第七章 定点诱变
第七章 定点诱变
3. 重叠延伸PCR诱变法 Overlap extension
对于两个具有部分重叠序列的 DNA 片段，在 经过变性和复性后，两个 DNA 片段之间通过 同源序列形成部分杂合的双链，在 DNA 聚合 酶作用下，杂合双链可互为引物和模板，引 导 DNA 的合成，从而形成杂合 DNA 双链
该方法需要4个引物,
再用通用引物扩增诱变的全长的DNA
5’
3’
3’
5’
4. 重叠延伸剪接法
Splicing by overlap extension, SOE
可用于将两个 DNA 片段在所期望的位点进行连接。 核心:设计一对融合寡核苷酸引物
包括两个步骤：设计一个寡聚体引物，其序列包含两个 部分，“引发”和“重叠”部分，引发部分在 3’ 末端， 起引物作用；重叠部分在 5’ 末端。与待融合的 DNA 片 段序列互补。
（二）位点选择诱变 Altered Sites in vitro Mutagenesis System 使用了2个寡核苷酸引物 一个是用来引入突变的突变引物 一个是用来选择用的
选择性引物可用来恢复有缺陷的抗生素抗 性基因，同时可用来选择引入突变的DNA链
1.将目的片段克隆到载体 2.得到重组质粒 3.模板DNA碱变性，与突变引物、氨苄青霉素抗性 基因修复引物（amproligo）和四环素抗性基因敲除 引物（tetsoligo）同时退火 4.用T4 DNA聚合酶和T4 DNA连接酶合成突变链 5.转化大肠杆菌ES1301菌株（mutS），用氨苄青霉 素筛选 6.纯化质粒，转化大肠杆菌JM109，用氨苄青霉素 筛选 7.必要的话，影印一份平板，鉴定四环素敏感的克 隆子，从而获得突变体 8.再做一轮诱变，修复四环素抗性基因并敲除氨苄 青霉素抗性基因
定点诱变技术
How DNA shuffling works ？
一、单基因和基因家族的重组装
Single gene shuffling
. .. . ....... library of point mutants
Similar mutants generated by error-prone PCR, random and site-directed mutagenesis
在正常情况下，尿嘧啶Ｎ-糖基化酶(ung+)可以去除掺 入DNA中的尿嘧啶残基。但 在ung-的菌株中，此酶失活。
在大肠杆菌dut- ung-菌株 中生长的M13噬菌体的单链基 因组DNA中将含有20-30个尿 嘧啶残基。用这些噬菌体感染 ung+菌株，尿嘧啶被迅速去 除，DNA链遭到破坏，感染 力下降约5个数量级。
牛乳糖酶到岩藻糖苷酶的直接进化（JI-HU ZHANG等，1997）
How DNA shuffling works ？
二、随机引物PCR(RPR)和重组装
多功能氧化酶的定向进化 （Hikaru Suenaga等,2001）
How DNA shuffling works ？
三、交错延伸PCR突变法(StEP)
枯草杆菌蛋白酶E热稳定性的分子进化 （Huimin Zhao等，1999）
进化的热稳定性枯草芽孢杆菌蛋白酶E的突变谱系
正面
反面
进化后的枯草杆菌蛋白酶E
芽孢杆菌脲酸酶的定向 进化 （Su-Hua Huang等,2004）
定点突ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ的研究意义
1.对调控区进行突变
研究基因结构与功能之间的关系
2. 对编码基因进行突变
PCR介导的基因突变
在基因5’和3’末端产生突变 重叠延伸PCR 大引物PCR法
第七章 诱变育种
第七章诱变育种诱变育种是利用理化因素诱发变异，再通过选择育成新品种的方法。
第一节诱变育种的成就及特点一、诱变育种的成就二、诱变育种的特点优点1. 提高突变率、扩大突变谱突变率：突变体占总个体数的百分率。
突变谱：各种突变类型组成突变谱。
2. 有效地改良个别性状诱变多为点突变、改变一两个基因，对主效基因控制的性状较有效，如：矮秆、早熟、抗病性。
3. 缩短育种年限诱发的变异大多为一个或少数几个主效基因的改变，稳定较快。
第二节常用物理诱变剂及其处理方法一、物理诱变剂的类别与性质紫外线X射线Γ射线粒子辐射电子束激光离子注入航天搭载航天搭载（航天育种或太空育种）育成的品种：水稻农垦58搭载卫星丰产品系ZR9搭载高空气球航育1号麦类扬麦5号搭载卫星小麦新品系蔬菜龙椒2号搭载高空气球卫星87-2离子束诱变育种离子注入引起生物产生变异，对改良数量性状效果显著。
目前在农作物诱变育种方面，离子注入改良的范围几乎涉及所有主要粮食和经济作物。
育成新品种：水稻品种 D9055和S9042小麦品种皖麦32蔬菜品种鲁番茄7号二、物理诱变剂处理方法（一）诱变处理的材料1、种子2、绿色植株3、花粉4、子房5、合子和胚细胞6、营养器官7、离体培养中的细胞和组织外照射 ---- 种子等所受的辐射来自外部的辐射源。
急性照射----采用较高的剂量率进行短时间的处理。
慢性照射----用钴（或铯）圃，每天将钴（或铯）源升到地面进行一定时间的慢性照射。
内照射---将辐射源引入生物体组织和细胞内进行照射的一种方法。
利用放射性同位素32P、35S、14C或65Zn的化合物，配成溶液进行浸渍种子，或使作物吸收，或注射茎部。
内照射的主要方法：•浸泡法•注入法•施入法•合成法（三）辐射处理的剂量①不同的科、属、种和品种，其辐射敏感性差异很大。
敏感作物：豆科作物、玉米、黑麦中等敏感作物：禾本科作物及棉花钝感作物：十字花科、亚麻、红麻、烟草②不同器官和细胞及不同发育时期、不同生理状况敏感性有差异。
以DNA重组技术进行定点诱变(一)
因 为 所有 这 些 诱 变 因 子都
D N A
导人 细 胞或 噬菌 体 体 内
是 渗 人 细 胞 内与 的
.
发 生 作用 而 致 变
,
表达
最 后 可 以 通 过特 定 的 甄 别手 段 把 目
.
许多类诱变 因 子的 诱变机理 已探 明
,
的 克 隆子 挑 选 出 来
一 般情 况 下
.
目的 克
如紫 外 线 造 成 嚓 陡
之 间 形 成 二聚 休 配对
, ,
特 别 是 两个 相 邻 的
,
T
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局
。
( 即 目的 变 异 株 )
出 现 的 机 率非 常
于 是 此处 不 能与 对 方 链
而 使 下 一 轮 复 制 失 误 导 致变 异
DN A
;
叮
,
上 述 休 系 的 关 键 就 在 于 如何 对 离 体 的
D NA
陡类 化合 物 因 能嵌 人 距增 长
以
重 组 技 术 进 行 定 点 诱 变
一
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(
无 锡轻 工业 学 院
, ,
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武
,
长 期 以来
,
诱 变 一 直是 改 造 微 生 物
的基 因 或 目标 D N A
把这 一
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D N A i g
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片段
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培 养 出人 类 所 需 求 的 优 良 品 种 的 有 效 手 段
u
连 接 在 合适 的 克隆 载 体 ( C l
上
,
v e e
r
)
利 用 物理 或化 学 因子直 接 处理 微 生物
《诱变育种》PPT课件
四川省农科院的钴圃外貌
钴源遥控操作室
不同剂量钴辐射照射甘薯幼苗及成活表现
中子：不带电粒子，穿透力强，可直接进入细胞 核内，适于处理种子、植株的外照射。
多用于照射花粉、孢子、组织培养中产生的愈 伤组织等。通常以低压水银灯作为紫外线源。 有效波长为250~290nm（核酸吸收光谱区）。
其它物理诱变因素
激光 电子束、等
航天育种 (太空育种) :指利用返回式航天器和 高空气球等所能达到的空间环境对植物的诱变作 用以产生有益变异，在地面选育新种质、新材料， 培育新品种的农作物育种新技术。
2003年4月，经国家有关部门批准，航天育种工程项目正式 启动。（福建，2005年重大育种专项）
到目前为止，我国先后进行了13次70多种农作物的空间搭 载试验，在水稻、小麦、棉花、番茄、青椒和芝麻等作物上 诱变培育出30多个品种通过审定，还获得了一些罕见突变材 料。青椒：个头非常大，可当水果。水稻：福建农科院（特 优航一号，II优航一号）、华南农业大学（抗病材料）。
目前诱变育种已成为作物育种的重要方法之一。
特点
（1）优点 提高突变率，变异范围广。突变率可达3%，比 自然突变高100-1000倍。突变类型多，还可能产 生新基因。
对单一性状改良有效。如早熟性、株高等。 多为点突变和隐性突变，易稳定，育种年限短。
热中子，极早熟大豆哈75-222，比原品种早32 天；原丰早（ γ射线，早40天）；印度，热中子， 蓖麻早150天（270天→120天）；大麦白粉病抗 性基因mlo。
微生物的诱变育种
2.4 诱变剂及诱变剂量
2. 最适诱变剂量的选择
(1) 使所希望得到的突变 株在存活群体中占有最 大的比例。 (2) 最大形态变异率的 剂量不一定是诱发正变 的最适剂量。
2.4 诱变剂及诱变剂量
2. 最适诱变剂量的选择
(3) 诱变剂对产量的诱变作用，大致趋向是：处理剂量大，杀菌
率高(90～99％)，在单位存活细胞中负变菌株多，正变菌株少； 但在不多的正变株中可能筛选到产量提高幅度大的变株。
3.7 培养基和培养条件的调整
2 正交试验设计的方法步骤
1. 确定试验的培养基组成成分(因素)和每种组成成分
所取的含量(水平)
为了研究遗传因素引起的不同菌落类型，应尽量避 免非遗传因素引起的菌落形态变化，以免鱼目混珠、 干扰试验结果。
1.2 菌种特性与生产性能关系
1. 多方面考查菌种的生活史，了解它们的形态、生理、生
化等生物学特性，以及这些特性与代谢产物合成的关系。 土霉素产生菌斜面孢子培养3~4天好于9~10天
2. 研究菌种的某些生物学特性与产量合成的相关性。
除去菌丝片段，因为一般菌丝是多核的。
菌悬液的孢子或细菌数可用平板计数、血球计数器计数和光密度 法测定。
制备菌悬液通常采用生理盐水，如果用化学诱变剂处理时，则应 采用相应的缓冲液配制。
2.3 单孢子(或单细胞)悬液的制备
2. 菌悬液制备方法
(1) 细菌
采用同步化的预培养方法：
20～24h 培养 的新鲜斜面
1.1 诱变前对出发菌株的了解
2. 出现不同菌落类型的原因
主要原因：遗传因素
由遗传因素造成的不同类型菌落是一种变异现象，属不同 遗传特性的个体，而且可以遗传给下一代。
高考生物一轮复习第七单元生物的变异第03讲从杂交育种到基因工程新人教版
解析 途径 2 为单倍体育种，包括花粉离体培养和秋水仙素处理两个 阶段，途径 3 中先将叶肉细胞离体培养后，再经秋水仙素处理获得多倍体， 两个过程都利用了植物组织培养，A 项正确；秋水仙素作用于细胞有丝分 裂前期，通过抑制纺锤体的形成，使染色体数目加倍，B 项错误；HhRr 经减数分裂能产生 HR、Hr、hR、hr 4 种配子，所以单倍体育种获得的品 种 B 的基因型有 HHRR、HHrr、hhRR 和 hhrr 四种，途径 3 获得的品种 C 的基因型是 HHhhRRrr，二者基因型不可能相同，C 项正确；途径 4 是 诱变育种，原理是基因突变，与杂交育种相比，其最突出的特点是能够产 生新基因，D 项正确。
答案 C
2．如图是利用基因工程技术生产人胰岛素的操作过程示意图，请据图作 答。
(1)图中基因工程的基本过程可以概括为“四步曲”： ____提__取__目__的__基__因_______；___构___建__基__因__表__达__载__体__________；
__将__目__的__基__因__导__入___受__体__细__胞______；_____目__的__基__因__的__检__测___与__鉴__定________。
割 A 和 B，使它们产生_相__同___的__黏__性__末__端____，再加入___D__N_A__连___接__酶___才可
形成 C。
解析 (2)图中①过程是从细胞中获取相应的 mRNA，由于基因的选择性 表达，人的皮肤细胞中的胰岛素基因不转录，不表达，因此不能形成胰岛素 mRNA。(3)mRNA→DNA 是逆转录的过程，需要逆转录酶。DNA 分子的体外 扩增需热稳定强的 DNA 聚合酶。(4)一个 DNA 分子中的鸟嘌呤(b 个)和胸腺嘧 啶之和占碱基总数(2a 个)的一半，所以一个 DNA 分子片段中胸腺嘧啶数为(a －b)个。连续复制 4 次，共产生 DNA 分子 24＝16 个，由于复制方式为半保留 复制，故需要提供的胸腺嘧啶数量为(a－b)×(16－1)＝15(a－b)。(5)目的基因 与运载体需用同一种限制酶切割，产生相同的黏性末端，才可以在 DNA 连接 酶的作用下连接形成基因表达载体。
《分子生物学》课程教学大纲
《分子生物学》课程教学大纲（理论学时：16学时）使用教材：医学分子生物学（供8年制及7年制临床医学等专业用）分子生物学是一门从分子水平研究生命现象、生命的本质、生命活动及其规律的科学。
医学分子生物学是分子生物学的一个重要分支，是从分子水平研究人体在正常及疾病状态下生命活动及其规律的一门科学。
它主要研究人体生物大分子和大分子体系的结构、功能、相互作用及其同疾病发生、发展的关系。
作为一门课程，医学分子生物学涵盖了医学各专业学生必须学习的分子生物学基础知识，以及分子生物学在医学领域中形成的专门研究领域及相关知识。
医学分子生物学既要较系统地了解分子生物学的基础理论知识和技术理论知识，同时也要了解分子生物学在医学领域的应用和相关研究进展。
本书共二十三章，包括5个方面内容。
第二章至第十章介绍分子生物学基本知识，主要介绍基因和基因组的基本概念和基本特点，基因组核酸复制与损伤修复、基因表达和功能蛋白形成与降解、基因表达调控、细胞间通讯与信号转导的基本概念和基本理论，细胞增殖与凋亡的相关分子生物学机制。
第十一章至第十三章介绍基因操作的基本知识，包括基因分析、基因功能研究和基因克隆与表达的相关基本知识和研究策略。
第十四章至第十八章介绍疾病分子生物学机制，介绍了基因和基因组、细胞间通讯和信号与人类健康和疾病之间关系。
第十九章至第二十一章介绍分子生物学理论与技术在医学中应用，包括基因诊断和基因治疗概念与相关研究。
最后两章介绍分子生物学新兴研究领域、生物信息学在基因和蛋白质研究中的应用。
本大纲正是从上述目的出发，在要求学生掌握分子生物学基本知识与基本技术，同时了解分子生物学在医学领域的应用与相关研究。
使学生们在分子水平上研究人体在正常及疾病状态下生命活动及其规律，为从事临床医学打下深厚的基础。
绪论一、目的要求了解分子生物学的定义、研究对象和研究内容；分子生物学发展简史；生物遗传物质的发现；现代分子生物学的建立和深入发展；分子生物学与相关学科的关系；分子生物学在医学和生物学中的应用。
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第七章定点诱变
［本章摘要］
突变有重复、缺失、倒位、易位四种类型。
定点诱变主要是关于：简单的插入或缺失，单个碱基的置换以及系统的缺失、插入或成串碱基的置换。
寡核苷酸介导的定点诱变主要是对单个或少数几个碱基的操作；外切核酸酶Ⅲ、BAL31、DNase Ⅰ介导嵌套缺失，可以得到系列缺失体。
第一节：寡核苷酸介导的诱变
70年代初j×174 DNA （ss DNA 5386bp），当用带琥珀突变的ssDNA 与变性的野生型DNA片段一起转染细菌时，观察到“标记获救”现象。
即产生带野生型基因组的噬菌体，原因是野生型DNA 片段与突变体的相应序列退火，形成错配的异源双链体，后者可被宿主编码的错配修复系统转变为全长的野生型基因组。
由此可利用突变的DNA 片段将突变引入到野生型DNA 中。
一、Kunkel法或称“U” 法
1．背景介绍
dut-dUTP 酶缺陷，细胞不能把dUTP 转化为dUMP ，因此细胞内dUTP 的含量大为增加，其中一些dUTP 可掺入DNA 中正常情况下由胸苷嘧啶占据的位置。
ung -UDG 酶缺陷，UDG 酶[尿嘧啶（uracil）-N-糖基化酶（glycosylase）]可除去掺入DNA 中的尿嘧啶残基。
2．原理
Kunkel 法原理如图7-1 所示，过程包括：
①当目标DNA 插入phagemid 载体并进入E.coli CJ236 后。
②由于该菌体ung- dut-突变，合成的DNA 上含有少量尿嘧啶（取代胸腺嘧啶）。
③M13K07 辅助感染下，产生带U 的单链DNA 。
④与引入诱变的Oligo 复性。
⑤在T7DNA polymerase 和ligase 作用下，以带U 的单链DNA 为模板合成一条新链，形成杂合双链。
⑥感染dut+ung+ E.coli MV1190 后，在细胞分裂过程中，只有新合成的DNA 链才能起模板作用合成新的并引入了诱变位点的子代双链DNA 。
而有U 的DNA 链，在dut+和ung+产物的作用下，尿嘧啶被水解，从而失去作为模板的能力。
3．酶和primer
①DNA polymerase
②ligase
③T4 gene 32 protein：提高含二级结构的ssDNA 的突变率
④primer：要求5' 端磷酸化。
引物的终极条件：与靶DNA 正确配对，特异性地与靶DNA 序列退火。
A.单核苷酸置换插入或缺失
5' 端完全配对，使得上游（引物）起始的DNA 合成不容易将诱变寡核苷酸取代，约需8-10bp 。
3' 端所形成的杂交体足以引导DNA 合成。
如果错配核苷酸太靠近3' 端，3' 端将不能形成稳定的杂交体，易被外切活性降解。
所以3' 端需有7-9bp 完全配对；为便于筛选，应选用可形成稳定杂交体而长度最短的诱变寡核苷酸。
一般17-19bp ，错配在中央，使得完全配对的杂交体与错配杂交体之间的热稳定性差异足够大。
B.多处缺失或变换2 个bp 以上的oligo
两侧需12-15bp ，侧翼双链区的Tm 应约为35-40℃。
突变区域大，效率越低（两侧形成稳定杂交体的能力是突变区长度的函数→越低）。
Tm = 4 （G + C）+ 2 （A + T）
⑤模板/结果
靶DNA 尽可能短，应测序确定其突变。
二、Altered Sites II in vitro Mutagenesis System
三、Transformer Site-Directed mutagenesis 原理及过程如图7-3 所示。
图7-3 ：Transformer Site-Directed mutagenesis 原理图
四、PCR 定点诱变
1．同源重组法
引物1、3 ，致突变引物，引物2、4 ，准确配对引物。
作用原理如图7-4 ，过程包括：
①以1、2 和3、4 分别为引物进行PCR ，得到引入了突变的线状DNA 分子。
②线状DNA 分子转化同一宿主。
③同源重组得到环状的引入了突变的目标DNA 。
2．Dpn I 法
作用原理如图7-5 所示，作用过程包括：
①以野生型DNA 为模板，致突变引物扩增出目标分子。
②依赖甲基化的限制性内切酶Dpn I 特异性降解模板DNA （甲基化）。
③扩增产物连接，转化大肠杆菌，得到大量复制。
3．重叠延伸 Overlap extension
原理参照图7-6 ，具体内容参考第五章。
第二节嵌套缺失1．外切核酸酶Ⅲ的消化
2．BAL 31 的消化
BAL31 主要活性为3' 外切核酸酶活性，可从线性DNA 两条链的3' 端去掉除单核苷酸。
它是一个内切核酸酶（单链，nick, gap），依赖Ca2+，EGTA 可抑制活性。
3．DNase Ⅰ的消化
DNase Ⅰ是一种内切酶，可优先水解ds or ss DNA 中的嘧啶核苷酸。
当Mg2+ 存在时独立作用于每条DNA 链，位点随机。
当Mn2+ 存在时大致在同一位置切割dsDNA ，产生平端或1-2 个核苷酸突出。