第五讲基因定点诱变PCR技术
pcr定点突变技术原理
pcr定点突变技术原理
PCR定点突变技术是指基于聚合酶链反应技术和脱氧核糖核酸（DNA）技术，通过检测特定位点的特定DNA序列，以及该特定位点在
基因突变中发生变化的方法。
该技术通过引入多个PCR扩增特定序列，并在PCR产物中检测突变位点。
整个PCR定点突变分析流程包括：DNA
提取、PCR扩增、筛选、突变检测、数据分析等步骤。
第一步，先从患
者的脱氧核糖核酸（DNA）样本中取出要检测特定位点的特定DNA序列；第二步，涉及倍性引物的PCR扩增得到的DNA复制物，称为弧菌状病
毒（HCV）；第三步，以线性化步骤将弧菌状病毒和分子材料分离出来，生成紫外可见化质粒，只保留差异片段；第四步，读取所有特征模式，以获得有效的特征模式，以及发现相关的突变和多态性；第五步，通
过对所有样本进行数据挖掘来识别单项显著突变，以确定检测突变位
点的实验结果。
PCR定点突变技术是一种快速、准确的技术，使得迅速检测基因变
异和检测新发现的个体基因变异变得可能，完成病原菌或其他物质的
突变检测，为基因治疗、基因疾病的诊断和治疗，基因改造有重要的
应用前景。
第五讲基因定点诱变PCR技术
所用酶类
T4噬菌体聚合酶：诱变几率65% T7噬菌体聚合酶：3‘-5’外切活性强，持
续合成DNA的能力强，遇到引物时会停 止。诱变几率83% KlenowDNA聚合酶：前端有引物或双链 时，可能会替换。诱变几率36%
影响因素
1 引物：热动力学（配对），突变碱基 的左右8-10bp
1.1×10-4 substitutions per cycle >0.5mM<10mM 5’ to 3’only 5’ adenosines
PCR引物： 与待扩增的靶DNA区段两端序列互补 的人工合成的寡核苷酸片断。
1.其长度通常在15~30个核苷酸之间。 2.简并引物 atggctant… 3.嵌套引物
2 T4连接酶 3 5’端磷酸化 4 单链结合蛋白：解决颈环结构
基因扩增（gene amplification）
主要内容： 1.体外扩增 2.通过体外重组和转化，将目的基因在宿
主细胞进行扩增 3.在环境作用下，生物体内相关基因的扩
增。 4.程序基因扩增 5.进化过程中的基因扩增
PCR技术
Origin
Thermus aquaticus strain YT1
Molecular weight
94 kd
Optimal temperature 72--80℃
Activity
150 nucleotides/sec/molecule
Stability
>50% at 95℃ for 40 min
Fidelity Mg2+ concentration Exonuclease activity Transferase activity
1× 29× 1×
基因定点诱变技术与DNA与蛋白质互作及定点突变介绍
33
• EMSA • 还被
用于 研究 与蛋 白质 相结 合的 DNA • 序列 的特
异型。
34
四）DNaseI足迹试验 （DNase I foot printing）
• 主要步骤： ① 用32P标记DNA双链末端，并用RE切去一端； ② 加入细胞特定周期蛋白质提取物，温育； ③ 加入适量DNaseI或硫酸二甲酯-六氢吡啶，使 DNA链发生断裂。 这一反应中，DNaseI或硫酸二甲酯的用量非常关键， 要保证一条链只发生一次断裂！ ④沉淀DNA（包括与DNA相结合的蛋白质）； ⑤进行DNA凝胶分析。
23
24
酵母双杂交的基本原理示意图 25
二） 酵母单杂交系统
• 酵母单杂交系统是上世纪90年代中发展起来的研 究DNA-蛋白质之间相互作用的新技术，可识别稳 定结合于DNA上的蛋白质，在酵母细胞内研究真核 生物中DNA-
14
一）酵母双杂交系统 （yeast two-hybrid system)
1. 原理：
• 真核生物的转录因子大多是由两个结构上分开、 功能上独立的结构域组成的，即 DNA结合域（BD） 和转录激活域（AD）。
• 单独地BD能与特定基因地启动区结合，但不能激 活基因的转录，而由不同转录因子的BD和AD所形 成的杂合蛋白却能行使激活转录的功能。
20
4）一旦酵母细胞中表达的“诱饵”蛋白与“猎物” 载体中表达的某个蛋白质发生相互作用， 不同转录调控因子的AD和BD结构域就会 被牵引靠拢，激活报告基因表达。
5）分离有报告基因活性的酵母细胞，得到所 需要的“猎物”载体，获得与已知蛋白相互 作用的新基因。
21
22
AD:Activation domain DNA-BD:Binding domain
定点诱变技术
Family gene shuffling library of chimeras
Generating chimeras with crossovers of large blocks of sequences
How DNA shuffling works ？
一、单基因和基因家族的重组装
Fragment with DNAseI
第三章 DNA突变技术
基因突变包括单个碱基或片断的替换，基
因片断的插入与删除等。
根据其特点可将基因突变技术分两大类：
1.位点特异性突变
定点突变
2.随机突变 表型筛选
随机突变
易错PCR法(Error-prone PCR)
降低一种dNTP的量（降至5％-10％） 加入dITP来代替被减少的dNTP 缓冲液中另加0.5mmol/L Mn2+
适用于插入片段长度在 1.0kb以下的多点突变。
Steps of Multipoints Mutagenesis Kit (TaKaRa)
X
XXX
X
Reassemble fragments
XXX
X
Select best recombinants
XXX
XX
X
XX
X
XX
X
XXX X
XXX X
XXX X
XX XXX X X X X X
XX X
X
XX X
X
XX X
X
XX X
XXXXXX NhomakorabeaXX
X
Repeat for multiple cycles
枯草杆菌蛋白酶E热稳定性的分子进化 （Huimin Zhao等，1999）
DNA与蛋白质互作及定点突变
C 沉默子
28
启动子（promtor）在转录起始点上游约100－200bp以内，
每个元件长度约为7－20bp，决定RNA聚合酶Ⅱ转录起始
点和转录频率的关键元件。 增强子(enhancer)能使和它连锁的基因转录频率明显增加的 DNA序列，顺式作用元件（DNA序列）。 沉默子(silencer)负性调节元件，与相应的反式因子结合后， 可以使正调控系统失去作用，阻遏基因转录。
39
40
六）体内足迹试验
• 用适量DMS处理完整的游离细胞，使染色 质中的G残基甲基化，提取DNA并加入六氢 吡啶切割DNA链。与对照的裸露DNA经甲基 化处理后形成的梯度相对照，就能发现DNA 链上的蛋白质结合区。
41
42
七）染色质免疫沉淀实验 Chromatin Immunoprecipitation(ChIP) Assay
5
2.寡核苷酸引物诱变技术
• 用化学合成的含有突变碱基的寡核苷酸片 段作为引物，启动单链DNA的复制，新产 生出来的心链就具有已发生突变的碱基序 列。
6
7
㈡ PCR点突变技术
– 1.重组PCR定点诱变法
•
该方法是利用四种引物，三轮PCR反应来 进行的。操作较为繁琐。
8
片产 段生 末一 端种 的突 突变 变位 体点 远 离
五、基因定点诱变
1
定位诱变技术就是指按照设计要求， 在体外将基因特定区域的碱基进行突变， 这样就有可能在缺乏表型选择时进行遗传 分析，以便于研究基因结构与功能的关系 和基因表达调控的过程。其诱变技术有两 种类型，即区域随机诱变和点突变。
基因定点突变方法及其应用
基因定点突变方法及其应用基因定点突变是指在基因组中特定位置的发生的突变。
基因定点突变可以是单个碱基的突变，也可以是多个碱基的突变。
这可以发生在DNA、RNA或蛋白质的编码区域或非编码区域。
基因定点突变方法是用于研究基因突变的工具和技术。
它们在生物医学研究、疾病诊断、药物研发等领域有着广泛的应用。
1.PCR扩增：PCR扩增是一种常用的基因定点突变方法，可以快速有效地扩增所需的DNA片段。
通过在PCR反应中引入突变引物，可以在特定位点引入单个碱基变异。
这种方法被广泛应用于基因功能研究、遗传性疾病的诊断和突变的检测等领域。
2.扩增-测序：扩增-测序方法是一种将突变引物引入待测基因位点的PCR扩增方法，随后使用测序技术验证突变是否成功。
这种方法可用于研究基因突变与人类遗传病之间的相互关系，还可以用于检测药物抗性突变、病毒突变等领域。
3.分子克隆：分子克隆是一种将特定DNA片段插入载体DNA的方法。
通过将突变片段与目标DNA结合，随后将其放入宿主细胞，可将所需的突变引入到目标基因中。
这种方法广泛应用于蛋白质工程、基因功能研究等领域。
4. CRISPR-Cas9系统：这些基因定点突变方法在基因功能研究、疾病诊断和治疗、药物研发等领域有着广泛的应用。
在基因功能研究中，通过引入特定的突变，研究人们可以研究基因的功能和调控机制。
例如，通过基因定点突变，可以研究基因在发育、免疫反应、代谢调节等过程中的作用和调节机制。
在疾病诊断和治疗中，基因定点突变方法可以用于检测与一些遗传性疾病有关的突变。
例如，通过扩增-测序方法可以检测BRCA1和BRCA2基因的突变，从而评估患者患乳腺和卵巢癌的风险。
此外，基因定点突变方法也可以用于基于个体遗传背景的个体化药物治疗。
在药物研发领域，基因定点突变方法可以用于评估药物的疗效和副作用。
通过引入特定的突变，可以模拟蛋白质靶点的突变，评估药物对该靶点的亲和力和选择性。
这对于开发更有效和安全的药物具有重要意义。
pcr定点诱变原理例题
pcr定点诱变原理例题
PCR（聚合酶链式反应）定点诱变是一种用于引入特定突变的技术，其原理是利用PCR反应来产生特定的突变。
这种技术可以被用于研究基因功能、蛋白质结构和酶催化机制等领域。
下面我将从原理和例题两个方面来回答你的问题。
首先，我们来看一下PCR定点诱变的原理。
PCR定点诱变利用了PCR反应中的错误复制和修复机制。
在PCR反应中，DNA聚合酶会复制DNA模板，但是由于其复制过程中的错误率，会产生一些突变。
通过控制PCR反应条件和引入特定的引物（引物中包含所需的突变信息），可以在特定位点引入所需的突变。
之后，可以通过转化或者其他方法将这些突变引入到目标生物体中，从而实现对特定基因的定点诱变。
接下来，我们来看一个例题。
假设我们希望在一个特定的基因中引入一个点突变，使得蛋白质的一个氨基酸发生改变。
首先，我们需要设计引物，其中包含我们希望引入的突变信息。
然后，我们进行PCR反应，使用这些引物来引发特定的突变。
接下来，可以通过测序等方法验证是否成功引入了突变。
最后，可以将这个突变基因导入到目标生物体中，观察其表型变化以及对应的功能变化。
通过PCR定点诱变技术，我们可以精确地引入特定的突变，从而研究基因功能、蛋白质结构以及酶催化机制等方面的问题。
这种技术在分子生物学和遗传学研究中具有重要的应用价值。
希望这个例题能够帮助你更好地理解PCR定点诱变的原理和应用。
基因定点突变DNA实验技术方法
基因定点突变DNA实验技术方法要研究和检测基因定点突变，需要使用一系列的实验技术方法。
以下是几种常用的DNA实验技术方法：1.基因测序技术基因测序技术是研究基因组突变的关键方法之一、它可以将DNA分子按顺序解码，并确定单个核苷酸的序列。
经过多年的发展，现在有很多种基因测序技术可供选择，如Sanger测序、Illumina测序、PacBio测序和单分子DNA测序。
这些技术可以高效地测定基因组中各个位置的核苷酸序列，并揭示基因定点突变的存在。
2.聚合酶链式反应（PCR）PCR是一种用于扩增特定DNA片段的方法，可以在PCR反应过程中选择性地扩增感兴趣的基因片段。
对于基因定点突变的研究，PCR可以用来扩增包含突变位点的DNA片段，并通过测序分析来确定突变的类型。
3.引物延伸法引物延伸法是一种常用的检测单核苷酸多态性（SNP）和点突变的方法。
该方法使用引物和DNA聚合酶来识别特定位点，并从该位点延伸引物，以确定突变的存在与否。
引物延伸法可以用于快速、高效地检测多个位点的突变。
4. 限制性酶切酶（Restriction Enzyme Digestion）限制性酶切酶可以通过识别特定的DNA序列并在该序列周围切割DNA来检测和分析基因定点突变。
当突变中产生或消失限制性酶切位点时，可以通过酶切后的DNA片段的大小变化来检测突变。
5. DNA芯片技术（DNA Microarray）DNA芯片技术是一种高通量的基因分析技术，可以同时检测和比较大量的基因表达水平。
通过将DNA分子固定在芯片的表面并用荧光探针进行杂交反应，可以检测不同样品中基因定点突变的存在。
以上是几种常用的DNA实验技术方法，用于研究和检测基因定点突变。
随着技术的不断发展和创新，这些方法将进一步提高灵敏度和分辨率，为基因定点突变的研究提供更多的选择和可能性。
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
温度（℃）
94
循环1
94℃变性 （1min）
循环2
循环3
72 60 60 ℃退火 （1min）
72 ℃延伸 （1.5min）
时间（min）
PCR反应的温度循环周期
PCR 反应的每一个温度循环周期都是由DNA变性、引 物退火和反应延伸三个步骤完成的。图中设定的反 应参数是94℃变性1min， 60 ℃退火1min， 72 ℃ 延伸1.5min。如此周而复始，重复进行，直至扩增 产物的数量满足实验需求为止。
5’ (a) (b) 引物2 5’ 3’ 5’ (c) 引物2互补链 3’
(d)
靶DNA的扩增
3’ 3’ 5’ 引物1 3’ 引物1互补链
5’
新引物
3’ 5’
5’ 3’
(e)
不同长度的链
单位长度的链
(f)
引物2互补链
5’ 3’
3’ 5’
引物1互补链
(g)
目的片段（不同长度的链未示出）
聚合酶链式反应示意图
1× 29× 1×
*This cycle is normally included in a PCR assay in order to allow any “unfinished” product from previous amplification to achieve its full length
所用酶类
T4噬菌体聚合酶：诱变几率65% T7噬菌体聚合酶：3‘-5’外切活性强，持 续合成DNA的能力强，遇到引物时会停 止。诱变几率83% KlenowDNA聚合酶：前端有引物或双链 时，可能会替换。诱变几率36%
影响因素
1 引物：热动力学（配对），突变碱基 的左右8-10bp 2 T4连接酶 3 5’端磷酸化 4 单链结合蛋白：解决颈环结构
1 2 3 4 5
结构和功能 基因的注释 代谢途径-分子育种 蛋白质的修饰 分子设计-分子进化工程
缺失诱变
1 简单缺失 通过对DNA片段中具有的相应的酶 切位点进行切割，而后用T4连接酶进行 连接。 2 系统缺失 核酸外切酶III、S1核酸酶、Klenow大 片段
插入突变
1 2 3 4
人工合成片段 Transposon insertion （Tn5） 同源重组 PCR
基 因 的 体 外 诱 变
Kunkel法 或称”U”法
dut -
：dUTP酶（dUTPase）缺陷，细胞不
能把dUTP转化为dUMP,因此细胞内dUTP的含 量大为增加，其中一些dUTP可掺入DNA中正 常情况下有“T”占据的位置。
Typical PCR Thermal Profile
Program
94℃ (first step) 1min 1min 1min
37—60℃ (second step) 1min 1min 1min
72℃ (third step) 1min 1min 10min
Reps
Cycle1 Cycle2—30 Cycle31*
Description
Thermus aquaticus strain YT1 94 kd 72--80℃ 150 nucleotides/sec/molecule >50% at 95℃ for 40 min 1.1×10-4 substitutions per cycle >0.5mM<10mM 5’ to 3’only 5’ adenosines
Some DNA Polymerases Used in PCR
Enzyme
Klenow Sequenase Taq BstE Pfu Tth UlTma
Microbial Source
Escherichia coli T7 bacteriophage Thermus aquaticus Bacillus stearothermophilus Pyrococcus furiosus Thermus thermmophilus Teratoga mariti Yes Yes Yes Yes Yes
Characteristics of Taq Polymerase
Characteristics
Origin Molecular weight Optimal temperature Activity Stability Fidelity Mg2+ concentration Exonuclease activity Transferase activity
寡核苷酸定点诱变技术
M.Smith（加拿大生物化学家） 1993年诺贝尔化学奖，1978年发明了 寡核苷酸定点诱变技术。 利用寡核苷酸定点诱变技术，可以 认为地通过基因的改变来修饰、改造某 一已知的蛋白质，从而可以研究蛋白质 的结构及其与功能的关系、蛋白质之间 的相互作用。
基因诱变的应用
基因扩增（gene amplification）
主要内容： 1.体外扩增 2.通过体外重组和转化，将目的基因在宿 主细胞进行扩增 3.在环境作用下，生物体内相关基因的扩 增。 4.程序基因扩增 5.进化过程中的基因扩增
PCR技术 在1983年，美国Cetus公司人类遗 传研究室的科学家K.B.Mullis发明 的。 PCR是一种在体外快速扩增特定基 因或DNA序列的方法，有称之为体 外扩增法。
ung -：UDG酶缺陷，UDG酶（尿嘧啶-N-糖
基化酶）可除去DNA中的尿嘧啶
E.Coli （dut-，ung-）
合成的DNA中含有尿嘧啶，M13噬菌体 DNA中将含有20-30个尿嘧啶碱基。
CJ236(dut-，ung- ，F+ )
ssDNA制备载体
1 单链噬菌体载体 M13 2 phagemid载体-辅助噬菌体
Reaction Condition for a Typical PCR Assay
Parameter
Template pH dNTPs Gelatin Primers Mg2+ oncentration Enzyme Total volume
Concentration
10 attomoles(~1×106 molecules) 8.4（10mM Tris-Hcl） 200 μ M(each one) 100 g/ml (optional) 0.5 μ M(each one);(0.1—1.0μ M) >0.5mM< 10mM 1 unit 25—100μ l