分子病理学技术新进展

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分子病理学的研究方法和应用

分子病理学的研究方法和应用

分子病理学的研究方法和应用分子病理学是一门研究疾病发生、发展和诊断的科学,它通过研究生物分子的结构、功能、变异和表达等方面的信息,揭示疾病的分子机制,为疾病的预防、治疗和个体化医学提供重要的依据。

分子病理学的研究方法和应用主要包括分子生物学技术和生物信息学分析方法。

分子病理学的研究方法主要是利用各种分子生物学技术来研究疾病相关的分子特征。

其中,最常用的技术包括PCR(聚合酶链式反应)、蛋白质免疫印记法、Western blot、流式细胞术、细胞培养和基因组学等。

这些技术可以用来检测和测定疾病相关的基因表达水平、蛋白质表达水平、DNA和RNA的变异以及细胞增殖和凋亡等过程。

PCR是一种重要的技术,它可以放大微量的DNA分子片段,从而方便对基因突变、基因扩增、基因重组等研究。

PCR技术在肿瘤学、遗传学和传染病学等领域有广泛的应用。

蛋白质免疫印记法则可以通过特异抗体与目标蛋白质结合,从而实现对蛋白质的检测和定量。

Western blot则是一种常用的蛋白质免疫印记法,可以用于分析特定蛋白质在疾病中的表达变化。

流式细胞术可以对细胞进行表型、功能和生物学特征的分析,被广泛应用于肿瘤和免疫学研究。

细胞培养技术则可以用来研究细胞增殖、细胞信号传导和细胞毒性等方面的问题。

而基因组学则是研究基因组中的DNA序列、基因调控和基因功能等方面的科学,包括全基因组测序和基因芯片技术等。

在生物信息学的分析方法方面,主要包括基因组学数据分析、蛋白质组学数据分析和代谢组学数据分析等。

基因组学数据分析可以从基因组水平揭示基因表达、功能和调控等方面的信息,包括基因定位、基因组结构、基因组变异和基因共表达等。

蛋白质组学数据分析则可以通过大规模测定和分析蛋白质在疾病中的表达、修饰和互作等信息,从而揭示疾病的分子机制和靶点。

代谢组学数据分析则是研究代谢产物在生物体内的变化规律,可以用于研究代谢通路、代谢物标志物和代谢物调控等问题。

这些生物信息学分析方法可以帮助研究人员从大量的数据中挖掘并解读疾病的潜在机制,为疾病的预防、诊断和治疗提供科学依据。

分子生物学的新成果与展望

分子生物学的新成果与展望

分子生物学的新成果与展望分子生物学是研究生物分子和分子相互作用的学科,它的研究内容极为广泛,包括分子生物学、生物信息学、基因工程、蛋白质科学、结构生物学等多个分支学科。

随着科技的不断进步,分子生物学的研究取得了重大进展,为我们理解生命本质、探索生命奥秘提供了新思路和新手段。

一、新成果1. 基因编辑技术在过去的几十年中,基因编辑技术经历了从传统的不精确基因操纵到利用CRISPR-Cas9精确编辑基因的巨大飞跃。

这种先进的技术使得研究人员可以通过精确切割特定DNA序列,然后在更改基因以增强或抑制特定生物进程方面发挥作用。

因此,它可以用来进行基因疗法和遗传学研究等方面。

2. 单细胞测序技术单细胞测序技术是一种可以检测单个细胞基因表达水平的高通量RNA测序方法,允许鉴定具有微小且有意义的差异的细胞亚型。

这种技术现已成为肿瘤分子分型和治疗响应预测等领域的重要工具,同时,它也为研究胚胎发育和组织异质性提供了新的视角。

3. 人工智能与机器学习所带来的支持数据处理是分子生物学中不可或缺的一环,越来越多的研究者发现,在处理特别复杂和庞大数据的时候,人工智能技术和机器学习有了重大贡献。

通过这种方法,科研人员可以更高效的分析数据、开发新模型和挖掘潜在的关联模式。

例如,研究者可以通过深度学习(deep learning)等技术,用少量的信息生成或分类大量图像、绘制结合的分子中周围原子的导出方式等操作。

二、展望1. 分析功能修饰近年来,研究者在分析蛋白质表达和发挥功能中相关的修饰方面取得了重要进展。

例如,研究人员已开始着手对蛋白质翻译后修饰的场景展开研究。

这些修饰物可能包括磷酸化、酰化和糖基化等,产生影响来调控蛋白质功能的作用。

2. 展开测序病理学这种方法可以通过应用转录测序、DNA测序、甲基化测序等技术,为一些疾病的诊断和治疗制定新的策略。

研究者们认为,这种方法的研究成果将对肿瘤、神经退行性疾病和以RNA为主的疾病产生重大影响。

肺鳞癌的分子病理学研究进展

肺鳞癌的分子病理学研究进展

l e c u l a r a l t e r a t i o n s i n ll a s u b t y p e s o f l u n g c a n c e r .T h e r e a r e a l r e a d y s e v e r l a p o t e n t i a l t a r g e t mu t a t i o n s t h a t a r e b e i n g a c t i v e l y p u r s u e d i n c l i n i c a l t r i a l s ,a n d t h e u p c o mi n g c a n c e r g e n o me a i r a s a n a l y s i s i n s q u a mo u s c e l l s h o u l d a l s o p r o v i d e a mo d e l f o r g e n o t y p i n g .He r e ,we r e v i e w t h e c u r r e n t k n o w l e d g e a b o u t t h e mo l e c u l a r lt a e r a t i o n s f o u n d i n l u n g s q u a mo u s c e l l c a r c i n o ma .
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分子病理学常用研究技术原理及应用

分子病理学常用研究技术原理及应用

分子病理学常用研究技术原理及应用1.PCR(聚合酶链式反应)PCR是一种能够扩增特定DNA片段的技术。

它通过逐渐进行一系列的温度循环,使得DNA的两条链解离,然后由DNA聚合酶在每个DNA模板单链上合成新的DNA链。

PCR可以扩增微弱的DNA片段并获得足够数量的DNA进行研究。

PCR广泛应用于基因突变检测、DNA定量分析、基因克隆等领域。

2.实时定量PCR(qPCR)qPCR是PCR的一种改进技术,它能够在PCR过程中实时监测反应过程中的DNA扩增情况。

qPCR结合了PCR和荧光探针等技术,可以定量地检测目标DNA的起始浓度。

qPCR广泛应用于检测微生物感染、基因表达分析、疾病诊断等领域。

3. 西方印迹(Western blot)Western blot是一种用于检测特定蛋白质的技术。

它通过将样品中的蛋白质分离并转移到膜上,然后用特异性抗体与目标蛋白结合,最后通过探针或底物检测蛋白质的存在。

Western blot可以定量地检测目标蛋白的表达、翻译后修饰等信息,广泛应用于疾病诊断、蛋白质功能研究等领域。

4. 免疫组化(Immunohistochemistry,IHC)IHC是一种用于检测组织切片中特定蛋白质表达的技术。

它通过将组织切片上的蛋白质与特异性抗体结合,然后使用可视化方法如染色来显示特定抗原的位置。

IHC可以从组织水平上了解蛋白质在细胞和组织中的表达模式,广泛应用于肿瘤诊断、免疫学研究等领域。

5.DNA测序DNA测序是一种确定DNA序列的技术。

通过测序技术可以了解DNA序列上包含的信息,如基因突变、SNP等。

DNA测序广泛应用于基因组学研究、个体遗传学研究、品种鉴定等领域。

6.RNA测序RNA测序是一种确定转录组的技术。

通过测序技术可以了解细胞中mRNA的表达模式,以及基因的剪接变异、转录水平调控等信息。

RNA测序广泛应用于转录组学研究、基因功能研究等领域。

7.基因表达芯片基因表达芯片是一种通过检测大量基因在特定条件下的表达来了解基因调控网络的技术。

分子植物病理学的研究热点与发展趋势

分子植物病理学的研究热点与发展趋势

分子植物病理学的研究热点与开展趋势中国科协第251次青年科学家论坛简报2022年01月11日分子植物病理学的研究热点与开展趋势——中国科协举办第251次青年科学家论坛由中国科协主办,中国植物病理学会、中国农业大学、华中农业大学承办的第251次青年科学家论坛于11月19~22日在华中农业大学举行。

一、论坛根本情况本次论坛邀请了来自中国农业大学、南京农业大学、华中农业大学、西北农林科技大学、华南农业大学、四川农业大学、山东农业大学、吉林大学、上海交通大学、青岛农业大学、吉林农业大学、西南大学、浙江师范大学、中国科学院遗传与发育研究所、中国科学院微生物研究所、中国科学院植物逆境生物学研究中心、中国农业科学院植物保护研究所、棉花研究所、江苏省农业科学院、浙江省农业科学院、福建省农业科学院、河北省农林科学院等22个单位的80余位青年科学家参会。

论坛执行主席由中国农业大学孙文献教授、西北农林科技大学单卫星教授、南京农业大学王源超教授、华中农业大学姜道宏教授共同担任。

二、论坛主要议题论坛围绕“分子植物病理学的研究热点与开展趋势〞这一主题展开。

并就“功能基因组学与比拟基因组学在植物病原致病机理的解析以及致病基因的大规模别离与鉴定中的应用〞、“PTI与ETI抗性基因调控网络研究的最新进展及其对未来分子植物病理学开展的影响〞、“三大粮食作物及重要的经济作物主要病原的效应蛋白在寄主中靶标的研究及其在分子设计育种中的潜在价值〞、“重要植物病原菌致病性的调控机理及分泌途径研究〞、“病原菌重要致病因子晶体结构的解析与药物靶标的选择〞、“重要作物病害防控的新策略与新思路〞等6个方面的问题进行了广泛而又深刻的学术讨论。

1、功能基因组学与比拟基因组学在植物病原致病机理的解析以及致病基因的大规模别离与鉴定中的应用随着生物信息技术的高速开展和广泛应用使得基因组学尤其是功能基因组学成为研究病原物致病机理和致病相关基因克隆及其调控网络研究等快捷而有效的途径。

最新分子生物学技术新进展课件PPT

最新分子生物学技术新进展课件PPT
➢ 大脑后动脉颞支缺血累及边缘系统的颞叶海马、海马 旁回和穹隆所致
临床表现
③ 双眼视力障碍发作 双侧大脑后动脉距状支缺血导致
枕叶视皮层受累,引起暂时性皮质盲
辅助检查
➢ CT或MRI检查大多正常,部分病例(发作时间 >60min者)于弥散加权MRI可见片状缺血灶
➢ CTA、MRA及DSA可见血管狭窄、动脉粥样硬 化斑
(五)基因突变分析 PCR与其他技术的结合可以大大提高基因突变检 测的敏感性 。
三、几种重要的PCR衍生技术
(一)逆转录PCR技术 逆转录PCR(reverse transcription PCR,RT-PCR)是将 RNA的逆转录反应和PCR反应联合应用的一种技术, 是目前从组织或细胞中获得目的基因以及对已知序 列的RNA进行定性及半定量分析的最有效方法。
➢ TCD可发现颅内动脉狭窄,并可进行血流状 况评估和微栓子监测
➢ 血常规和生化检查是必要的 ➢ 神经心理学检查可能发现轻微的脑功能损害
诊断及鉴别诊断
1.TIA的诊断
➢ 大多数TIA患者就诊时临床症状已消失,诊断主 要依靠病史
➢ 中老年患者突然出现局灶性脑功能损害症状,符 合颈动脉或椎-基底动脉系统及其分支缺血表现, 并在短时间内症状完全恢复(多不超过1小时), 应高度怀疑为TIA
1.DNA序列分析 用于基因突变类型已经明确的遗传病的诊断及产 前诊断 ,例如血友病、囊性纤维变性、杭延顿氏 舞蹈症、抗胰酶缺乏症等均可检测。
2.PCR技术 • 快速检出样品中的痕量病原微生物,例如乙
型病毒性肝炎、丙型病毒性肝炎,爱滋病等。 • 微量DNA 样品中的基因及基因变异分析。 • 用于个体识别、亲缘关系鉴定、器官移植术
➢ PWI/DWI、CTP和SPECT有助TIA的诊断

分子生物学技术在医学检验中的应用进展

分子生物学技术在医学检验中的应用进展

分子生物学技术在医学检验中的应用进展随着分子生物学技术的不断发展,它被广泛应用于医学检验中,因为它具有高度的准确性和灵敏度。

分子生物学技术所检出的数据提供了对临床病理学的深入理解和帮助,同时,也找出了许多传统的诊断实践无法确定的疾病状态。

本文将介绍分子生物学在医学检验中的应用及其最新进展。

第一部分:分子生物学技术应用a. 基因诊断基因诊断指的是通过分析基因组学信息来确定人类或动物是否携带某些疾病的基因突变。

这种诊断方法广泛用于遗传疾病的检测,包括囊肿性纤维化、先天性心脏病和血友病等。

基因诊断可以通过对DNA 序列进行PCR扩增来检测被检染色体上的基因变异。

基因诊断在许多常见疾病的早期检测中也产生了显著的贡献。

例如,基因诊断可以用于发现糖尿病、肾衰竭和易感感染等疾病的遗传因素,以及各种癌症的基因诊断。

基因诊断被认为是预测疾病风险、制定预防计划并及早诊断的有效方法。

b. 基因测序近年来,随着激光技术和更高程度的精确性在测序领域内的不断发展和普及,基因测序的价值在生命科学和疾病研究领域得到了广泛认可。

利用DNA或RNA样本进行基因测序通常是由PCR扩增和Sanger 测序方法二者同时使用的,这种方法可以将单个基因序列中的所有碱基计算和定位,从而解释基因组组成的变化及其影响。

由于新型测序技术的出现,如下一代测序,已经成为检测基因改变的革命性方法。

基因测序可以在肿瘤诊断、病原体检测和攻击性疾病的诊断中发挥重要作用。

c. 重复序列分析重复序列是一些短的DNA或RNA片段,它们在多个基因和染色体上共同出现。

这些重复序列经常在基因组领域起作用,它们常被用于诊断和预防起源于基因、复杂疾病的遗传性因素。

通过重复序列分析,可以检测到多种稳定性细胞DNA中的微型发生变化,如突变、插入、删除或扩增等,这些变化有助于诊断基因重组和异常纵向转移。

重复序列分析可以检测到科学家在疾病诊断和遗传研究中发现的多种遗传暴露,例如肌萎缩性脊髓侧索硬化症、艾尔茨海默氏病和遗传肿瘤等。

植物的分子病理学研究

植物的分子病理学研究

植物的分子病理学研究植物是人类赖以生存的重要资源,但在不断的生长过程中,受到了各种病毒、细菌、真菌和昆虫等病害的侵害,导致产量下降,甚至死亡。

因此,植物的病理学研究变得越来越重要。

在病理学领域中,分子病理学已成为研究的重要方面。

本文将探讨植物分子病理学研究的意义、研究方法和应用前景。

一、植物分子病理学研究的意义植物分子病理学关注微生物、霉菌、病毒和生物化学因素对植物生理过程的影响,追踪病原微生物和植物之间相互作用的原因和机制。

分子病理学可以通过分离和鉴定归因于疾病的基因、表达和定量使其更加深入的了解疾病的症状和发生机制,有助于病害的诊断和治疗。

与传统的病理学方法相比,分子病理学具有更高的分辨率和特异性。

通过对病原微生物在宿主植物中的基因表达、分子相互作用和代谢调控进行研究,可以阐明病原微生物在植物中的寄生和感染过程,深入解释植物与微生物的相互作用。

二、植物分子病理学研究的方法1. 基因组学研究基因组学研究是植物分子病理学的重点之一,包括测序、组装和注释植物和病原微生物的基因组。

基因组学可以阐明不同物种间的基因组变异,为不同病害的研究提供基础。

此外,基因组学还可以帮助探索微生物与植物的作用和互动,揭示基因或蛋白质功能、调节度、表达量和基因网络之间的相互作用,发现新的蛋白质家族或功能分子,对植物分子病理学的研究有重要意义。

2. 蛋白质组学研究蛋白质组学研究涉及所有蛋白质的集合体,包括它们的调控、分析和鉴定。

该研究方法可以识别植物内部病原微生物和来自它们的代谢产物及其诱导的植物防御机制的变化。

同时也包括了准确测定一种细胞中蛋白质种类和数量变化等领域。

研究蛋白质组可以揭示植物信号通路的反应,如细胞周期调控和细胞凋亡,并针对突然的外部自然因素进行猝变反应,比如气候变化和有害物质所引起的多种情况。

3. RNA分析RNA分析是一种新兴的分子技术,通过研究RNA的序列和表达量来揭示植物病理学的细节。

RNA的序列和表达量与影响植物的代谢和生长的基因直接相关。

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分子病理学技术新进展•病理学的发展与使用的工具和方法的更新密切相关:解剖刀剪等—进行尸体检查—器官病理学显微镜—发明百年之后—细胞病理学电子显微镜—发展—超微病理学免疫组织化学—促进—免疫病理学分子生物学—带动—分子病理学计算机及网络—走进—信息病理学病理学技术就是如何应用新工具的方法和措施。

从发展过程看,在新工具面前必须首先解决使用的技术及其相应措施,才能在理论上有所发现。

所以,我们必须关注那些新工具、新方法,才能得以用于解决病理学中的问题。

病理学技术包括传统病理学技术和现代新技术•传统:Formalin固定,石蜡切片和HE染色及特殊染色技术—病理学的基本技术。

•新技术:免疫组化、原位杂交、原位PCR、凝胶电泳技术、核酸杂交技术(包括FISH、CGH)、PCR技术、基因重组技术、基因测序技术、细胞凋亡检测技术、细胞培养技术、流式细胞技术、激光共聚焦、显微切割技术、组织芯片技术、DNA芯片技术等等。

•根据科研和临床病理诊断的需要,不断建立和开展新技术,把传统技术和新技术相结合,不断提高病理学技术水平,逐步与国际水平接轨。

常规病理技术•近20余年来,常规病理技术也得到较大发展:➢微波方法缩短组织脱水、浸蜡时间;➢新的化学试剂取代传统的甲醛、二甲苯;➢逐步向自动化发展(全自动封闭式组织脱水机、全自动染色封片系统、全自动特殊染色机等)➢细胞病理学技术:传统的涂、刮片逐步向薄层液基细胞学发展TCT 液基细胞学检测新柏氏超薄细胞检测仪特殊染色技术•HE染色虽是一种快捷、经济、且易于掌握的方法,但它不能回答病因学、组织发生及发病机制等许多方面的问题。

为了显示与确定组织或细胞中的正常结构或病理过程中出现的异常物质、病变及病原体等,需要分别选用相应的显示这些成分的染色方法进行染色,固称特殊染色。

•在过去的20年里,由于免疫组织(或细胞)化学技术的迅速发展与广泛应用,特染的应用日趋减少,人们感到以组织化学为基础的特染方法似乎有些过时,但实际上它在诊断病理学及研究中仍然有着不可忽视的作用。

特殊染色的方法很多,常用的一些特殊染色的方法介绍如下:1、网织纤维染色(reticulin stains)显示网织纤维及基底膜物质。

传统的网织染色以银染为基础,有Gomori法,Wilder及Gordon 和Sweet法等,它们在肿瘤病理诊断中具有鉴别诊断作用:1)区别上皮与非上皮肿瘤;2)区别某些间叶组织肿瘤;3)区别原位癌与浸润癌。

2、PAS染色(periodic acid-schiff)可以显示糖原、中性粘液物质、基底膜、霉菌与寄生虫。

3、微生物特染最常用者是革兰氏阳性及革兰氏阴性细菌染色法(B&B)、分枝杆菌染色、霉菌染色。

4、嗜银及亲银染色不需外加还原剂,在黑暗中即有还原银盐的能力,称为亲银性(argentaffin),代表方法Fontana-Masson法。

而需外加还原剂或在光线存在时才有还原能力,称为嗜银性(argyrophilic), 代表方法是非改良的Grimelius法。

5、淀粉样染色刚果红(congo red)是最可靠且实用的检测淀粉样物质的方法。

6、三色染色(trichrome stains)可分别显示细胞核、细胞浆及细胞外胶原。

7、磷钨酸苏木素染色(PTAH染色)一种三色染色的特殊类型,用于显示肌组织及胶质细胞胞浆内的微丝。

8、含铁血黄素、黑色素及钙染色显示含铁血黄素首选Perls普鲁士兰反应(Prussian blue)。

Fontana-Masson 法是用含氨盐溶液显示黑色素的方法。

在显示钙的染色中,von Kossa 法常用。

9、中性脂质染色油红(Oil red)是最常用的染色方法,但不能用于石蜡包埋的组织。

中性脂质(lipids)最常用于肿瘤的诊断与鉴别,可区别卵巢纤维瘤及泡膜细胞瘤、皮脂腺癌与鳞状细胞癌等。

10、粘液染色(mucin stains)粘液染色法中,阿尔辛蓝(Alcian blue)和PAS联合可显示中性、轻度酸性及高度酸性粘液物质,故是最好的全粘液(pan- mucin)染色法。

11、Giemsa染色常用于涂片及切片染色。

可清楚的显示并区分不同分化阶段的淋巴造血细胞,并可将肥大细胞浆染成紫红色颗粒,故在上述瘤性及反应性增生的诊断中有重要作用。

12、髓鞘(myelin)染色分正常髓鞘染色和变性损伤髓鞘染色。

最常用的方法为Luxol坚固蓝(Luxol fast blue)法。

13、弹性纤维(elastic fibers)染色最常用Weigert法及Verhoeff van Gieson (VVG) 法,一般认为前者特异,后者快速且清楚。

实践篇准备阶段•(一)抗体购买试剂公司的选择•北京中杉、福州迈新•Leica、BioGenex(北京英硕力代理)、Santa Cruz (北京中杉代理)•上海太阳、上海长岛•武汉博士德、北京博奥生•(二)组织处理1、组织要新鲜冰冻切片离体后尽快冻存石蜡切片要尽快固定2、主要病灶区取材3、组织块V:1×1×0.2cm•(三)标本固定1、10%的中性福尔马林为常用的固定剂,对蛋白损伤少,能保存大部分组织结构。

2、固定时间6-12小时,以不超过48小时为宜。

3、固定液的量一般应为组织块总体积的4~5倍,也可达15~20倍。

(四)脱水、透明、包埋1、脱水透明室温条件即可。

2、浸蜡包埋温度根据蜡的熔点确定(60-70度)。

(五)载玻片处理与切片制作1、新载玻片硫酸浸泡过夜,流水冲洗,蒸馏水洗涤,置37℃温箱内烘干。

2、将载玻片浸入现配的1:50APES丙酮液1分钟,入纯丙酮溶液洗除未结合的APES,自然晾干。

3、切片厚度3-5μm,65℃温箱烤片2-4小时。

操作阶段•热修复:高压、微波等•双暴露:酶+热修复抗体浓度常用0.01mol/L pH7.4 的PBS 或TBS 缓冲液作抗体稀释液。

选择最佳一抗、二抗稀释浓度。

对照选择•用PBS液代替一抗做阴性对照;•用已知阳性的组织切片做阳性对照。

证明和肯定阳性结果的特异性,排除非特异性疑问。

结果判断特异性反应产物常分布于特定的部位,如胞浆内,也有分布在细胞核和细胞表面的,即具有结构性。

特异性染色表现为在同一切片上呈现不同程度的阳性染色结果。

非特异性染色表现为无一定的分布规律,常为某一部位成片的均匀着色,细胞和周围的结缔组织均无区别的着色。

常出现在干燥切片的边缘,有刀痕或组织折叠的部位。

免疫组化结果的判断原则:•1、必须设对照•2、抗原表达必须在特定部位•3、阴性结果不能视为抗原不表达•4、免疫组化与HE切片诊断应以HE切片诊断为准细胞浆阳性表达膜阳性表达细胞核阳性表达提高IHC方法敏感性的辅助手段免疫组化染色过程中存在的问题、原因分析及对策•无色片(即无阳性信号)•“杂音”染色片(有阳性信号)1、全片着色2、切片边缘着色3、“阴阳脸”着色4、灶片状着色5、间质着色6、细胞浆着色7、细胞核着色免疫组化染色影响因素•影响免疫组化染色质量的因素有很多,在实验中应注意组织的取材和固定,选择质量好的商品化抗体,恰当地选择和使用封闭和抗原修复手段,严格的技术操作和对照等。

•注意组织的取材和固定•假阴性问题•假阳性问题免疫组化自动染色仪分子病理学相关技术•原位杂交•荧光原位杂交(FISH)•多聚酶链式反应技术(PCR)•原位PCR•显微切割技术(micro-dissection)•基因测序技术•生物芯片技术Southern印迹杂交法•1975年首先由苏格兰爱丁堡大学Southern报告•1981年Korsmeyer等首先将其应用于基因重排•其原理是:两条单链DNA碱基可与人工合成的互补单链DNA探针相结合(一般用同位素标记)。

原位杂交•原位杂交(in situ hybridization,ISH)是核酸分子杂交的一部分,是将组织化学与分子生物学技术相结合来检测和定位核酸的技术。

根据所选用的探针和待检靶序列的不同,有DNA-DNA 杂交、DNA-RNA杂交和RNA-RNA杂交。

原位杂交技术的应用•①细胞特异性mRNA转录的定位,可用于基因图谱、基因表达和基因组进化的研究;•②感染组织中病毒DNA/RNA的检测和定位,如EB病毒mRNA、人乳头状瘤病毒(HPV)、乙型肝炎病毒(HBV)和巨细胞病毒DNA的检测;•③癌基因、抑癌基因及各种功能基因在转录水平的表达及其变化的检测;•④基因在染色体上的定位;•⑤检测染色体的变化,如染色体数量异常和染色体易位等;•⑥分裂间期细胞遗传学的研究,如遗传病的产前诊断和某些遗传病基因携带者的确定,某些肿瘤的诊断和生物学剂量测定等。

HPV原位杂交结果HPV原位杂交结果HPV原位杂交结果原位杂交和免疫组化染色技术比较•IHC使用的是抗体,其检测对象是抗原,机制是抗原—抗体的特异性结合,是蛋白质表达水平的检测;•ISH使用的是探针,遵循碱基互补配对的原则与待检靶序列结合,是DNA或mRNA水平的检测。

荧光原位杂交(fluorescence in situ hybridization,FISH)用已知的标记单链核酸为探针,按照碱基互补的原则,与待检材料中未知的单链核酸进行特异性结合,形成可被检测的杂交双链核酸。

由于DNA分子在染色体上是沿着染色体纵轴呈线性排列,因而可以探针直接与染色体进行杂交从而将特定的基因在染色体上定位。

FISH技术的特点FISH探针的种类FISH技术在临床中的应用•血液病检测•产前诊断•实体瘤检测多聚酶链反应扩增(PCR)•1985年首先由美国Mullis 等设计成功•目前临床开展的PCR检测项目主要应用于遗传病的产前诊断、致病病原体的检测、癌基因的检测和诊断、DNA指纹、亲子关系鉴别及法医物证等方面。

•随着PCR技术的不断发展,针对各种需要,衍生出许多类型的PCR方法,包括巢式PCR 、复合PCR 、反向PCR 以及实时定量PCR 等,尤其是实时定量PCR,通过监测PCR反应过程中荧光信号描绘扩增曲线,对起始模板进行定量,现在也已经广泛地应用于临床,如病毒的拷贝数等。

原位多聚酶链式反应技术(PCR in situ)•原位PCR技术是多聚酶链式反应技术的一个类型,是将PCR的高效扩增与原位杂交的细胞及组织学定位相结合,在冷冻或石蜡包埋组织切片、细胞涂片或培养细胞爬片上来检测和定位核酸。

其敏感性比原位杂交高出2个数量级,是形态学和分子生物学前沿交叉的产物。

原位PCR技术的应用•原位PCR技术能用于低拷贝的内源性基因的检测和定位,在完整的细胞样本上能检测出单一拷贝的DNA序列,可用于基因突变、基因重排和染色体易位等的研究和观察;•外源性基因的检测和定位,如对各种感染性疾病病原的基因检测,如EB病毒、人乳头状瘤病毒、肝炎病毒、巨细胞病毒和人免疫缺陷病毒基因组及结核、麻风杆菌基因的检测等•临床上还可用于对接受了基因治疗患者体内导入基因的检测等。

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