞可以将这些信号转变为一系列的生物化学变化，例如蛋白质构象的转变、蛋白质分子的磷酸化以及蛋白与蛋白相互作用的变化等，从而使其增殖、分化及分泌状态等发生改变以适应内外环境的需要。信号转导研究的目标是阐明这些变化的分子机理，明确每一种信号转导与传递的途径及参与该途径的所有分子的作用和调节方式以及认识各种途径间的网络控制系统。信号转导机理的研究在理论和技术方面与上述核酸及蛋白质分子有着紧密的联系，是当前分子生物学发展最迅速的领域之一。 4.癌基因与抑癌基因、肽类生长因子、细胞周期及其调控的分子机理等。 从基因调控的角度研究细胞癌变也已经取得不少进展。分子生物学将为人类最终征服癌症做出重要的贡献。
分子生物学前沿技术
激光捕获显微切割Laser capture microdissection (LCM) technology是在不破坏组织结构，保存要捕获的细胞和其周围组织形态完整的前提下，直接从冰冻或石蜡包埋组织切片中获取目标细胞，通常用于从组织中精确地分离一个单一的细胞。 背景：机体组织包含有上百种不同的细胞，这些细胞各自与周围的细胞、基质、血管、腺体、炎症细胞或免疫细胞相互粘附。在正常或发育中的组织器官内，细胞内信号、相邻细胞的信号以及体液刺激作用于特定的细胞，使这些细胞表达不同的基因并且发生复杂的分子变化。在病理状态下，如果同一类型的细胞发生了相同的分子改变，则这种分子改变对于疾病的发生可能起着关键性的作用。然而，发生相同分子改变的细胞可能只占组织总体积的很小一部分；同时，研究的目标细胞往往被其它组织成分所环绕。为了对疾病发生过程中的组织损害进行分子水平分析，分离出纯净的目标细胞就显得非常必要。1996年，美国国立卫生院（NIH）国家肿瘤研究所的[2]开发出激光捕获显微切割技术（Laser capture microdissection ，LCM ），次年，美国Arcturus Engineering公司成功研制激光捕获显微切割系统，并实现商品化销售。应用该技术可以在显微镜直视下快速、准确获取所需的单一细胞亚群，甚至单个细胞，从而成功解决了组织中细胞异质性问题。这项技术现已成为美国“肿瘤基因组解剖计划”的一项支撑技术[1]。 原理：LCM的基本原理是通过一低能红外激光脉冲激活热塑膜———乙烯乙酸乙烯酯（ethylene vinylacetate，EVA）膜（其最大吸收峰
接近红外激光波长），在直视下选择性地将目标细胞或组织碎片粘到该膜上[2]。LCM 系统包括倒置显微镜、固态红外激光二极管、激光控制装置、控制显微镜载物台（固定载玻片）的操纵杆、电耦合相机及彩色显示器。用于捕获目标细胞的热塑膜直径通常为6mm，覆在透明的塑料帽上，后者恰与后继实验所用的标准 0.5ml离心管相匹配。 机械臂悬挂控制覆有热塑膜的塑料帽，放到脱水组织切片上的目标部位。显微镜直视下选择目标细胞，发射激光脉冲，瞬间升温使EVA膜局部熔化。熔化的EVA膜渗透到切片上极微小的组织间隙中，并在几毫秒内迅速凝固。组织与膜的粘合力超过了其与载玻片间的粘合力，从而可以选择性地转移目标细胞。激光脉冲通常持续0.5~5.0毫秒，并且可在整个塑料帽表面进行多次重复，从而可以迅速分离大量的目标细胞。将塑料帽盖在装有缓冲液的离心管上，将所选择的细胞转移至离心管中，从而可以分离出感兴趣的分子进行实验[3]。 EVA膜约100~200μm厚，能够吸收激光产生的绝大部分能量，在瞬间将激光束照射区域的温度提高到90°C，保持数毫秒后又迅速冷却，保证了生物大分子不受损害。采用低能量红外激光的同时也可避免损伤性光化学反应的发生。 优缺点：LCM最显著的优点在于其迅速、准确和多用途的特性。结合组织结构特点以及所需的切割精确度，通过选择激光束的直径大小，可以迅速获取大量的目标细胞。LCM与以显微操作仪为基础的显微切割技术相比[4]，具有以下优点：(1)分离细胞速度快，无需精巧的操作技能；(2)捕获细胞和剩余组织的形态学特征均保持完好，可以较
组织病理学技术
组织病理学技术
组织病理学技术 一．实验综述 组织病理学切片技术是融解剖学、组织胚胎学及技术、病理学及技术和临床于一体的综合性课程。是一门新兴的学科。在当今不断发展、变革的社会中，在学科相互融合，知识相互渗透，技术不断发展、概念不断更新的时代，在时代要求综合素质人才辈出的今天，组织病理学切片技术的兴起尤为必要和重要。主要任务是：使学生获得和掌握学会观察人体重要器官的解剖学特征、组织学结构、病理学变化并联系相关功能，从而在形态上观察、机能上分析、综合上判断和科学上研究疾病。同时联系病变器官的代谢和机能的改变，探讨疾病的病因、发病机制以及病理变化与临床表现的内在联系和相互的关系。为由基础走向临床打下坚实的基础。 二．实验目的 1.掌握病理组织切片的基本制作过程步骤 2.掌握病变器官的代谢和机能的改变 3.明白病理组织切片制作过程中的注意事项 4.了解病理切片的制作程序及仪器的操作和注意事项 二．实验材料 1.实验材料：手术盘、镊子、手术刀、石蜡、小鼠病理组织、纱布、烧杯、脱水机、塑料包埋盒、水浴锅、切片机、染色机、载玻片、盖玻片、铅笔、标签 2.实验试剂：福尔马林、酒精（50%、55%、70%、75%、80%、85%、95%、无水浓度）、二甲苯、苏木素、盐酸酒精、伊红染液、树胶 四．实验步骤 （一）取材 从尸体解剖材料或临床手术切除的待检材料上选取供作切片标本的病理组织切块，称为取材。 1.取材要全面具有代表性，能显示病变的发展过程。为此要选取病变显著的区 域和可疑灶，在统一组织块中最好包括病灶及其周围的健康组织，并应包含该器官的主要结构部分。较大而重要的病变可从病灶中心到外周的不同部位取材，以反映病变各阶段的形态学变化。 2.取材时要尽量保持组织的自然状态与完整性，避免认为变化。为此，切取组 织块的剪刀要锋利，切取时勿使组织受挤压、拉扯胡揉搓。 3.组织块的大小要适当，通常其长、宽、厚以1.5×1×0.4cm为宜，必要时可 增大到2×1.5×0.5cm，以便于固定液迅速浸透。尸体剖检时采取病理组织块可切得稍大些，待固定几小时后在家以修整，切到适当的大小。 4.对于特殊病灶要做适当标记。 5.注意避免类似的组织块混淆。 6.制片的组织块，越新鲜越好。 7.接受送检标本时，须依据送检单详细检查送检物。 （二）固定和固定液 将组织浸在固定液内，使细胞组织内的物质成为不溶性，让固有形态和结构得以保存叫作固定。固定是为了保持组织、细胞与生活时的形态相似。 1. 本次试验的固定液为：10%福尔马林液（实验室常用固定液） 福尔马林 100ml 自来水 900ml
分子生物学技术的发展对现代生命科学的影响
分子生物学技术的发展对现代生命科学的影响 浅谈PCR技术和克隆技术在遗传疾病诊断中的应用 姓名：李建飞 专业：植物学 学号：S110916 指导教师：周宜君
分子生物学技术的发展对现代生物科学发展的影响 分子生物学（molecular biology）是从分子水平上研究生命现象物质基础的学科。研究细胞成分的物理、化学的性质和变化以及这些性质和变化与生命现象的关系，如遗传信息的传递，基因的结构、复制、转录、翻译、表达调控和表达产物的生理功能，以及细胞信号的转导等。[1]分子生物学技术就是以分子生物学为基本知识基础，结合现代技术以研究分子水平变化的新技术，其中包括基因克隆，real-timePCR，转基因技术，SNP分析技术，RSLP分析技术，RACE技术，双向电泳技术（IEF和SDS-PAGE），质谱分析技术，western blotting，原位杂交技术，基因芯片，蛋白质组芯片，酵母单杂交、酵母双杂交技术，以及近几年来发展起来的生物信息学分析和RNAi技术。分子生物学技术发展日新月异，该技术的发展已经在整个生物学领域占据了主导作用，相关技术的应用已经成为推动相关学科发展的必要手段。分子生物学技术能有今天的地位也是取决于它研究对象的基础性和根本性。下面将谈谈分子生物学技术在现代生物科学发展的具体影响。 遗传疾病从分子水平解释,究其根源是由于与正常个体的遗传分子相比,患有遗传疾病个体的遗传物质发生了DNA序列或染色体片段上的改变。这种遗传物质上的异常在向后代传递时遵循孟德尔遗传规律而可遗传给下一代。具体讲,较常见的突变情况有如下几种:(1)染色体某个区域的缺失；(2)某个基因的部分外显子或内含子的缺失；(3)基因的单碱基突变；(4)三核苷酸重复突变；(5)基因的一部分重复转录,而导致基因产物大小的改变；(6)插入突变,从基因组其他部位的DNA片段插入到目的DNA序列内；(7)线粒体基因组的突变[2～5]。 应用分子生物学技术检测遗传疾病,又称遗传疾病基因诊断,是在分子水平上对核苷酸序列的突变进行检测,以在遗传物质的分子水平揭示疾病的发病机理和发病根源。分子生物学技术在人类遗传疾病诊断中的应用是近年来分子生物学理论和技术手段不断发展和成熟并在社会生活中逐步运用、普及的结果。一般来讲,遗传疾病的分子突变机制都比较复杂,往往包括上述的两种或两种以上的情况,如导致新生儿失盐症的212羟化酶缺乏症,可由于212羟化酶基因(P450c21) 发生缺失或基因易位插入所致[6]；杜氏肌营养不良症(Duchenne muscular dystrophy,DMD)是由于抗肌萎缩蛋白(dystrophin)基因的部分缺失和重复造成
分子生物学前沿技术培训资料
分子生物学前沿技术
激光捕获显微切割Laser capture microdissection (LCM) technology是在不破坏组织结构，保存要捕获的细胞和其周围组织形态完整的前提下，直接从冰冻或石蜡包埋组织切片中获取目标细胞，通常用于从组织中精确地分离一个单一的细胞。 背景：机体组织包含有上百种不同的细胞，这些细胞各自与周围的细胞、基质、血管、腺体、炎症细胞或免疫细胞相互粘附。在正常或发育中的组织器官内，细胞内信号、相邻细胞的信号以及体液刺激作用于特定的细胞，使这些细胞表达不同的基因并且发生复杂的分子变化。在病理状态下，如果同一类型的细胞发生了相同的分子改变，则这种分子改变对于疾病的发生可能起着关键性的作用。然而，发生相同分子改变的细胞可能只占组织总体积的很小一部分；同时，研究的目标细胞往往被其它组织成分所环绕。为了对疾病发生过程中的组织损害进行分子水平分析，分离出纯净的目标细胞就显得非常必要。1996年，美国国立卫生院（NIH）国家肿瘤研究所的[2]开发出激光捕获显微切割技术（Laser capture microdissection ，LCM ），次年，美国Arcturus Engineering公司成功研制激光捕获显微切割系统，并实现商品化销售。应用该技术可以在显微镜直视下快速、准确获取所需的单一细胞亚群，甚至单个细胞，从而成功解决了组织中细胞异质性问题。这项技术现已成为美国“肿瘤基因组解剖计划”的一项支撑技术[1]。 原理：LCM的基本原理是通过一低能红外激光脉冲激活热塑膜———乙烯乙酸乙烯酯（ethylene vinylacetate，EVA）膜（其最大吸
分子病理诊断实验室建设指南(试行
分子病理诊断实验室建设指南(试行
分子病理诊断实验室建设指南（试行） 2015-09-07 来源：中华病理学杂志编辑：hanhongwei 导读 随着疾病个体化治疗的发展，分子病理诊断已越来越多地应用于临床。 中华医学会病理学分会中国医师协会病理科医师分会中国抗癌协会肿瘤病理专业委员会国家卫生和计划生育委员会病理质量控制与评价中心全国分 子病理指导委员会 随着疾病个体化治疗的发展，分子病理诊断已越来越多地应用于临床。分子病理诊断主要是指基于疾病组织和细胞等标本的分子遗传学检测，用于协助病理诊断和分型、指导靶向治疗、预测治疗反应及判断预后等。分子病理诊断实验室的规范化建设包括实验室的设置和管理、人员、项目和试剂的准入、质量保证和质量控制体系的建立等多个方面，是准确实施分子病理诊断的关键环节，目前国内这一领域尚处于起步阶段，缺乏相应的准入要求。为保证我国临床分子病理诊断的质量，中华医学会病理学分会、中国医师协会病理科医师分会、中国抗癌协会肿瘤病理专业委员会、国家卫生和计划生育委员会病理质量控制与评价中心、全国分子病理指导委员会联合制订分子病理诊断实验室建设指南。 一、总则 １畅本指南根据枟医疗机构管理条例枠枟医疗机构临床实验室管理办法枠枟医疗机构临床基因扩增检验实验室管理办法枠枟医疗技术临床应用管理办法枠和卫生部枟病理科建设与管理指南（试行）枠等［１-６］文件制定。 ２畅医疗机构应当统一管理分子病理检测项目，在规范的分子病理诊断实验室进行检测。 ３畅以科研为目的的检测项目不得向临床出具检测报告，不得向患者收取任何费用，不得作为临床诊治的依据。 二、医院准入 三级甲等医院病理科应设置分子病理诊断实验室，符合条件的其他医院也可设置。 三、人员准入
最新A肿瘤分子病理学1汇总
A肿瘤分子病理学1
一：肿瘤分子病理学 肿瘤发病的相关因素 内源性因素：机体的免疫状态、遗传素质、激素水平及DNA损伤修复能力 外源性因素：与自然环境和生活条件密切相关，包括化学因素、物理因素及感染因素等 三大类基因与肿瘤形成有关 癌基因 oncogene 抑癌基因 suppressor gene DNA修复基因 DNA repair gene 原癌基因、癌基因与抑癌基因:是指一组对细胞生长、分化或恶变等细胞增生动力学具有正负调节功能的基因群 . 原癌基因：指存在于正常细胞内，编码促进细胞生长物质的基因序列，是正常细胞基因组中不可缺少的一部分，与恶性肿瘤并无必然的联系 癌基因：由原癌基因衍生而来的具有转化细胞能力的基因，是细胞中发生变异的一类基因 癌基因过度表达：是指癌基因编码的mRNA的数量增加 癌基因产物过度表达：是指癌基因编码的蛋白质即癌蛋白的表达量过度增加 癌基因扩增：是指与原癌基因结构相同的基因拷贝数复制增多 癌基因扩增、癌基因过表达和癌基因产物过表达是表述癌基因在DNA、mRNA及蛋白质三个水平上改变的用语 癌基因活化方式－点突变(point mutation) 导致癌基因活化的主要方式
◆是指原癌基因编码顺序的特定位置上某一个核苷酸发生了改变，使其表 达的蛋白质上相应的一个氨基酸也发生变化 ◆结果：改变蛋白质的关键功能使细胞生长异常或发生癌变。 癌基因活化方式－基因扩增(amplification) ◆指原癌基因通过某些机理在原来染色体上复制形成多个拷贝 ◆原因：由于基因DNA过度复制所致。超过正常原癌基因拷贝数的增加 会导致癌蛋白量的增多，从而导致正常细胞功能的紊乱 ◆基因扩增程度与肿瘤恶性程度有关，基因大量扩增的患者生存期缩短， 容易发生肿瘤转移 癌基因活化方式－癌基因甲基化改变 ◆DNA甲基化状态的改变可导致基因结构和功能的异常，是细胞癌变过程 中重要的一步 ◆癌基因(H-Ras、C-Myc)低甲基化和抑癌基因(Rb、p16)的高甲基化改变 是细胞癌变的一个重要特征 ◆癌基因DNA甲基化水平愈低，其肿瘤浸润能力愈强，临床分期也愈 晚。反之，抑癌基因甲基化水平越高，组织越易发生癌变 癌基因活化方式---基因过量表达 ◆基因表达包括基因的转录与翻译及其调控,基因的转录在细胞核内进行 （DNA－mRNA），翻译在细胞浆内进行（mRNA－蛋白质） ◆约15%人类基因可以进行表达，基因表达水平的改变是细胞癌变的早期 事件
分子生物学技术在食品工业中的最新研究进展
分子生物学技术在食品工业中的最新研究进展 0引言 了解食品中的微生物群落组成以及不同微生物种群之间的相互作用，对于生产出安全和高品质的食品是非常重要的。食品生产过程中相关微生物的研究通常采用培养的方法，但这种方法存在很大的局限性：①富集培养大多具有选择作用，导致不能分离出具有重要生态学作用、数量相对较少的种群，不能定量研究微生物种群的动态变化；②受到食品环境胁迫或受损的微生物细胞，通常需要特殊的培养条件才能恢复生长，导致其难以被分离。大量的研究表明，传统的微生物学培养分析方法，获得的可培养微生物种群只占微生物总量的0.1%-5%。尽管对于微生物群落结构相对简单的食品来说（如发酵食品），可培养的微生物一般占有优势，但Ampeul认为，至少有25%～50%的微生物种群不能被培养。这种缺陷促进了以聚合酶链反应(PGR)技术为基础的分子免培养方法和核酸检测技术在食品微生物研究中的应用和发展。与常规培养方法相比，分子生物学技术具有快捷、灵敏、准确等优点，而且具有更高的特异性，能够更加精确地研究生态系统中的微生物多样性及其群落组成。 微生物学家已经认识到研究微生物生态学概念和理论，对于了解食品中微生物的繁殖与生长非常重要。譬如研究微生物群落组成能够更好地了解奶酪、酸奶、香肠、葡萄酒、面包等食品的风味组成以及微生物对其储藏品质的影响；密切监测食品生产过程中微生物群落的动态变化，能够更好地了解和控制食品加工和后熟过程中的微生物作用；可以快速、准确地监测食品中可能存在病原微生物，以加强食品生产过程中的安全性等。因此，在种、菌株水平上，对食品环境中微生
物的准确监测和可靠鉴定以及微生物群落组成、动态变化的生态学研究，有助于保证食品的质量安全。与土壤、水环境等生态系统的研究相比，到目前为止，用于食品加工过程中微生物研究的分子生态学的方法还相对较少，目前使用最多的是变性梯度凝胶电泳技术。尽管如此，这些方法在食品工业中（尤其在发酵食品中）正逐渐被使用。中国的传统发酵食品行业历史悠久，品种多样，如食醋、酱油、白酒、黄酒、豆豉、腐乳、酸菜、乳酪以及发酵肉制品等。传统发酵食品工艺多为天然发酵，其微生物群落结构比较复杂，产品风味具有明显的地域性。传统的发酵行业对酿造工艺过程中的微生物群落动态变化、风味及功能性物质的形成和累积机制的研究明显滞后，对传统发酵工艺的机制缺乏深入了解。以天然的复杂菌种混合发酵工艺为主的绝大多数企业，其生产质量控制主要靠工程技术人员长期工作积累的经验来判断，难以对发酵产品品质进行稳定的控制。分子生态学技术能够对发酵过程进行定量监控，通过检测发酵过程中微生物群落的组成结构、种群动态变化情况，有助于从整体上进行全面的分析，深入认识微生物的发酵机制，并为监控和调整发酵过程奠定基础。 1 目标基因的选择 自20世纪80年代中期以来，PCR技术已成为科学家们用来研究微生物群落结构及多样性的最主要工具。一般而言，以DNA为模板，利用通用引物通过PCR 反应扩增目标基因，产生的基因序列大小相同，因此需要依据基因序列的差异来区分不同的微生物。所以，分子生态学研究的关键步骤就是选择合适的目标基因。合适的目标基因既要有保守区段，又要有可变区段。可变区段可以在不同的分类水平上区别微生物，保守区段位于可变区段两侧，用来作为引物复性结合的位点进行PCR。如果没有高度保守区域，较低保守程度的区段也可作为简单引物退火
(完整版)分子生物学习题与答案
第0 章绪论 一、名词解释 1 .分子生物学 2 .单克隆抗体 二、填空 1．分子生物学的研究内容主要包含（）、（ ）、 （）三部分。 三、是非题 1、20 世纪60 年代，Nirenberg 建立了大肠杆菌无细胞蛋白合成体系。研究结果 发现poly（U）指导了多聚苯丙氨酸的合成，poly（G）指导甘氨酸的合成。（×） 四、简答题 1. 分子生物学的概念是什么？ 2. 你对现代分子生物学的含义和包括的研究范围是怎么理解的？ 3. 分子生物学研究内容有哪些方面？ 4. 分子生物学发展前景如何？ 5. 人类基因组计划完成的社会意义和科学意义是什么？ 6．简述分子生物学发展史中的三大理论发现和三大技术发明。 7. 简述分子生物学的发展历程。 8. 二十一世纪生物学的新热点及领域是什么？ 9. 21 世纪是生命科学的世纪。20 世纪后叶分子生物学的突破性成就，使生命科 学在自然科学中的位置起了革命性的变化。试阐述分子生物学研究领域的三大基 本原则，三大支撑学科和研究的三大主要领域？
答案： 一、名词解释 1 .分子生物学：分子生物学就是研究生物大分子之间相互关系和作用的一门学 科，而生物大分子主要是指基因和蛋白质两大类；分子生物学以遗传学、生物化 学、细胞生物学等学科为基础，从分子水平上对生物体的多种生命现象进行研究。 2 .单克隆抗体：只针对单一抗原决定簇起作用的抗体。 二、填空 1. 结构分子生物学，基因表达与调控，DNA 重组技术 三、是非题 四、简答题 1. 分子生物学的概念是什么？ 答案： 有人把它定义得很广：从分子的形式来研究生物现象的学科。但是这个定义 使分子生物学难以和生物化学区分开来。另一个定义要严格一些，因此更加有用： 从分子水平来研究基因结构和功能。从分子角度来解释基因的结构和活性是本书 的主要内容。 2. 你对现代分子生物学的含义和包括的研究范围是怎么理解的？ 分子生物学是从分子水平研究生命本质的一门新兴边缘学科，它以核酸和蛋白质 等生物大分子的结构及其在遗传信息和细胞信息传递中的作用为研究对象，是当 前生命科学中发展最快并正在与其它学科广泛交叉与渗透的重要前沿
分子病理学教学大纲
《分子病理学》教学大纲 总学时：80 理论课学时：48实验课学时：32学分：4 一、课程的性质 学科基础课，视专业不同可定为必修课或选修课。 二、课程的目的与教学基本要求 分子病理学是转化医学前沿的一门综合性学科，它融合现代分子生物学，生物化学，细胞生物学，遗传学，免疫学及传统病理学，为疾病发生机理，诊断和治疗，以及新药研发和新的临床干预提供理论基础和实质性指导作用。经典病理学主要通过对疾病的病因，病变过程中组织、器官的形态和功能的改变进行分析，探讨疾病的发生发展的机理，并对疾病作出诊断。分子病理学致力于探讨疾病发生过程中细胞和分子水平的亚微观变化，揭示疾病发生的根本机制。 教学目的和任务通过本课程教学，使学生温习串联其它基础生物学科的知识，锻炼灵活应用知识的能力，了解前沿动态。认识疾病及其愈复过程中细胞之间和分子之间的相互作用以及其主要研究方法，对重大和常见疾病的发生机制在分子和信息传导通路上有深入理解，为今后研究生阶段开展生物医学课题打下良好的基础。 三、课程适用专业 理工科本科生物学，生物化学及生物工程应用等相关专业。 四、课程的教学内容、要求与学时分配 授课学时共计80学时，其中理论课48学时，实验课32学时。 （一）信息传递与疾病(重点)（12学时） 1.基因突变，基因协同调控与疾病发生 2.细胞行为和信息传导与疾病发生 3.蛋白质修饰，转运和降解与疾病发生 4.代谢调控与肥胖症的分子基础 （二）炎症，疼痛和炎症介质（4学时） 1. 炎症介质作用及分子调节机制 2. 炎症导致的常见并发症的病理基础和治疗策略 （三）器官纤维化的分子机制（4学时） 1．器官纤维化的分子病理过程 2．器官纤维化逆转的分子病理过程 （四）细胞微环境，离子通道与疾病发生(难点)（4学时） 1.癫痫病人诱导多能干细胞向神经元分化的离子通道的研究 2. 流感M2离子通道的分子结构研究及抗流感新药的研发
分子生物学在医药中的研究进展及应用
分子生物学在医药中的研究进展及应用 ——韩静静 摘要 分子生物学是对生物在分子层次上的研究。这是一门生物学和化学之间跨学科的研究，其研究领域涵盖了遗传学、生物化学和生物物理学等学科。分子生物学主要致力于对细胞中不同系统之间相互作用的理解，包括DNA，RNA和蛋白质生物合成之间的关系以及了解它们之间的相互作用是如何被调控的。分子生物学主要研究遗传物质的复制、转录和翻译进程中的分子基础。分子生物学的中心法则认为“DNA 制造 RNA，RNA 制造蛋白质，蛋白质反过来协助前两项流程，并协助 DNA 自我复制”。 分子生物技术也称之为生物工程，是现代生物技术的主要标志，它是以基因重组技术和细胞融合技术为基础，利用生物体或者生物组织、细胞及其组分的特性和功能，设计构建具有预期性状的新物种或新品种．以便与工程原理相结台进行生产加工．为社会提供商品和服务的一个综合性技术体系，其内容包括基因工程技术、细胞工程技术、DNA测序技术、DNA芯片技术、酶工程技术等。现代分子生物技术的诞生以70年代DNA重组技术和淋巴细胞杂交瘤技术的发明和应用为标志．迄今已走过了30多年的发展历程。实践证明在解决人类面临的粮食、健康、环境和能源等重大问题方面开辟了无限广阔的前景。受到了各国政府和企业界的广泛关注。是21世纪高新技术产业的先导。 二十世纪生物医学发展的主要特点之一是对生命现象和疾病本质的认识逐渐向分子水平深入。DNA双螺旋结构的发现为分子医学和基因医学的发展奠定了基础。人们逐渐认识到，无论健康或疾病状态都是生物分子及其相互作用的结果，生物分子中起关键性作用者为基因及其表达产物蛋白质，因此从本质上说，所有的疾病都可以被认为是“基因病”。近十年来，分子生物技术已成为医学领域最有力的研究工具，以下从基因工程技术、人类基因组计划与核酸序列测定技术、基因诊断与基因体外扩增技术、生物芯片技术在医学研究中为了解疾病的发生发展机制，诊断和药物研制、开发中的应用。 关键词：分子生物学分子生物技术医药基因芯片蛋白质组学
最新分子生物学技术考试答题要点汇总
2010分子生物学技术考试答题要点
深圳大学研究生试题答案 学院生命科学学院专业细胞生物学 课程名称分子、生物学研究方法拟题人田生礼唐玉林 审题人 1. 何谓载体？载体的必备条件有哪些？（9分） 携带外源基因进入宿主细胞的工具。体外重组DNA实验中，将外源DNA片段运送进宿主细胞进行扩增或表达的运载工具称为载体(vector)，这也是一个DNA 分子。 1）克隆载体上要有复制起点，表达载体还需有启动子；2）载体上要有选择标记基因或报道基因；3）除了置换型的载体外，载体上具有多个限制性内切核酸酶的酶切位点，对一种限制酶来说只能有一个。 2. 采用末端标记DNA探针是常用的分子生物学技术，请你先解释分子生物学中核酸探针的概念，请你采用至少两种方法来标记DNA探针。（10分） 答题要点： 核酸探针：是指利用杂交技术检测特异核酸序列必须使用探针。一个探针可以是能检测互补核酸序列的简单的DNA或RNA分子。 末端标记DNA探针可以有如下方法 1）.利用T7DNA聚合酶在没有底物时，发挥它的3’→5’外切酶活性，随后加入α-32p-dGTP，发挥它的聚合酶活性标记3’端；
2）.利用牛小肠碱性磷酸酶（CIP）处理，再用磷酸激酶在底物 -32p-dATP存在的情况下标记DNA5’端； 3）.利用DNA末端转移酶在底物α-32p-dGTP存在的情况下标记DNA的3’端。 3. 一个未知序列的真核cDNA片段，3’和5’端均为平末端，欲把其克隆到一个原核表达载体中，并且可以获得表达。采用哪些克隆策略可以成功克隆该基因（至少两种方法）？如何证明克隆和表达成功？（提示：先克隆测序、再克隆、鉴定、表达、证明表达成功）（12分） 答题要点： 由于是一个未知序列的基因可以采用先克隆到测序载体的方法：1在载体上涌Smal I切割载体直接插入；2采用同聚物加尾克隆；3加人工接头；4加衔接物。克隆后测序。再根据成熟肽的序列设计引物，利用PCR扩增目的基因，通过酶切后克隆到表达载体；通过酶切鉴定和测序确定克隆成功，通过诱导表达后的SDS-PAGE电泳及western blot或质谱鉴定和证明表达成功。 4. 核酸分子杂交技术主要包括Southern Blot 和 Northern Blot，简述这两个技术的原理和主要过程（步骤）。为什么Northern Blot检测时还要杂交一个看家基因？（15分） 答题要点：
分子生物学研究进展
分子生物学研究进展 Research Progress in Molecular Biology 课程简介 分子生物学是从分子水平理解生物现象的学科。本课程主要介绍当前分子生物学中几个热点领域的研究进展。主要关注DNA、RNA和蛋白质几个生物大分子及细胞信号转导。内容主要包括DNA的多态性、非编码RNA、蛋白质的转运和蛋白质-蛋白质相互作用、细胞周期调控和细胞凋亡、系统生物学等。 This course is an introduction to the research progress in molecular biology, with a focus on three key macromolecules DNA, RNA and proteins and signal transduction of the cell. Main contents include DNA polymorphism, non-coding RNA, protein-protein interaction, protein traffic, regulation of cell cycle and apoptosis and some other hot research topics. Students are required to have basic molecular biology knowledge before taking this course. 教学大纲 一、课程名称：分子生物学研究进展 二、总学时数及学分： 18学时，1学分 理论课18学时 三、授课对象： 博士／硕士研究生，专业。 预修知识要求：要求有化学、生物学、遗传学、生物化学及微生物学相关知识 四、教学目的及要求： 在掌握生物化学与分子生物学基本知识基础上，熟悉分子生物学领域的新理论、新知识、新技术和新动向；了解分子生物学活跃的前沿领域的主要动向及发展趋势；为选课对象开展毕业或学位论文设计提供一些启示，为学生自学自己领域的研究进展起个抛砖引玉的作用。 选课要求：主修完生物化学与分子生物学硕士研究生相关课程、成绩合格者。根据《进展》课程内容提示，可独立查阅英文文献资料。掌握《进展》课程基本内容，了解前沿动态和发展趋势；能学会利用课程授课相关内容开阔视野，更好的理解自己研究领域的最新进展。 五、理论课内容：（按学科发展不断更新，内容目前暂定） 第一章DNA多态性（3学时）DNA Polymorphism 第二章蛋白质-蛋白质相互作用（3学时）Protein-Protein Interaction 第三章蛋白质在细胞内的转运（3学时）(Intracellular Protein Traffic)