基因定点突破
定点突变技术的原理和步骤
定点突变技术的原理和步骤嘿，咱今儿来聊聊定点突变技术呀！这玩意儿可神奇了呢！你想啊，就好像是一个特别厉害的魔法，能让基因按照我们的想法来变一变。
那定点突变技术的原理是啥呢？简单来说，就是要精准地在基因的特定位置上搞点小改动。
这就好比是在一个庞大的基因拼图里，准确地找到那一块我们想要动的小拼图，然后给它换个模样。
这可不是随随便便就能做到的哦，得有非常精细的操作和技巧才行呢。
那具体咋操作呢？这步骤可不能马虎。
首先呢，得设计好要突变的那个点，这就像是给要走的路先规划好方向，可不能瞎走。
然后，要准备好各种工具和材料，这就跟出门得带好钥匙、钱包一样重要。
接下来，就是真正开始动手啦！就像一个精巧的工匠，小心翼翼地对基因进行操作。
把原来的那块小拼图取出来，再把我们准备好的新的放进去。
这过程可得特别仔细，不能有一点差错，不然可就前功尽弃啦！做完这些还不算完哦，还得检查检查，看看变的对不对，效果好不好。
这就像我们做完作业得检查一遍一样，可不能马马虎虎的。
你说这定点突变技术是不是很神奇？它能让我们对基因进行精确的改造，为很多领域带来了巨大的帮助。
比如说在医学上，能帮助我们研究疾病的发生机制，找到更好的治疗方法。
在农业上呢，能让农作物变得更优秀，产量更高，品质更好。
想象一下，如果没有定点突变技术，我们对基因的了解和利用会少多少啊！那得是多大的损失呀！所以说，这项技术真的是太重要啦！总之呢，定点突变技术就是这样一个既有趣又有用的东西。
它让我们对基因的操控变得更加精准和有效。
我们要好好利用它，让它为我们的生活带来更多的好处和惊喜。
你说是不是呀？。
定点突变原理
定点突变原理定点突变原理是指生物体基因组中某个特定位置的碱基序列发生突变的现象。
这种突变可以是单个碱基的替换、插入或缺失，也可以是更大范围的基因片段的改变。
定点突变可以导致生物体的遗传信息发生改变，从而影响其表型特征和遗传特性。
定点突变的发生通常是由于DNA复制过程中的错误或外部环境因素的影响。
在DNA复制过程中，酶类会不时出现错误，导致新合成的DNA链上出现错误的碱基。
此外，环境因素如辐射、化学物质等也会对DNA分子产生损害，导致定点突变的发生。
定点突变可以分为两种类型，点突变和插入/缺失突变。
点突变是指单个碱基的改变，包括错义突变、无义突变和无框移码突变。
错义突变是指由于碱基替换导致对应的氨基酸发生改变，从而影响蛋白质的结构和功能；无义突变是指由于碱基替换导致对应的密码子变成终止密码子，导致蛋白质合成过程中提前终止；无框移码突变是指由于碱基插入或缺失导致密码子的读框发生改变，从而影响蛋白质合成过程中的氨基酸序列。
插入/缺失突变则是指在基因组中插入或缺失一段碱基序列，导致基因的框架发生改变，进而影响蛋白质的合成。
定点突变的发生对生物体的遗传特性和表型特征都会产生影响。
在遗传学研究中，定点突变被认为是生物体进化过程中的重要驱动力之一。
一些有利于生物体适应环境的定点突变可以被自然选择所保留，从而在种群中逐渐普及。
而一些不利于生物体适应环境的定点突变则可能被淘汰。
因此，定点突变在生物体的进化过程中扮演着重要的角色。
定点突变也是许多遗传性疾病发生的原因之一。
一些致病基因中的定点突变会导致蛋白质结构和功能的改变，从而引发一系列遗传性疾病。
对定点突变的研究有助于我们更好地理解遗传疾病的发病机制，并为相关疾病的治疗提供理论基础。
总之，定点突变是生物体遗传信息发生变化的重要方式，它对生物体的遗传特性、进化过程以及遗传性疾病的发生都具有重要影响。
对定点突变的深入研究不仅有助于我们更好地理解生物体的遗传特性，也为相关领域的研究提供了重要理论基础。
定点突变的步骤
定点突变的步骤定点突变是一种在基因研究中超级酷的技术呢。
咱就先来说说最开始要做的事儿吧。
得先确定好你要突变的那个基因序列。
这就像是在一大串密码里，找到你想搞点小把戏的那一小段密码一样。
这个基因序列的选择可不能马虎，得是对整个研究或者实验有重要意义的部分哦。
接着呀，就得设计突变引物啦。
这引物就像是一把特殊的小钥匙，能精准地找到你想要突变的地方。
设计引物的时候可讲究了，要考虑好多因素，什么碱基互补啦，长度合适啦之类的。
就像你搭配衣服，得考虑颜色搭不搭，款式合不合适一样。
有了引物之后呢，就是进行PCR反应啦。
这PCR反应就像是一个小小的基因复印机，不过呢，它可是按照你设计的引物来工作的。
它会把包含你要突变位置的那一段基因大量地复制出来，而且在这个过程中，因为有引物的引导，就会在复制的时候产生你想要的突变。
这个过程就像是一场小小的基因魔法秀，在分子的小世界里悄悄地改变着基因的模样。
PCR反应完了之后，还得对产物进行验证呢。
这就好比做完了一件艺术品，你得检查检查有没有瑕疵。
验证的方法有不少，像是测序之类的。
测序就像是给基因拍个高清照片，然后仔细看看每个碱基是不是都在正确的位置，有没有按照我们想要的突变发生了改变。
要是验证通过了，那就可以把这个突变后的基因放到细胞或者生物体里啦。
这就像是把一个新的小零件装到一个大机器里，然后看看这个新零件会给大机器带来什么样的变化。
也许会产生一些意想不到的效果，也许会按照我们预想的那样改变细胞或者生物体的某些特性。
定点突变虽然听起来很复杂，但就像做一道超级复杂的菜一样。
只要一步一步按照正确的步骤来，精心准备每一个材料，用心操作每一个步骤，最后就能做出一道让自己满意的“基因大餐”啦。
这过程中虽然可能会遇到不少小麻烦，就像做菜的时候盐放多了或者火候没掌握好，但只要不断调整，总会得到想要的结果的。
而且每一次成功的定点突变，都像是打开了一扇通往新知识新发现的小窗户，让人特别有成就感呢。
基因定点突变名词解释
基因定点突变名词解释嘿，咱今儿来唠唠基因定点突变这档子事儿！你说基因就像是生命的密码本，那基因定点突变呢，就好比是给这个密码本来了个精准的修改。
咱就打个比方哈，好比一个大机器，基因就是让这个机器运转的各种零件和程序。
那基因定点突变呢，就是咱专门挑出其中一个小零件或者一小段程序，给它变一变。
这一变可不得了，可能整个机器的运行状态就不一样啦！想象一下，本来一个生物有着特定的性状，就像一只兔子一直是白色的。
但通过基因定点突变，嘿，说不定这兔子就能变成灰色的或者其他颜色啦！这多神奇呀！基因定点突变可不是随便乱改的哦，这得非常精细、非常小心才行。
就跟咱修钟表似的，得用特别小的工具，特别仔细地去摆弄那些小零件。
一个不小心，可能整个钟表就不走了，或者走得不准啦！它的作用可大着呢！可以用来研究基因的功能呀。
咱想知道某个基因到底是干啥用的，那就给它变一变，看看生物会有啥变化，不就清楚啦？而且在医学上也很重要呢！比如说有些疾病是因为基因出了问题，那咱通过基因定点突变，说不定就能找到治疗的办法呢。
在农业上也有用武之地呀！可以让农作物变得更抗病虫害，产量更高。
这就像是给农作物来了个超级进化，让它们变得更强壮、更厉害！不过呢，这事儿也不是那么容易的。
就像走钢丝一样，得稳稳当当的，稍有偏差可能就会出大乱子。
而且也不是说变了就一定能达到咱想要的效果，有时候可能会有意想不到的结果哦。
那怎么实现基因定点突变呢？这就得靠那些厉害的科学家们啦！他们有各种高科技的手段和工具，就像孙悟空有金箍棒一样，能把基因这个“妖怪”给制服咯！总之呢，基因定点突变是个很有意思、很有挑战性的领域。
它就像是打开生命奥秘大门的一把钥匙，让我们能更深入地了解生命的奇妙之处。
咱可得好好研究研究，说不定哪天就能给我们的生活带来翻天覆地的大变化呢！可不是嘛！。
定点突变讲解学习
1.1.1 基因定点突变简介（INTRODUCTION ）定点突变（site-directed mutagenesis ）是指通过聚合酶链式反应（PCR ）等方法向目的DNA 片段（可以是基因组，也可以是质粒）中引入所需变化，包括碱基的添加、删除、点突变（单点/多点）等。
定点突变能迅速、高效的提高DNA 所表达的目的蛋白的性状及表征，是基因研究工作中一种非常有用的手段。
原理上分两种：1. 搭桥法（重叠PCR ）2. 一步法（全质粒PCR ） ► 搭桥法（重叠PCR ）定点突变搭桥法共需要两对引物（两端引物，中间引物）,三次PCR ，其中前两次PCR 可同时完成，原理如图一所示：两次PCR 的产物回收，作为模板加上两端引物primer F 和primer R 进行PCR3。
PCR1：以primer F 和primer Rm 为引物对扩增PCR2：以primer R 和primer Fm 为引物对扩增实验步骤（PROCEDURE ）1. 两对引物的Tm 值都应相当。
两端PCR 引物参照普通引物设计并无特殊要求。
所需引入突变包含在中间引物互补区域内 （需要在两条引物上均引入点突变），请勿将突变位点置于引物3’ 末端且突变位点距离3’ 端最少要有15个碱基，因为有非匹配碱基的存在，太短会导致引物与模板无法结合。
2. 对于一对中间引物的设计，如左图所示（高亮处是突变碱基），两引物间可以是完全互补，也可是部分互补。
但两引物间互补部分的Tm 值不能太低（太低导致PCR3无法配对延伸）。
搭桥法定点突变3.PCR：PCR1：以primer F 和primer Rm 为引物对扩增；PCR2：以primer R 和primer Fm 为引物对扩增。
两次PCR的产物回收，作为模板加上两端引物primer F和primer R 进行PCR3。
（注意前两次不能使用taq聚合酶，因为taq在产物3’ 端多加一个A，导致后续的PCR3出现移码突变）4.克隆：回收PCR3产物，酶切，连接，转化。
基因定点突变全攻略
基因定点突变全攻略一、定点突变得目得把目得基因上面得一个碱基换成另外一个碱基.二、定点突变得原理定点突变就是指通过聚合酶链式反应(PCR)等方法向目得DNA片段（可以就是基因组，也可以就是质粒)中引入所需变化（通常就是表征有利方向得变化）,包括碱基得添加、删除、点突变等。
定点突变能迅速、高效得提高DNA所表达得目得蛋白得性状及表征，就是基因研究工作中一种非常有用得手段。
体外定点突变技术就是研究蛋白质结构与功能之间得复杂关系得有力工具，也就是实验室中改造/优化基因常用得手段。
蛋白质得结构决定其功能,二者之间得关系就是蛋白质组研究得重点之一。
对某个已知基因得特定碱基进行定点改变、缺失或者插入,可以改变对应得氨基酸序列与蛋白质结构，对突变基因得表达产物进行研究有助于人类了解蛋白质结构与功能得关系,探讨蛋白质得结构/结构域。
而利用定点突变技术改造基因：比如野生型得绿色荧光蛋白（wtGFP)就是在紫外光激发下能够发出微弱得绿色荧光,经过对其发光结构域得特定氨基酸定点改造,现在得GFＰ能在可见光得波长范围被激发（吸收区红移),而且发光强度比原来强上百倍,甚至还出现了黄色荧光蛋白,蓝色荧光蛋白等等。
定点突变技术得潜在应用领域很广,比如研究蛋白质相互作用位点得结构、改造酶得不同活性或者动力学特性,改造启动子或者DNＡ作用元件,提高蛋白得抗原性或者就是稳定性、活性、研究蛋白得晶体结构，以及药物研发、基因治疗等等方面．通过设计引物,并利用ＰCR将模板扩增出来,然后去掉模板，剩下来得就就是我们得PCR 产物,在PCＲ产物上就已经把这个点变过来了,然后再转化,筛选阳性克隆，再测序确定就行了．三、引物设计原则引物设计得一般原则不再重复.突变引物设计得特殊原则:(1）通常引物长度为2５~４5 bp,我们建议引物长度为3０~35 bp。
一般都就是以要突变得碱基为中心,加上两边得一段序列,两边长度至少为1１—12 bｐ。
若两边引物太短了，很可能会造成突变实验失败，因为引物至少要１1-1２个ｂp才能与模板搭上,而这种突变ＰＣR要求两边都能与引物搭上，所以两边最好各设至少12个bp，并且合成多一条反向互补得引物。
基因定点突变技术原理
基因定点突变技术原理
基因定点突变技术是一种用于改变特定基因序列的方法。
它可以被用于研究基因功能，以及开发新的基因治疗方法。
基因定点突变技术的原理是利用特定的酶切位点或特异性识别序列，将新的DNA序列插入到目标基因中。
这种技术通常使用质粒或病毒载体来将新的DNA序列导入目标
基因中，然后使用细胞转染或转化的方法将质粒或病毒载体导入细胞中，从而实现对目标基因的改变。
基因定点突变技术不仅可以用于改变单个基因的序列，还可以被用于删除或插入多个基因。
这种技术的应用非常广泛，包括基因治疗、基因工程以及基因组学研究等领域。
但是基因定点突变技术也存在一些挑战，包括技术成本高、效率低、难以操作等问题。
因此，不同的实验室和公司都在开发新的基因定点突变技术，以突破这些技术难关。
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基因定点突变全攻略
基因定点突变全攻略一、定点突变得目得把目得基因上面得一个碱基换成另外一个碱基.二、定点突变得原理定点突变就是指通过聚合酶链式反应(PCR)等方法向目得DNA片段（可以就是基因组，也可以就是质粒)中引入所需变化（通常就是表征有利方向得变化）,包括碱基得添加、删除、点突变等。
定点突变能迅速、高效得提高DNA所表达得目得蛋白得性状及表征，就是基因研究工作中一种非常有用得手段。
体外定点突变技术就是研究蛋白质结构与功能之间得复杂关系得有力工具，也就是实验室中改造/优化基因常用得手段。
蛋白质得结构决定其功能,二者之间得关系就是蛋白质组研究得重点之一。
对某个已知基因得特定碱基进行定点改变、缺失或者插入,可以改变对应得氨基酸序列与蛋白质结构，对突变基因得表达产物进行研究有助于人类了解蛋白质结构与功能得关系,探讨蛋白质得结构/结构域。
而利用定点突变技术改造基因：比如野生型得绿色荧光蛋白（wtGFP)就是在紫外光激发下能够发出微弱得绿色荧光,经过对其发光结构域得特定氨基酸定点改造,现在得GFＰ能在可见光得波长范围被激发（吸收区红移),而且发光强度比原来强上百倍,甚至还出现了黄色荧光蛋白,蓝色荧光蛋白等等。
定点突变技术得潜在应用领域很广,比如研究蛋白质相互作用位点得结构、改造酶得不同活性或者动力学特性,改造启动子或者DNＡ作用元件,提高蛋白得抗原性或者就是稳定性、活性、研究蛋白得晶体结构，以及药物研发、基因治疗等等方面．通过设计引物,并利用ＰCR将模板扩增出来,然后去掉模板，剩下来得就就是我们得PCR 产物,在PCＲ产物上就已经把这个点变过来了,然后再转化,筛选阳性克隆，再测序确定就行了．三、引物设计原则引物设计得一般原则不再重复.突变引物设计得特殊原则:(1）通常引物长度为2５~４5 bp,我们建议引物长度为3０~35 bp。
一般都就是以要突变得碱基为中心,加上两边得一段序列,两边长度至少为1１—12 bｐ。
若两边引物太短了，很可能会造成突变实验失败，因为引物至少要１1-1２个ｂp才能与模板搭上,而这种突变ＰＣR要求两边都能与引物搭上，所以两边最好各设至少12个bp，并且合成多一条反向互补得引物。
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大引物PCR megaprimer PCR
1.用引物P1和含突基因的 引物P2扩增模板DNA产 生双链大引物(PCR1).
2.纯化大引物，去除PCR1 剩下的引物和脱氧核苷酸， 同时加入引物P3，形成带 突变基因的双链DNA
3. 扩增带有突变基因的双 链DNA
三种经典基因定点突变方法比较
1 寡核苷酸引物介导的定点突变法 其优点是保真度比PCR突变法高，经过改进后使该方法突变成功率大大提高 缺点是操作过程环节复杂、周期长， 而且在克隆待突变基因时会受到限制性 酶切位点的限制。
2.通过PCR1和PCR2反应扩增出两种靶基因片 段。
3.用DNA聚合酶补平缺口，形成全长双链 DNA，进行PCR3扩增。
4.最后用引物F2和R2扩增出带有突变位点的 全长DNA片段(PCR4)
重叠PCR小结
优点：几乎没有特殊限制，而且成功率高
缺点： 需要2对引物， 进行3次PCR，并且需要对中间产物进行 纯化
4. 产生野生型、突变型的同源双链分子。可 以用限制性酶切法、 斑点杂交法和生物学法
来初步筛选突变的基因；
5.对突变体DNA基因进行序列分析。
局限性：异源双链DNA分子并非真正异源 突变体子代中突变碱基被错配修复体系修复
提高寡核苷酸介导的基因突变效率方法介绍
这是1985年由 Kunkel等人建立的一种改进的寡核苷酸介导的基因 突变方法。
03
PART 01
第三部分
标题文字内容
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标题内容文字
2014年12月
标题内容文字
2013年5月
标题内容文字
2013年8月
标题内容文字
2014年4月
标题内容文字
2014年5月
标题内容文字
步骤 1.将复制型的M13噬菌体转染到脱氧尿苷酸三磷酸酶和尿嘧啶脱糖 苷酶双缺陷的E.coli (dut-, ung-) 菌株中，使U取代T代入DNA链 中（一般每个重组体20-30个）
2.以此种带U的DNA链为模板，用带突变碱基的寡核苷酸引物进行 复制，产生异源双链。
3. 将此异源双链转化到ung＋(尿嘧啶脱糖苷酶）菌株中生长， 含U 的模板链被破坏， 从而使子代DNA链大部分（～80%）含突变碱基 序列
dut- (脱氧尿苷酸三磷酸酶缺乏) 能够积累尿嘧啶残基.，ung- (尿嘧啶脱糖苷 酶) 使得无法移除尿嘧啶残基
KunKel小结
1.用此种方法产生的突变体优势在于不必利用核苷酸探针标记 来筛选阳性噬菌斑，可直接通过序列分析来确定突变体，这样 就免除了繁杂的杂交程序。
2.此法的成功关键， 是要得到好的含U单链模板DNA（可用含 有目标基因的M13双链DNA载体感染E. coliCJ236品系，此为 大肠杆菌脱氧尿苷酸三磷酸酶和尿嘧啶脱糖苷酶双缺陷 dutung-菌株）
标题内容
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诚信铸就品质
创新引领未来
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2.盒式突变 盒式突变法具有比前两者简单易行、突变效率高等优点， 还可以在一对限制 酶切位点内一次突变多个位点。缺点是合成多条引物的成本较高。另外，在 一般情况下，在靶DNA 片段的两侧往往难以满足存在一对限制性酶切位点的 要求， 限制了该方法的广泛应用。
3.PCR 介导的定点突变法 其优点是操作较简单，突变的成功率可达100％。但它亦有两个缺点：①后 续工作较复杂， PCR扩增产物通常需要连接到载体分子上，然后才能对突变 的基因进行转录、转译等方面的研究 ；② TaqDNA聚合酶的保真性偏低；因 此PCR方法产生的DNA 片段要经过核苷酸序列测定，方可确证有无发生其它 突变。
直接用反应混合物转染
分级退火， 冰浴稳固异 源双链再加T4连接酶
经酚-仿抽提后再进行转染
转染效率： 3个空斑
转染效率：78个空斑
02
盒式突变cassette mutagenesis
1.1985年由Wells J.A提出的一种基因修饰技术
2.为利用一段人工合成的具有突变序列的寡核苷酸片段，即所谓的 寡核苷酸盒(oligonucleotide cassette)，取代野生型基因中的相应序列。
原理为在正常情况下， 尿嘧啶脱糖苷酶(ung)可以去除掺入DNA中的尿嘧啶 残基。 但在ung-的菌株中，此酶失活。 因此在大肠杆菌脱氧尿苷酸三磷酸酶和尿嘧啶脱糖苷酶双缺陷dut-ung-菌株 中生长的M13噬菌体的DNA中将含有20-30个尿嘧啶残基。 用这些噬菌体感 染ung＋菌株， 尿嘧啶被迅速去除， DNA链遭到破坏， 感染力下降约5个数 量级
3.然而， 并非所有变异区附近都能找到合适的限制位点， 如果不存在 限制位点， 就要用寡核苷酸指导的定位诱变引入限制位点。
02
盒式突变cassette mutagenesis
03
PCR介导的基因突变PCR site-directed mutagenesis
1.重叠延伸PCR法 2.大引物PCR法
提高寡核苷酸介导的基因突变效率方法介绍
Oligo诱导突变的改进方法
1998年由武汉大学叶林柏等人对Oligo 诱导突变的方法进行了改进，2-3个核 苷酸突变替换频率可达80%-85%，及 时需要有道4-5氨基的缺失，突变频率 也高达40%-50%
方法对比
原KunKel
DNA聚合酶和T4连接酶同步加入
方法介绍 1.寡核苷酸介导的基因突变
02 2.盒式突变
3.PCR介导的基因突变 4CRISPR/Cas介导基因突变
寡核苷酸介导的基因突变
寡核苷酸介导的基因突变是由加 拿大人迈克尔·史密斯 Michael Smith在1978所提出，因此而获得 了1993年诺贝尔化学奖。这一方法 被用来在体外对已知的DNA片断内 的核苷酸进行转换、增删的突变。
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重叠延伸PCR法 overlap extension PCR
重叠延伸PCR技术(SOE PCR)是指在PCR技术的基础上，采用具有互补末端的引物 使PCR产物形成了重叠链，通过重叠链的延伸，将不同来源的片段重叠拼接起来的一项 新技术。该技术可以很快获得依靠其它限制性内切酶消化的方法难以得到的产物，其成 功的关键是重叠互补引物的设计。 重叠延伸PCR在基因的定点突变，长片段基因的合 成、基因敲除以及目的基因的扩增有重要的作用。
标题 内容
已完成
未完成
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重昼延伸PCR技术由于使用了具有互补末端的引物，使PCR产物形成了重叠链，从而 在随后的扩增反应中通过重叠链的延伸，将不同来涌的扩增片段重叠拼接起来。 可简 单迅速的将两个DNA一片段连在 起，用于嵌合基因的构建。
重叠延伸PCR法 overlap extension PCR
1.引物对A（正向诱变引物F1和反向引物R1) 和引物对B（正向引物F2和反向诱变引物R2) 退火
方
寡核苷酸介导的基因突变
法 1.将待突变基因插入到突变载体（M13噬菌 体）上，制备含突变基因的单链模板；
2. 将合成的寡核酸片段与单链模板退火， 在 DNA聚合酶，连接酶的作用下合成互补的双 链DNA
3. 将双链DNA转化大肠杆菌， 获得突变基因 （转化大肠杆菌是指将重组DNA分子导入大 肠杆菌受体细胞进行复制,增殖和表达）
基因定点突变技术介绍
临床医学院
谢睿晋
目录
01
相关定义
方法介绍
02
定义 基因定点突变是一种分子生物学方法，用于对基因和任何基 因产品的DNA序列进行具体和有意的改变，包括碱基的添加、 删除、点突变等。定点突变能迅速、高效的提高DNA所表达的 目的蛋白的性状及表征，是基因研究工作中一种非常有用的手 段。