基因的定点诱变
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第五讲基因定点诱变PCR技术
所用酶类
T4噬菌体聚合酶：诱变几率65% T7噬菌体聚合酶：3‘-5’外切活性强，持
续合成DNA的能力强，遇到引物时会停 止。诱变几率83% KlenowDNA聚合酶：前端有引物或双链 时，可能会替换。诱变几率36%
影响因素
1 引物：热动力学（配对），突变碱基 的左右8-10bp
1.1×10-4 substitutions per cycle >0.5mM<10mM 5’ to 3’only 5’ adenosines
PCR引物： 与待扩增的靶DNA区段两端序列互补 的人工合成的寡核苷酸片断。
1.其长度通常在15~30个核苷酸之间。 2.简并引物 atggctant… 3.嵌套引物
2 T4连接酶 3 5’端磷酸化 4 单链结合蛋白：解决颈环结构
基因扩增（gene amplification）
主要内容： 1.体外扩增 2.通过体外重组和转化，将目的基因在宿
主细胞进行扩增 3.在环境作用下，生物体内相关基因的扩
增。 4.程序基因扩增 5.进化过程中的基因扩增
PCR技术
Origin
Thermus aquaticus strain YT1
Molecular weight
94 kd
Optimal temperature 72--80℃
Activity
150 nucleotides/sec/molecule
Stability
>50% at 95℃ for 40 min
Fidelity Mg2+ concentration Exonuclease activity Transferase activity
1× 29× 1×
基因定点突变方法及其应用
基因定点突变方法及其应用
基因定点突变是指在基因组中特定的位置发生的变异事件。
这些定点
突变可以是单个碱基的替代、插入或删除，也可以是染色体片段的重排和
结构变化。
基因定点突变是遗传学和分子生物学研究中的重要技术，具有
广泛的应用前景。
在基因定点突变的研究中，常用的方法包括基于随机突变和基于定点
突变的方法。
一、基于随机突变的方法：
1.化学诱变：通过化学物质如亚硫酸乙基甲酯(EMS)或N-亚硝基-N-
乙基脲(ENU)等诱导基因组范围内的突变。
这些突变通过对群体进行筛选
和筛选，从而找到目标基因的突变。
2.辐射突变：用射线如X射线、γ射线，或放射性物质如乙烯基腈，等辐射处理生物体，以诱导其基因组上的随机突变。
基于随机突变的方法广泛应用于物种、疾病、发育和进化等研究中。
它们可以帮助揭示基因功能的重要性和与特定物种和表型相关的基因。
二、基于定点突变的方法：
1.基因敲除/敲入：通过合成受损的DNA片段或外源DNA片段，将其
导入到目标基因中，从而造成其功能异常或置换为新的基因序列。
这种方
法可用于明确或验证基因的功能，并探索特定突变的表型影响。
基因定点突变技术.
四、展望
定点突变技术可以高效地应用于ＤＮＡ缺失改造、 蛋白质工程和酶等多个研究领域。它不仅加深人们对 蛋白质、酶等物质的了解，而且也为进一步研究这些 物质提供技术支持。另外，突变技术可以对某一特性 相关位点同时进行突变，这就极大地提高了获取突变 子的效率，避免了高强度的筛选工作，同时也节约了 大量的时间和资金。突变技术在蛋白质工程研究将会 继续保持迅猛势头，且在医学、农业科学、肿瘤研究、 基因表达与调控等领域，突变技术的应用也越来越广 阔。因此，我们有理由相信突变技术在未来会有光明 的应用前景。
基因定点突变技术
目录
一、定点突变简介
二、基因定点诱变 三、基因定点突变应用
四、展望
一、定点突变简介
定点突变（site-directed mutagenesis） 技术可以有目的性地在已知ＤＮＡ 序列中 取代、插入或缺失一定的核苷酸片段，可以 有目的或针对性的改变ＤＮＡ序列中的碱基 次序；它不仅可以用来阐明基因的调控机理， 也可以用来研究蛋白质结构与功能之间的关 系。
1、寡核苷酸盒式诱变
（Cassette mutagenesis）
利用一段人工合成的具有突变 序列的寡核苷酸片段，即寡核苷酸 盒，取代野生型基因中的相应序列。
ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ
2、寡核苷酸引物诱变
使用化学合成的含有突变碱基的寡 核苷酸片段作为引物，启动单链DNA 分子进行复制，随后这段寡核苷酸引 物便成为了新合成DNA子链的一个组 成部分，因此所产生出来的新链便具 有已发生突变的碱基序列
1、突变技术在蛋白质工程中的应用
突变技术在蛋白质工程中的应用 非常广泛和成功。此技术不仅是蛋白 质定向改造的强有力工具，而且也是 研究蛋白质结构和功能关系的重要方 法。
第七章 定点诱变
还具有较弱的内切核酸酶活性可降解单链（单 链， nick, gap），依赖 Ca2+ ，EGTA 可抑制活 性。
两种活性结合产生平端或较短5’突出端的缩短 分子
利用BAL 31核酸酶制备嵌套缺失突变体
处理不同时间
Klenow DNA聚合酶 补平末端
与克隆载体连接
3．DNase Ⅰ 的消化
一种内切酶，可优先水解 ds or ss DNA 中的 嘧啶核苷酸 。
基因A P2
P1
基因B
5. 大引物PCR诱变法
大引物PCR法由Kammann M等人于1989
年提出,随后经Sarkar G和Sommer S S等人加 以改进。
该方法需2个侧翼引物和1个内部诱变引物, 经过2轮PCR获得突变的全长DNA。
第1轮PCR用诱变引物和1个侧翼引物,扩增 产物经凝胶纯化后作为大引物再与另一侧翼 引物进行第2轮PCR,产生全长的突变的DNA。
第七章f cloned DNA
突变是研究基因结构与功能的最基本的手段
经典的方法：分离自发突变体
用物理、化学诱变剂处理活体
诱变-整个生物体-目的基因上的突变极其有限
体外诱变(in vitro mutagenesis)：对克隆化的 DNA进行诱变处理可得到经典诱变所能得到 的所有种类的突变
突变类型: 单个碱基的置换 简单的插入或缺失 系统的缺失、插入或成串碱基的置换
第三节 寡核苷酸介导的定点诱变 p176
基因的定点诱变（site-directed mutagenesis）: 使已克隆基因或DNA片段中的任何一个特定碱 基发生取代、插入或缺失突变的过程
需一个或多个含突变碱基的诱变寡核苷酸作为 引物进行DNA复制，使寡核苷酸引物成为新合 成的DNA子链的一部分
两种活性结合产生平端或较短5’突出端的缩短 分子
利用BAL 31核酸酶制备嵌套缺失突变体
处理不同时间
Klenow DNA聚合酶 补平末端
与克隆载体连接
3．DNase Ⅰ 的消化
一种内切酶，可优先水解 ds or ss DNA 中的 嘧啶核苷酸 。
基因A P2
P1
基因B
5. 大引物PCR诱变法
大引物PCR法由Kammann M等人于1989
年提出,随后经Sarkar G和Sommer S S等人加 以改进。
该方法需2个侧翼引物和1个内部诱变引物, 经过2轮PCR获得突变的全长DNA。
第1轮PCR用诱变引物和1个侧翼引物,扩增 产物经凝胶纯化后作为大引物再与另一侧翼 引物进行第2轮PCR,产生全长的突变的DNA。
第七章f cloned DNA
突变是研究基因结构与功能的最基本的手段
经典的方法：分离自发突变体
用物理、化学诱变剂处理活体
诱变-整个生物体-目的基因上的突变极其有限
体外诱变(in vitro mutagenesis)：对克隆化的 DNA进行诱变处理可得到经典诱变所能得到 的所有种类的突变
突变类型: 单个碱基的置换 简单的插入或缺失 系统的缺失、插入或成串碱基的置换
第三节 寡核苷酸介导的定点诱变 p176
基因的定点诱变（site-directed mutagenesis）: 使已克隆基因或DNA片段中的任何一个特定碱 基发生取代、插入或缺失突变的过程
需一个或多个含突变碱基的诱变寡核苷酸作为 引物进行DNA复制，使寡核苷酸引物成为新合 成的DNA子链的一部分
基因定点诱变技术与DNA与蛋白质互作及定点突变介绍
32
33
• EMSA • 还被
用于 研究 与蛋 白质 相结 合的 DNA • 序列 的特
异型。
34
四）DNaseI足迹试验 （DNase I foot printing）
• 主要步骤： ① 用32P标记DNA双链末端，并用RE切去一端； ② 加入细胞特定周期蛋白质提取物，温育； ③ 加入适量DNaseI或硫酸二甲酯-六氢吡啶，使 DNA链发生断裂。 这一反应中，DNaseI或硫酸二甲酯的用量非常关键， 要保证一条链只发生一次断裂！ ④沉淀DNA（包括与DNA相结合的蛋白质）； ⑤进行DNA凝胶分析。
23
24
酵母双杂交的基本原理示意图 25
二） 酵母单杂交系统
• 酵母单杂交系统是上世纪90年代中发展起来的研 究DNA-蛋白质之间相互作用的新技术，可识别稳 定结合于DNA上的蛋白质，在酵母细胞内研究真核 生物中DNA-
14
一）酵母双杂交系统 （yeast two-hybrid system)
1. 原理：
• 真核生物的转录因子大多是由两个结构上分开、 功能上独立的结构域组成的，即 DNA结合域（BD） 和转录激活域（AD）。
• 单独地BD能与特定基因地启动区结合，但不能激 活基因的转录，而由不同转录因子的BD和AD所形 成的杂合蛋白却能行使激活转录的功能。
20
4）一旦酵母细胞中表达的“诱饵”蛋白与“猎物” 载体中表达的某个蛋白质发生相互作用， 不同转录调控因子的AD和BD结构域就会 被牵引靠拢，激活报告基因表达。
5）分离有报告基因活性的酵母细胞，得到所 需要的“猎物”载体，获得与已知蛋白相互 作用的新基因。
21
22
AD:Activation domain DNA-BD:Binding domain
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• EMSA • 还被
用于 研究 与蛋 白质 相结 合的 DNA • 序列 的特
异型。
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四）DNaseI足迹试验 （DNase I foot printing）
• 主要步骤： ① 用32P标记DNA双链末端，并用RE切去一端； ② 加入细胞特定周期蛋白质提取物，温育； ③ 加入适量DNaseI或硫酸二甲酯-六氢吡啶，使 DNA链发生断裂。 这一反应中，DNaseI或硫酸二甲酯的用量非常关键， 要保证一条链只发生一次断裂！ ④沉淀DNA（包括与DNA相结合的蛋白质）； ⑤进行DNA凝胶分析。
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酵母双杂交的基本原理示意图 25
二） 酵母单杂交系统
• 酵母单杂交系统是上世纪90年代中发展起来的研 究DNA-蛋白质之间相互作用的新技术，可识别稳 定结合于DNA上的蛋白质，在酵母细胞内研究真核 生物中DNA-
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一）酵母双杂交系统 （yeast two-hybrid system)
1. 原理：
• 真核生物的转录因子大多是由两个结构上分开、 功能上独立的结构域组成的，即 DNA结合域（BD） 和转录激活域（AD）。
• 单独地BD能与特定基因地启动区结合，但不能激 活基因的转录，而由不同转录因子的BD和AD所形 成的杂合蛋白却能行使激活转录的功能。
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4）一旦酵母细胞中表达的“诱饵”蛋白与“猎物” 载体中表达的某个蛋白质发生相互作用， 不同转录调控因子的AD和BD结构域就会 被牵引靠拢，激活报告基因表达。
5）分离有报告基因活性的酵母细胞，得到所 需要的“猎物”载体，获得与已知蛋白相互 作用的新基因。
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AD:Activation domain DNA-BD:Binding domain
基因的定点突变的原理
基因的定点突变的原理基因的定点突变是指在DNA序列中的特定位置发生的突变，即碱基序列的改变。
这种突变发生在特定的位置，通常是基因编码区域，会引起氨基酸序列的改变，从而对蛋白质的功能产生影响。
定点突变的原理主要涉及以下几个方面：1. 突变的起源：定点突变可以是自发发生的，也可以是由外部因素引起的。
自发突变通常是由DNA复制过程中的错误引起的，包括碱基替换、插入或缺失等变异。
而外部因素如辐射、化学物质等也可能引起DNA损伤并导致定点突变。
2. 碱基替代：定点突变最常见的形式是碱基替代，即一个碱基被另一个碱基替代。
这种替代可能是同义突变，即替代后的密码子依然编码相同的氨基酸。
也可能是错义突变，即替代后的密码子编码不同的氨基酸，从而改变蛋白质的结构和功能。
3. 密码子的改变：在定点突变时，被替代的碱基往往位于密码子序列中的特定位置。
这种替代可能导致密码子的改变，从而改变蛋白质的翻译过程。
例如，突变可能导致起始密码子的改变，影响蛋白质的翻译起始，或者导致终止密码子的改变，影响蛋白质的翻译终止。
4. 功能影响：定点突变引起的氨基酸序列的改变可能会影响蛋白质的结构和功能。
如果突变发生在蛋白质的活性位点或功能域内，可能会影响蛋白质的结合能力、催化能力或信号转导等功能。
这种影响可能是有益的，例如产生对环境更有优势的适应性变异，也可能是有害的，例如导致疾病的发生。
总之，定点突变是指DNA序列特定位置发生的突变，可能是自发发生的或由外部因素引起的。
突变可以是碱基替代，导致密码子的改变，进而影响蛋白质的结构和功能。
这些突变的结果可能是有益的适应性变异，也可能是有害的疾病突变。
基因工程第七章DNA定点诱变
• 3’端所形成的杂交体足以引导DNA合成。如果
错配核苷酸太靠近3’端，3’端将不能形成稳定的 杂交体，易被外切活性降解。所以3’端需有79bp完全配对;
• 为便于筛选，应选用可形成稳定杂交体而长
度最短的诱变寡核苷酸。一般17-19bp, 错配在 中央，使得完全配对的杂交体与错配杂交体 之间的热稳定性差异足够大。
位点选择定点诱变法
三、Transformer SiteDirected mutagenesis
转化子诱变法
Synthesize second strand
Digest DNA (primary digestion)
Transform E.coli mutS to propagate plasmids
ATG ATG
ATG ATG
BamHI
ATG
BamHI
PCR ATG
ATG
EcoRI
PCR
ATG
EcoRI
重叠延伸
BamHI
ATG
PCR EcoRI
第二节 嵌套缺失
第二节 嵌套缺失
1. 外切核酸酶III的消化
Exonuclease III 5‘ 3‘
5‘ 3‘
5‘ 3‘
2. BAL 31的消化
DNA ligase
U
U
U
U
U
2．原理
Insert target DNA
转化 E.coli CJ236
U
U
U U
U
U
Isolate phagemid ss DNA 与突变寡核苷酸退火
转化E.coli MV1190 (dut+/ung+)
UU
基因定点诱变技术与DNA与蛋白质互作及定点突变介绍
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酵母双杂交的基本原理示意图 25
二） 酵母单杂交系统
? 酵母 单杂交系 统是上世 纪90年代中 发展起来的研 究DNA-蛋白质之间相互作用的新技 术，可识别稳 定结合于DNA 上的蛋白 质，在酵母 细胞内研究真核 生物中 DNA-蛋白 因。
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一）酵母双 杂交系统 （yeast two-hybrid system)
1. 原理：
? 真核生物的 转录因子大多是由两个 结构上分开、 功能上独立的 结构域组成的，即 DNA结合域（BD） 和转录 激活域（ AD）。
? 单独地BD能与特定基因地启 动区结合，但不能激 活基因的 转录 ，而由不同 转录 因子的 BD和AD所形 成的杂合蛋白却能行使激活 转录的功能。
– 1.盒式诱变 – 2.寡核苷酸引物诱变技术
? ㈡ PCR点突变技术
– 1.重组PCR定点诱变法 – 2.引物PCR定点诱变法
3
㈠寡核苷酸介 导的定点突 变技术
? 1.盒式诱变（casette mutagenesis） ? 利用一段人工合成的具有突变序列的
寡核苷酸片段，取代野生型基因中的相应 序列。
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? EMSA ? 还被
用于 研究 与蛋 白质 相结 合的 DNA ? 序列 的特
异型。
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四）DNaseI足迹试验 （DNase I foot printing）
? 主要步骤： ① 用32P标记DNA双链末端，并用 RE切去一端； ② 加入细胞特定周期蛋白 质提取物，温育； ③ 加入适量DNaseI或硫酸二甲 酯-六氢吡啶，使 DNA链发生断裂。 这一反应中，DNaseI或硫酸二甲 酯的用量非常关 键， 要保证一条链只发生一次断裂！ ④沉淀 DNA（包括与 DNA 相结合的蛋白 质）； ⑤进行DNA凝胶分析。
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酵母双杂交的基本原理示意图 25
二） 酵母单杂交系统
? 酵母 单杂交系 统是上世 纪90年代中 发展起来的研 究DNA-蛋白质之间相互作用的新技 术，可识别稳 定结合于DNA 上的蛋白 质，在酵母 细胞内研究真核 生物中 DNA-蛋白 因。
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一）酵母双 杂交系统 （yeast two-hybrid system)
1. 原理：
? 真核生物的 转录因子大多是由两个 结构上分开、 功能上独立的 结构域组成的，即 DNA结合域（BD） 和转录 激活域（ AD）。
? 单独地BD能与特定基因地启 动区结合，但不能激 活基因的 转录 ，而由不同 转录 因子的 BD和AD所形 成的杂合蛋白却能行使激活 转录的功能。
– 1.盒式诱变 – 2.寡核苷酸引物诱变技术
? ㈡ PCR点突变技术
– 1.重组PCR定点诱变法 – 2.引物PCR定点诱变法
3
㈠寡核苷酸介 导的定点突 变技术
? 1.盒式诱变（casette mutagenesis） ? 利用一段人工合成的具有突变序列的
寡核苷酸片段，取代野生型基因中的相应 序列。
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33
? EMSA ? 还被
用于 研究 与蛋 白质 相结 合的 DNA ? 序列 的特
异型。
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四）DNaseI足迹试验 （DNase I foot printing）
? 主要步骤： ① 用32P标记DNA双链末端，并用 RE切去一端； ② 加入细胞特定周期蛋白 质提取物，温育； ③ 加入适量DNaseI或硫酸二甲 酯-六氢吡啶，使 DNA链发生断裂。 这一反应中，DNaseI或硫酸二甲 酯的用量非常关 键， 要保证一条链只发生一次断裂！ ④沉淀 DNA（包括与 DNA 相结合的蛋白 质）； ⑤进行DNA凝胶分析。
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因为DNA复制酶有校正功能及DNA复制 后修复系统，正常大肠杆菌自发突变频 率较小。 与校正和修复有关的基因突变后细胞内 基因突变频率大大增加，这样的菌株叫 突变菌株。
流程： 把携带待突变基因的质粒转入增变菌株 扩增，------随机突变体库。 把该库的重组质粒转化到正常宿主中， 筛选鉴定突变体。
寡核苷酸介导的定点诱变
①基本原理： 使用化学合成的含有突变碱基的 寡核苷酸片段作为引物，启动单链DNA 分子进行复制，随后这段寡核苷酸引物 便成为了新合成DNA子链的一个组成部 分，因此所产生出来的新链便具有已发 生突变的碱基序列
作为诱变剂的寡核苷酸序列：
人工合成一段寡核苷酸序列，该序列中 除了所需的碱基突变外，其余的则与目 的基因编码链的特定区段完全互补 错配碱基的位置应设计在寡核苷酸分子 的中央部位，每侧至少10-15个碱基 通常采用化学合成 无回文，重复和自身互补序列
即使获得期望表型的突变体，无法保证 突变确实发生在目的基因上 在基因克隆和核酸测序技术发展之前， 无法知道基因中突变的位置和性质
Directed evolution （定向进化或直接进化）
对目的基因人为制造大量突变，然后 按照特定的需要和目的，给予选择压力， 反复诱变，循环筛选，将满足要求的、适 合特定目的的分子筛选出来，获得满足需 要的性能改良的蛋白质，从而实现在试管 中分子水平的模拟进化。
基因家族的改组
交错延伸重组 图10-5
以两个以上的有一定同源性的DNA片段 为模板进行PCR反应，通过交换模板机制 实现DNA序列的重新组装。 不需要DNaseI切割DNA，简化了程序。
随机引发重组 图10-6
用一套随机引物与模板配对延伸，产生 不同位点的短DNA片段混合物（含有少 量点突变），以这些短DNA片段为引物 重新组装成全长基因。
2. 盒式诱变
Cassette mutagenesis
利用一段人工合成的具有突变序列的 寡核苷酸片段，即寡核苷酸盒，取代野 生型基因中的相应序列 包括两种方式： 盒式取代诱变和混合寡核苷酸诱变
野 生 型DNA 人工合成的寡核苷酸片段 HindIII 移走小片段 EcoRI HindIII EcoRI 退火 HindIII 突变体序列 HindIII EcoRI DNA连 接 酶
基因直接进化的步骤
突变
基因突变库的建立
筛选
基因突变库的活体或离体筛选
Key steps of a typical directed enzyme evolution experiment
体外诱变
是对克隆化的DNA进行诱变处理，改变 其核苷酸序列，获得突变基因。研究基 因的结构与功能的关系，获得所需功能 的突变体蛋白质 主要方法有：随机诱变，DNA体外重组， 寡核苷酸介导的定点诱变，嵌套缺失
②基本步骤：
将待突变的目的基因插入M13噬菌体载体， 制备单链DNA 将合成的寡核苷酸片段与单链模板退火， 在DNA聚合酶作用下合成互补的双链DNA 将双链DNA转化大肠杆菌，获得突变基因 突变体的筛选：寡核苷酸探针杂交筛选法
AGTACGA
单 链 的M13 重组分子
TCAGGCT
化学合成的寡核苷酸
突变是研究基因结构与功能的最基本手 段。 经典的方法是根据突变体的表型，采用 遗传学的方法鉴定相应的基因。
传统的诱变方式
利用能够修饰DNA分子的化学或物 理诱变剂处理生物体
射线（紫外线、X射线、γ射线等） 化学诱变剂（亚硝酸、羟胺、EMS、亚 硝基胍等）
不足：
生物体的任何基因都可能发生突变，目 的基因突变率较低，筛选困难
杂交退火
TCAGGCT AGTACGA
DNA聚 合 酶
DNA连 接 酶
TCAGGCT AGTACGA
TCATGCT
TCAGGCT AGTCCGA
转化大 肠杆菌 野生型 突变型
局限性：突变体子代频率低
退火时，有些单链模板DNA未与寡核苷 酸配对 细胞内甲基介导的错配修复机制会修复 新合成链中的错配碱基
DNA shuffling 是指DNA分子的体外重 组,是基因在分子水平上进行有性重组。 通过改变单个基因（或基因家族）原有 的核苷酸序列，创造新基因，并赋予表 达产物以新功能
基本步骤:
目的基因片段的准备：根据不同的需要选择一个 基因或其片段，也可以是几个序列上具有较高同 源性的基因 DNaseI酶切：将基因随机切割成约50～100bp左 右的小片段 不加引物的 PCR ：在 Taq 酶的作用下将切割后的 DNA重叠小片段重新连接起来，在这个过程中可 能发生许多突变和重组 加引物的 PCR ：加入目的基因片段两端的引物 , 使连接好的DNA得到扩增，筛选正突变。
第一节 随机诱变
随机的在克隆化DNA中引入碱基置换突 变，引入位置和性质均为随机性的。 包括：1.错误掺入诱变（易错PCR) 2.盒式诱变 3.增变菌株的诱变作用 4.化学诱变
随机突变的策略：
1. 易错PCR（error-prone PCR）
在扩增目的基因的过程中，通过改变 PCR反应的条件（如改变4种dNTP的比例、 改变Mg2+的浓度等），在PCR过程中引入 碱基错配，导致目的基因的随机突变
一、Kunkel 法 或称“U”法 1．背景知识
dutdUTP酶(dUTPase)缺陷，细胞不能把dUTP转
4 化学诱变
化学诱变剂（亚硝酸、羟胺、EMS（甲 基磺酸乙酯）、亚硝基胍等）处理DNA 片段，产生随机突变体库。
DNA体外重组
依赖序列同源性的DNA体外重组，包括 DNA洗牌(DNA shuffing)，交错延伸 （StEP)，随机引发重组（RPR).
2. DNA shuffling （DNA 重排或改组）
EcoRI
简 单 盒 式 取 代 诱 变
突 变DNA 野 生 型DNA HindIII EcoRI 野 生 型DNA
混合寡核苷酸诱变
用于取代的是含有随机突变的混合双联 寡核苷酸，可引入大量的随机突变。
在合成寡核苷酸片段时，需要带限制性 内切酶位点，以便介导它们互为引物
3增变菌株的诱变作用