基因定点突变方法及其应用

基因定点突变方法及其应用

摘要：本文综述了基因定点突变的三种方法，在此基础上的一些改进方法及其应用，并对这三种方法进行了比较。

关键词：定点突变；寡核苷酸引物；PCR；盒式突变

Methods of Site-directed Mutagenesis and

Their Application

Abstract: In the paper，methods of site-directed mutagenesis，some advanced methods on the basic methods and their application are present. At the same time，the comparison are made .

Key words: site-directed mutagenesis；oligonucleotide；PCR；cassette mutagenesis

定点突变技术可以随心所欲地在已知DNA序列中取代、插入或缺失一定长度的核苷酸片段。该方法比使用化学因素、自然因素导致突变的方法具有突变牢高、简单易行、重复性好的特点；除用于改变核苷酸序列获得突变基因、研究基因的结构与功能的关系之外，还能够通过改变特定的氨基酸获得突变蛋白质，研究蛋白质的结构与功能，从微观水平上阐明正常状态下基因的调控机理、疾病的病因和机理。随着分子生物学研究的突飞猛进，基因定点突变技术成为一项重要的分子生物学实验技术手段，在生物和医学领域中的应用非常广泛。目前常用的定点突变方法有寡核苷酸引物介导的定点突变、PCR介导的定点突变及盒式突变等[1]。

1常用定点突变方法

1.1核苷酸引物介导的定点突变

其原理是用含有突变碱基的寡核苷酸片段作引物，在聚合酶的作用下启动DNA分子进行复制。主要的过程(见图1)：①将待突变基因克隆到突变载体上；②制备含突变基因的单链模板；③引物与模板退火5’端磷酸化的突变寡核苷酸引物，与待突变的核苷酸形成一小段碱基错配的异源双链的DNA，④合成突变链：在DNA聚合酶的催化

下，引物以单链DNA为模板合成全长的互补链，而后由连接酶封闭缺口，产牛闭环的异源双链的DNA分子；⑤转化和初步筛选异源双链DNA分子转化大肠杆菌后，产生野生型、突变型的同源双链DNA 分子。可以用限制性酶切法、斑点杂交法和生物学法来初步筛选突变的基因；⑥对突变体基因进行序列分析。

1.2 PCR介导的定点突变

经典PCR介导的定点突变法，需要4种扩增引物，进行3次PCR 反应(见图2)。头两次PCR反应中，应用两个互补的并在相同部位具有相同碱基突变的内侧引物，扩增形成两条有一端可彼此重叠的双链DNA片段，去除未参入的多余引物之后，这两条双链DNA片段经变性和退火可以形成具有3’凹末端的异源双链分子，在TaqDNA聚合酶的作用下，产生含重叠序列的双链DNA分子。这种DNA分子再用两个外侧寡核苷酸引物进行第三次PCR扩增，便产生突变体DNA。1.3盒式突变

盒式突变是利用一段人工合成的含基因突变序列的寡核苷酸片段，取代野生型基因中的相应序列。这种突变的寡核苷酸是由两条寡核苷酸组成的，当它们退火时，按设计要求产生克隆需要的粘性末端，由于不存在异源双链的中间体，因此重组质粒全部是突变体。如果将简并的突变寡核苷酸插入到质粒载体分子上，在一次的实验中便可以获得数量众多的突变体，大大减少了突变需要的次数。这对于确定蛋白质分子中不同位点氨基酸的作用是非常有用的方法。

2 定点突变方法的改进

2.1 寡核苷酸引物介导的定点突变的改进

该方法常产生突变效率低的现象，其主要原因是大肠杆菌中存在甲基介导的碱基错配修复系统所致。针对这一问题，KUNKEL[2]进行了改进，用尿嘧啶取代DNA的选择作用提高了突变效率。近几年来，多家生物公司又进行了进一步的完善，并相继推出了本公司的产品。据不完全统计：Promega公司研制了Alter sitesⅡin vitro Mutagenesis system，安法玛西亚公司研制了Unique Site Elimination Mutagenesis Kit，Stratagene公司研制了Quik change Site—DirectedⅣMutagenesis Kit，伯乐公司研制了Muta-Gene in vitro Mutagenesis Kit，这些试剂盒各有特色，它们的共同之处有：①采用甲基修复酶缺乏的菌株作为受菌体，大大降低了突变修复频牢。②采用改进后的质粒，省去了制备单链模板的烦琐步骤，节省了时间。③增加了多个抗生素筛选标志和相对应

的多对敲除/修复引物，使得在该质粒上可以连续进行不止一次的突变反应，使突变反应更加快速、简便。

这里简单介绍一些Stratagene公司的Quik Change Site-directed Mutagenesis kit，由于巧妙设计，质粒定点突变技术变得简单有效。准备突变的质粒必须是从常规 E.coli中经纯化试剂盒(Miniprep)或者氯化铯纯化抽提的质粒。设计一对包含突变位点的引物（正、反向），和模版质粒退火后用PfuTurbo聚合酶“循环延伸”，(所谓的循环延伸是指聚合酶按照模版延伸引物，一圈后回到引物5’端终止，再经过反复加热退火延伸的循环，这个反应区别于滚环扩增，不会形成多个串联拷贝。)正反向引物的延伸产物退火后配对成为带缺刻的开环质粒。DpnI酶切延伸产物，由于原来的模版质粒来源于常规大肠杆菌，是经dam甲基化修饰的，对DpnI敏感而被切碎（DpnI识别序列为甲基化的GATC，GATC在几乎各种质粒中都会出现，而且不止一次），而体外合成的带突变序列的质粒由于没有甲基化而不被切开，因此在随后的转化中得以成功转化，即可得到突变质粒的克隆。这个试剂盒非

常巧妙的利用甲基化的模版质粒对DpnI敏感而合成的突变质粒对DpnI酶切不敏感，利用酶切除去模版质粒，得到突变质粒，使得操作简单有效。另外由于Pfu聚合酶是公认的最好的高保真聚合酶之一，堪称高保真聚合酶的“黄金标准”，是Stratagene的看家之宝，能够有效避免延伸过程中不需要的错配。试剂盒采用的是低次数的循环延伸而非PCR，有助于减少无意错配。只需要一次酶切和转化，实验可以在一天完成。这个试剂盒适用于质粒大小不超过8Kb的质粒。后来推出的Quik Change XL site-directed mutagenesis kit则是针对大于8Kb的质粒的定点突变的，通过优化试剂特别是其感受态细胞（XL10-Gold），使得较大的质粒的定点突变也一样简单。

2.2PCR介导的定点突变的改进

大引物PCR是以第1轮PCR中产生的含点突变的产物做引物进行第2轮PCR反应，三种引物包括目的基因两侧上下游引物和中间含突变点引物，含突变点引物可与另两种引物之一进行第1轮PCR，所得产物作为大引物加上剩余的另一种引物进行第2轮PCR。

3 三种方法的比较

3.1 寡核苷酸引物介导的定点突变法

其优点是保真度比PCR突变法高，经过改进后使该方法突变成功率大大提高，缺点是操作过程环节复杂、周期长，而且在克隆待突变基因时会受到限制性酶切位点的限制。

3.2 PCR介导的定点突变法

其优点是操作较简单，突变的成功率可达100％。但它亦有两个缺点：①后续工作较复杂，PCR扩增产物通常需要连接到载体分子上，然后才能对突变的基因进行转录、转译等方面的研究[6]；②TaqDNA 聚合酶的保真性偏低；因此，PCR方法产生的DNA片段要经过核苷酸序列测定，方可确证有无发生其它突变。

3.3盒式突变

盒式突变法具有比前两者简单易行、突变效率高等优点，还可以在一对限制酶切位点内一次突变多个位点。缺点是合成多条引物的成本较高。另外，在一般情况下，在靶DNA片段的两侧往往难以满足存在一对限制性酶切位点的要求，限制了该方法的广泛应用。然而一旦具备了这样的条件，该方法则为首选。

4 基因定点突变的应用

周赞虎等人[7]采用快速PCR定点突变方法成功地对hCu，Zn-SOD