基因定点诱变常用方法
基因定点突变方法及其应用
基因定点突变方法及其应用
基因定点突变是指在基因组中特定的位置发生的变异事件。
这些定点
突变可以是单个碱基的替代、插入或删除，也可以是染色体片段的重排和
结构变化。
基因定点突变是遗传学和分子生物学研究中的重要技术，具有
广泛的应用前景。
在基因定点突变的研究中，常用的方法包括基于随机突变和基于定点
突变的方法。
一、基于随机突变的方法：
1.化学诱变：通过化学物质如亚硫酸乙基甲酯(EMS)或N-亚硝基-N-
乙基脲(ENU)等诱导基因组范围内的突变。
这些突变通过对群体进行筛选
和筛选，从而找到目标基因的突变。
2.辐射突变：用射线如X射线、γ射线，或放射性物质如乙烯基腈，等辐射处理生物体，以诱导其基因组上的随机突变。
基于随机突变的方法广泛应用于物种、疾病、发育和进化等研究中。
它们可以帮助揭示基因功能的重要性和与特定物种和表型相关的基因。
二、基于定点突变的方法：
1.基因敲除/敲入：通过合成受损的DNA片段或外源DNA片段，将其
导入到目标基因中，从而造成其功能异常或置换为新的基因序列。
这种方
法可用于明确或验证基因的功能，并探索特定突变的表型影响。
基因定点突变技术.
四、展望
定点突变技术可以高效地应用于ＤＮＡ缺失改造、 蛋白质工程和酶等多个研究领域。它不仅加深人们对 蛋白质、酶等物质的了解，而且也为进一步研究这些 物质提供技术支持。另外，突变技术可以对某一特性 相关位点同时进行突变，这就极大地提高了获取突变 子的效率，避免了高强度的筛选工作，同时也节约了 大量的时间和资金。突变技术在蛋白质工程研究将会 继续保持迅猛势头，且在医学、农业科学、肿瘤研究、 基因表达与调控等领域，突变技术的应用也越来越广 阔。因此，我们有理由相信突变技术在未来会有光明 的应用前景。
基因定点突变技术
目录
一、定点突变简介
二、基因定点诱变 三、基因定点突变应用
四、展望
一、定点突变简介
定点突变（site-directed mutagenesis） 技术可以有目的性地在已知ＤＮＡ 序列中 取代、插入或缺失一定的核苷酸片段，可以 有目的或针对性的改变ＤＮＡ序列中的碱基 次序；它不仅可以用来阐明基因的调控机理， 也可以用来研究蛋白质结构与功能之间的关 系。
1、寡核苷酸盒式诱变
（Cassette mutagenesis）
利用一段人工合成的具有突变 序列的寡核苷酸片段，即寡核苷酸 盒，取代野生型基因中的相应序列。
ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ
2、寡核苷酸引物诱变
使用化学合成的含有突变碱基的寡 核苷酸片段作为引物，启动单链DNA 分子进行复制，随后这段寡核苷酸引 物便成为了新合成DNA子链的一个组 成部分，因此所产生出来的新链便具 有已发生突变的碱基序列
1、突变技术在蛋白质工程中的应用
突变技术在蛋白质工程中的应用 非常广泛和成功。此技术不仅是蛋白 质定向改造的强有力工具，而且也是 研究蛋白质结构和功能关系的重要方 法。
基因定点诱变技术与DNA与蛋白质互作及定点突变介绍
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酵母单杂交的基本 原理示意图
从 拟 南 芥 cDNA 文 库 中 筛选与顺式元 件DRE结 合的 转录因子示意图。
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三）凝胶阻滞实验 （electrophoretic mobility shift assay, EMSA）
六）体内足迹试验
• 用适量DMS处理完整的游离细胞，使染色 质中的G残基甲基化，提取DNA并加入六氢 吡啶切割DNA链。与对照的裸露DNA经甲基 化处理后形成42
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七）染色质免疫沉淀实验 Chromatin Immunoprecipitation(ChIP) Assay
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• EMSA • 还被
用于 研究 与蛋 白质 相结 合的 DNA • 序列 的特
异型。
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四）DNaseI足迹试验 （DNase I foot printing）
• 主要步骤： ① 用32P标记DNA双链末端，并用RE切去一端； ② 加入细胞特定周期蛋白质提取物，温育； ③ 加入适量DNaseI或硫酸二甲酯-六氢吡啶，使 DNA链发生断裂。 这一反应中，DNaseI或硫酸二甲酯的用量非常关键， 要保证一条链只发生一次断裂！ ④沉淀DNA（包括与DNA相结合的蛋白质）； ⑤进行DNA凝胶分析。
真核生物DNA序列（非编码序列）和被 转录的结构基因距离较近，和转录调控有关。
A 启动子（启动子上游近侧序列） B 增强子 C 沉默子
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启动子（promtor）在转录起始点上游约100－200bp以内， 每个元件长度约为7－20bp，决定RNA聚合酶Ⅱ转录起始 点和转录频率的关键元件。
第七章 定点诱变
两种活性结合产生平端或较短5’突出端的缩短 分子
利用BAL 31核酸酶制备嵌套缺失突变体
处理不同时间
Klenow DNA聚合酶 补平末端
与克隆载体连接
3．DNase Ⅰ 的消化
一种内切酶，可优先水解 ds or ss DNA 中的 嘧啶核苷酸 。
基因A P2
P1
基因B
5. 大引物PCR诱变法
大引物PCR法由Kammann M等人于1989
年提出,随后经Sarkar G和Sommer S S等人加 以改进。
该方法需2个侧翼引物和1个内部诱变引物, 经过2轮PCR获得突变的全长DNA。
第1轮PCR用诱变引物和1个侧翼引物,扩增 产物经凝胶纯化后作为大引物再与另一侧翼 引物进行第2轮PCR,产生全长的突变的DNA。
第七章f cloned DNA
突变是研究基因结构与功能的最基本的手段
经典的方法：分离自发突变体
用物理、化学诱变剂处理活体
诱变-整个生物体-目的基因上的突变极其有限
体外诱变(in vitro mutagenesis)：对克隆化的 DNA进行诱变处理可得到经典诱变所能得到 的所有种类的突变
突变类型: 单个碱基的置换 简单的插入或缺失 系统的缺失、插入或成串碱基的置换
第三节 寡核苷酸介导的定点诱变 p176
基因的定点诱变（site-directed mutagenesis）: 使已克隆基因或DNA片段中的任何一个特定碱 基发生取代、插入或缺失突变的过程
需一个或多个含突变碱基的诱变寡核苷酸作为 引物进行DNA复制，使寡核苷酸引物成为新合 成的DNA子链的一部分
基因定点诱变技术与DNA与蛋白质互作及定点突变介绍
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• EMSA • 还被
用于 研究 与蛋 白质 相结 合的 DNA • 序列 的特
异型。
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四）DNaseI足迹试验 （DNase I foot printing）
• 主要步骤： ① 用32P标记DNA双链末端，并用RE切去一端； ② 加入细胞特定周期蛋白质提取物，温育； ③ 加入适量DNaseI或硫酸二甲酯-六氢吡啶，使 DNA链发生断裂。 这一反应中，DNaseI或硫酸二甲酯的用量非常关键， 要保证一条链只发生一次断裂！ ④沉淀DNA（包括与DNA相结合的蛋白质）； ⑤进行DNA凝胶分析。
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酵母双杂交的基本原理示意图 25
二） 酵母单杂交系统
• 酵母单杂交系统是上世纪90年代中发展起来的研 究DNA-蛋白质之间相互作用的新技术，可识别稳 定结合于DNA上的蛋白质，在酵母细胞内研究真核 生物中DNA-
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一）酵母双杂交系统 （yeast two-hybrid system)
1. 原理：
• 真核生物的转录因子大多是由两个结构上分开、 功能上独立的结构域组成的，即 DNA结合域（BD） 和转录激活域（AD）。
• 单独地BD能与特定基因地启动区结合，但不能激 活基因的转录，而由不同转录因子的BD和AD所形 成的杂合蛋白却能行使激活转录的功能。
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4）一旦酵母细胞中表达的“诱饵”蛋白与“猎物” 载体中表达的某个蛋白质发生相互作用， 不同转录调控因子的AD和BD结构域就会 被牵引靠拢，激活报告基因表达。
5）分离有报告基因活性的酵母细胞，得到所 需要的“猎物”载体，获得与已知蛋白相互 作用的新基因。
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AD:Activation domain DNA-BD:Binding domain
基因定点突变全攻略
基因定点突变全攻略一、定点突变得目得把目得基因上面得一个碱基换成另外一个碱基.二、定点突变得原理定点突变就是指通过聚合酶链式反应(PCR)等方法向目得DNA片段（可以就是基因组，也可以就是质粒)中引入所需变化（通常就是表征有利方向得变化）,包括碱基得添加、删除、点突变等。
定点突变能迅速、高效得提高DNA所表达得目得蛋白得性状及表征，就是基因研究工作中一种非常有用得手段。
体外定点突变技术就是研究蛋白质结构与功能之间得复杂关系得有力工具，也就是实验室中改造/优化基因常用得手段。
蛋白质得结构决定其功能,二者之间得关系就是蛋白质组研究得重点之一。
对某个已知基因得特定碱基进行定点改变、缺失或者插入,可以改变对应得氨基酸序列与蛋白质结构，对突变基因得表达产物进行研究有助于人类了解蛋白质结构与功能得关系,探讨蛋白质得结构/结构域。
而利用定点突变技术改造基因：比如野生型得绿色荧光蛋白（wtGFP)就是在紫外光激发下能够发出微弱得绿色荧光,经过对其发光结构域得特定氨基酸定点改造,现在得GFＰ能在可见光得波长范围被激发（吸收区红移),而且发光强度比原来强上百倍,甚至还出现了黄色荧光蛋白,蓝色荧光蛋白等等。
定点突变技术得潜在应用领域很广,比如研究蛋白质相互作用位点得结构、改造酶得不同活性或者动力学特性,改造启动子或者DNＡ作用元件,提高蛋白得抗原性或者就是稳定性、活性、研究蛋白得晶体结构，以及药物研发、基因治疗等等方面．通过设计引物,并利用ＰCR将模板扩增出来,然后去掉模板，剩下来得就就是我们得PCR 产物,在PCＲ产物上就已经把这个点变过来了,然后再转化,筛选阳性克隆，再测序确定就行了．三、引物设计原则引物设计得一般原则不再重复.突变引物设计得特殊原则:(1）通常引物长度为2５~４5 bp,我们建议引物长度为3０~35 bp。
一般都就是以要突变得碱基为中心,加上两边得一段序列,两边长度至少为1１—12 bｐ。
若两边引物太短了，很可能会造成突变实验失败，因为引物至少要１1-1２个ｂp才能与模板搭上,而这种突变ＰＣR要求两边都能与引物搭上，所以两边最好各设至少12个bp，并且合成多一条反向互补得引物。
基因的定点诱变
因为DNA复制酶有校正功能及DNA复制 后修复系统，正常大肠杆菌自发突变频 率较小。 与校正和修复有关的基因突变后细胞内 基因突变频率大大增加，这样的菌株叫 突变菌株。
流程： 把携带待突变基因的质粒转入增变菌株 扩增，------随机突变体库。 把该库的重组质粒转化到正常宿主中， 筛选鉴定突变体。
寡核苷酸介导的定点诱变
①基本原理： 使用化学合成的含有突变碱基的 寡核苷酸片段作为引物，启动单链DNA 分子进行复制，随后这段寡核苷酸引物 便成为了新合成DNA子链的一个组成部 分，因此所产生出来的新链便具有已发 生突变的碱基序列
作为诱变剂的寡核苷酸序列：
人工合成一段寡核苷酸序列，该序列中 除了所需的碱基突变外，其余的则与目 的基因编码链的特定区段完全互补 错配碱基的位置应设计在寡核苷酸分子 的中央部位，每侧至少10-15个碱基 通常采用化学合成 无回文，重复和自身互补序列
即使获得期望表型的突变体，无法保证 突变确实发生在目的基因上 在基因克隆和核酸测序技术发展之前， 无法知道基因中突变的位置和性质
Directed evolution （定向进化或直接进化）
对目的基因人为制造大量突变，然后 按照特定的需要和目的，给予选择压力， 反复诱变，循环筛选，将满足要求的、适 合特定目的的分子筛选出来，获得满足需 要的性能改良的蛋白质，从而实现在试管 中分子水平的模拟进化。
基因家族的改组
交错延伸重组 图10-5
以两个以上的有一定同源性的DNA片段 为模板进行PCR反应，通过交换模板机制 实现DNA序列的重新组装。 不需要DNaseI切割DNA，简化了程序。
随机引发重组 图10-6
分子生物学--定点诱变与蛋白质工程课件
❖ N端-----------笨丙-天冬-----------谷-甘-------------- C端 多肽链
三、定点诱变的原理
定点诱变原理示意图
❖ The Nobel Prize in Chemistry 1993
"for contributions to the developments of methods within DNA-based chemistry"
2.诱变过程
1)合成含有目的 基因的正链DNA； 2)合成含有特殊 突变碱基的引物； 3）制备异源双链 DNA（右图）； 4）富集和转化双 链DNA分子； 5）筛选突变体并鉴定
（二）Kunkel定点诱变法
❖ 体外DNA合成往往是不完全的，所以部分合 成的DNA分子必须通过蔗糖密度梯度离心除 去,获得纯化的突变DNA。
❖ 理论上来说，DNA是半保留复制的，应用寡 核苷酸定点诱变时，所形成的噬菌体中携带 突变基因的应为一半。但实际上，由于技术 上的原因通常只有1-5%的噬菌斑含有突变基 因的噬菌体。
❖ 因此，为了获得更多含有突变噬菌体的噬菌 斑，必须提高突变体的比率。目前已有多种 改良的寡核苷酸定点诱变方法，此处将 Kunkel 1985年建立的方法做以简单介绍。
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(2) 大引物诱变:核心 是第一轮PCR产物为 第二轮PCR引物
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第四节 基因定点诱变
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2.4.1 盒式诱变 利用一段人工合成 的具有突变序列的 寡核苷酸片段取代 野生型基因中的相 应序列.
2.4.2 寡核苷酸引物诱变
使用化学合成的含有突变碱基
的寡核苷酸片段作引物,启动
单链DNA分子进行复制，随
后这段寡核苷酸引物便成为了
新合成DNA子链的一个组成 部分。
寡核苷酸引物诱变过程
正链DNA合成 突变引物合成 异源双链DNA分子制备 闭环异源双链DNA分子富集 转化 突变体筛选 寡核苷酸引物诱变法的局限性
异源双链DNA分子并非真正异源 突变体子代中突变碱基被错配修 复体系修复
提高寡核苷酸引物诱变突变效率的方法 (1) Kunkel 定点诱变法: 1985年由 T.A.Kunkel发明 ung:尿嘧啶脱糖苷酶
(2) 硫代磷酸诱变法: 已知有些限制 酶不能切割硫代磷酸DNA分 子．在异源双链DNA分子制备 时，加入硫代核苷酸，使之掺 入突变链中．然后用前述酶切 割，并用外切酶局部消化后， 进行聚合反应，从而产生具有 定点突变的异源双链DNA
2.4.３ ＰＣＲ诱变 (1) 重组PCR定点诱 变:克服寡核苷酸引 物诱变能力仅限于5’ 端. 特点:经3轮PCR反 应,一对互补的带有 突变碱基的内侧引 物和2个外侧引物