腺病毒及其研究进展
第32卷第5期2010年10月 大连医科大学学报J o u r n a l o f D a l i a n Me d i c a l U n i v e r s i t y V o l.32N o.5O c t.2010腺病毒及其研究进展陈娜娜,向冬喜,郑丛龙(大连大学医学院病原生物学教研室,辽宁大连116622)摘要:本文从腺病毒的分类、结构和受体等方面对腺病毒进行了介绍,同时对腺病毒的感染和致病性做了综述,并进一步介绍了抗腺病毒治疗研究进展和腺病毒载体的应用。
对腺病毒多方面进行较全面的了解,有助于促进抗腺病毒药物的研发和加强腺病毒载体在基因治疗中得到更好的应用。
关键词:腺病毒;感染性;致病性;治疗;载体中图分类号:R373.1 文献标志码:A 文章编号:1671-7295(2010)05-0586-05A d e n o v i r u s a n d i t s r e s e a r c h p r o g r e s sC H E NN a-n a,X I A N GD o n g-x i,Z HE N GC o n g-l o n g(D e p a r t m e n t o f P a t h o g e n y B i o l o g y o f M e d i c a l C o l l e g e,D a l i a n U n i v e r s i t y,D a l i a n116622,C h i n a)A b s t r a c t:T h e c a t e g o r y,s t r u c t u r e a n dr e c e p t o r o f a d e n o v i r u s a r e i n t r o d u c e di nt h i s a r t i c l e.I t a l s o d e s c r i b e st h ei n f e c t i o n a n d p a t h o g e n i c i t y o f a d e n o v i r u s.F u r t h e r m o r e,t h e r e s e a r c hp r o g r e s s o f a n t i-a d e n o v i r u s t h e r a p y a n dt h e a p p l i c a t i o no f a d e-n o v i r u s v e c t o r a r e r e v i e w e d.W i t h t h e c o m p r e h e n s i v e u n d e r s t a n d i n g o f a d e n o v i r u s,i t i s h e l p f u l t o p r o m o t e t h e d e v e l o p m e n t o f a n t i-a d e n o v i r u s m e d i c i n e a n dt h ea p p l i c a t i o n o f a d e n o v i r u s v e c t o r i n g e n e t h e r a p y.K e yw o r d s:a d e n o v i r u s;i n f e c t i o n;p a t h o g e n i c i t y;t h e r a p y;v e c t o r 腺病毒(A d e n o v i r u s)是从手术切除的扁桃体组织分离培养得到的一种D N A病毒,主要在细胞核内繁殖,常引起人上呼吸道和眼部上皮细胞感染。
腺病毒作为普通的机会性病原体长期存在于人群中,免疫功能低下的病人感染腺病毒的机率较大,在居住密集的人群,如军队人员中可引起急性发热性呼吸道疾病的暴发流行[1]。
随着免疫学、分子生物学、分子病毒学等各个学科的发展和相互渗透,腺病毒在分子水平上的应用越来越广泛,特别是有关腺病毒的感染、致病、抗腺病毒的治疗和腺病毒载体的应用已成为研究的热点。
因腺病毒结构简单,宿主范围广,感染率高,易于培养和纯化,使腺病毒作为载体的基因治疗迅速发展。
本文就腺病毒及其相关研究进展做一综述。
1 腺病毒的特征1.1 腺病毒的分类根据宿主范围不同,腺病毒分为哺乳动物腺病毒属(M a s t a d e n o v i r u s)和禽类腺病毒属(A v i a d e n o v i r-u s)。
人腺病毒(H u m a n a d e n o v i r u s e s,H A d V)属于腺病毒科(A d e n o v i r i d a e),根据免疫学、生物学、生物化学特性不同,将其分为A～G7个亚种,共有52个血清型[2],不同的血清型有不同的器官亲和性并引起相应的临床表现。
基金项目:国家自然科学基金资助项目(30870681)收稿日期:2010-06-27;修回日期:2010-07-12作者简介:陈娜娜(1986-),女,河北邢台人,硕士研究生。
E-m a i l:c h e n n a n a20080@163.c o m 通信作者:郑丛龙,教授。
E-m a i l:z c l9812@y a h o o.c o m.c n第5期陈娜娜,等:腺病毒及其研究进展5871.2 腺病毒的结构腺病毒呈无囊膜的球形结构,其病毒粒子在感染的细胞核内常呈晶格状排列,每个病毒颗粒包含一个36k b的线性双链D N A,两端各有一个100～600b p的反向末端重复序列(i n v e r t e dt e r m i n a l r e-p e a t,I T R),I T R的内侧为病毒包装信号,是病毒包装所需要的顺式作用元件。
基因组包含早期表达的与腺病毒复制相关的E1～E4基因和晚期表达的与腺病毒颗粒组装相关的L1～L5基因。
线状双股D N A与核心蛋白形成直径为60～65n m的髓芯,被包裹于衣壳内。
衣壳呈二十面体对称,由252个直径8～10n m的壳粒组成,壳粒排列在三角形的面上,每边6个,其中240个为六邻体(非顶点壳粒),另12个为五邻体基底(顶点壳粒)。
每个六邻体是六邻体蛋白的同源三聚体,三聚体的六邻体分子有一个三角形的塔尖和五面体的基底,塔区由4个环构成即l o o p1、l o o p2、l o o p3、l o o p4,基底包含两个区域P1、P2区[3]。
六邻体上的表位(e p i t o p e)是诊断不同血清型的标准,它包括哺乳动物腺病毒属的抗原成分,是病毒体对免疫选择压力最敏感的部位。
每个五邻体基底上结合着1根(哺乳动物腺病毒)或2根(禽腺病毒)长9～77.5n m的纤维突起,这些纤维以五邻体蛋白为基底由衣壳面伸出,纤维顶端形成头节区,纤突有血清特异性,且含有负责体外血细胞凝集的种属特异性抗原决定位点。
1.3 腺病毒受体腺病毒除B和D亚种外,其它亚种的受体都是柯萨奇-腺病毒受体[4]。
柯萨奇-腺病毒受体(C o x s a c k i c-a d e n o v i r u s r e c e p t o r,C A R)又称为H e l a 细胞膜结合蛋白,是柯萨奇病毒与腺病毒的特异性受体,其本质是一种细胞间黏附分子,在上皮细胞的紧密连接和细胞间相互连接处表达,C A R是相对分子量为46000的跨膜糖蛋白,该蛋白贯通细胞膜,分为胞外区、跨膜区、胞内区。
C A R表达水平在介导腺病毒感染方面起着重要作用,其表达在体内是可调节的,具有阶段依赖性,C A R受体表达越高,提示组织器官越容易感染。
B亚种中大多数可与胞膜表面免疫调节分子C D46相结合,但A D V3和A D V7分别与相关免疫分子C D80或C D86结合。
D亚种可与细胞表面普遍存在的唾液酸受体结合[5]。
另一种参与腺病毒感染细胞的介质是细胞表面的第二受体整合素,包括αγβ3和αγβ5,它与五邻体的基底部相结合[6],整合素在细胞表面的表达水平高低,也影响了腺病毒的感染效率。
2 腺病毒的感染与致病性2.1 腺病毒的感染2.1.1 腺病毒引起感染的类型:腺病毒侵入宿主细胞后至少能引起3种感染:①慢性、潜伏性感染:常在淋巴细胞内发生,潜伏感染时外放的病毒量极少,细胞坏死也不明显,故临床上感染不明显,潜伏感染的机制尚不清楚。
②溶解性感染:病毒在细胞内如人类上皮细胞中经历复制过程,通过溶解细胞作用使细胞死亡。
③肿瘤样变异:此时病毒繁殖只进行最初几步,然后腺病毒D N A与细胞D N A整合并复制,但不产生感染性病毒,腺病毒抗原性较稳定。
2.1.2 腺病毒流行病学:腺病毒可通过人、水、媒介物和器械传播,室温条件下,腺病毒在污物中存在周期可延长至3周。
腺病毒在儿童和军营人员中更易发生感染和大规模流行,大多数婴幼儿在出生后的5年内至少感染过1种腺病毒株[7]。
在过去的几年中,腺病毒作为主要的病原体在免疫功能低下宿主如艾滋病人、免疫遗传缺陷的患者、骨髓接受者、固体器官和造血干细胞移植者常引起高发病率和死亡率;儿科经受同种型干细胞移植的病人,其感染腺病毒后死亡率可高达60%[8]。
一些致命的感染常由腺病毒血清型1、2、3引起,在这些病人体内常会出现细菌、真菌等微生物共感染的情况。
艾滋病人感染腺病毒会产生肺炎、肝炎、脑膜软化、肾炎、胃肠炎等并发症。
2.2 腺病毒的致病性2.2.1 腺病毒所致疾病:腺病毒是无包膜病毒,在低p H值环境下可稳定存在,有很强的耐物理和化学试剂的作用,腺病毒可对胃肠分泌物和胆汁产生耐受,因此腺病毒可在胃肠内复制,产生很高的病毒载量。
腺病毒常在咽、结膜、肠道及淋巴组织内繁殖,并导致各种各样的临床症状,比如呼吸系统的感染、结膜炎、胃肠炎、肝炎、出血性膀胱炎、神经系统的紊乱等。
不同的腺病毒亚种会引起不同的疾病,如人腺病毒C亚种主要引起小儿科的上呼吸道感588 大连医科大学学报第32卷染,人腺病毒B亚种常在成年人中引起流行,人腺病毒B和E亚种是军营人员感染的主要病因,人腺病毒F亚种会引起感染性腹泻[9]。
腺病毒在有免疫力的宿主体内感染是温和的,而且具有自限性。
2.2.2 腺病毒致病机理:对腺病毒感染宿主细胞后引起疾病的致病机制尚不清楚,可能通过以下机制来逃避宿主的免疫应答:①通过与M H C-I类分子结合形成复合物来抑制末端氨基酸的糖基化或通过阻断M H C-I类分子的转录或m R N A的转运而阻止细胞表面M H C-I类分子受体的表达。
②通过与病毒相关的R N A和E1A来抑制干扰素对腺病毒的作用。
IPV研究进展(传染性腺胃炎)
腺肌胃炎是由幽门螺杆菌协同传染性贫血病毒引起的腺胃肿大、鸡内金坏死、消化平衡紊乱为特征的消化道疾病。
一、病原幽门螺杆菌（HP），革兰氏染色呈阴性，在胃粘膜上皮细胞表面呈典型的螺旋状或弧形。
具有以下特性：含粘附素，可与上皮细胞牢牢地连接在一起，避免随食物一起被胃排空。
可分泌过氧化物歧化酶（SOD）和过氧化氢酶，以保护其不受中性粒细胞的杀伤。
富含尿素酶，通过尿素酶水解尿素产生氨，在菌体周围形成“氨云”保护层，以抵抗胃酸。
二、流行特点各种年龄的鸡均易感，雏鸡和青年鸡最易感，对生产性能的影响也最严重。
以免疫抑制性疾病如传染性贫血、网状内皮增殖病为诱因发病。
三、临床症状1、消化不良，细条样便2、精神不振、羽毛松乱3、生长不达标且严重大小不均。
4、无继发下，多不直接引起死亡四、大体变化1、腺、肌胃的比例增大、腺胃肿大2、腺胃乳头扁平至消失，呈水晶状3、鸡内金变性或坏死、严重者溃疡4、肠壁菲薄，肠粘膜不同程度出血根据鸡内金病变确定病情：一度：一条线，鸡内金靠近腺胃端有一条白线。
二度：两条线，鸡内金里侧有两三条白色突起。
三度：是个圆，鸡内金上有不明显黄豆大圆点。
四度：像火山，鸡内金的溃疡灶像火山口一样。
五、防控措施自配药：西咪替丁＋阿莫西林＋痢特灵＋甲硝唑＋庆大霉素＋维生素U中药：大青叶25g穿心莲30g栀子30g白头翁15g，每250g兑100斤料专用于腺胃炎的前期市面上也有成药。
是由幽门螺杆菌协同传染性贫血病毒引起的腺胃肿大、鸡内金坏死、消化平衡紊乱为特征的消化道疾病。
一、病原幽门螺杆菌（HP），革兰氏染色呈阴性，在胃粘膜上皮细胞表面呈典型的螺旋状或弧形。
具有以下特性：含粘附素，可与上皮细胞牢牢地连接在一起，避免随食物一起被胃排空。
可分泌过氧化物歧化酶（SOD）和过氧化氢酶，以保护其不受中性粒细胞的杀伤。
富含尿素酶，通过尿素酶水解尿素产生氨，在菌体周围形成“氨云”保护层，以抵抗胃酸。
二、流行特点各种年龄的鸡均易感，雏鸡和青年鸡最易感，对生产性能的影响也最严重。
广州达博生物溶瘤腺病毒E10A
广州达博生物溶瘤腺病毒E10A重组人内皮抑素蛋白实体瘤的生长和转移依赖于血管生成。
内皮抑素（Endostatin）是胶原XVIII的C末端蛋白水解酶片段，在小鼠肿瘤治疗中是一种有效的内源性血管生成抑制剂。
应用于实体瘤的临床研究，但重组人内皮抑素蛋白难以大规模生产，且日常给药繁琐。
迄今为止，其临床应用一直受到这些问题的阻碍。
内皮抑素，一个20 kDa的C-末端片段的胶原XVIII，已被证明可以阻止内皮细胞的增殖、存活和迁移，部分通过下调促血管生成因子（如Ids、HIF-1a、VEGF-A、bFGF）和上调抗血管生成因子（如血栓反应蛋白-1、2、血管抑制素、激肽原）。
在体内的内源性抗血管生成因子4、5、6，内皮抑素在小鼠和人中具有广泛的抗癌谱和低毒、低耐药性的特点。
内皮抑素是第一个引入人类临床试验的内源性血管生成抑制剂。
然而，重组内皮抑素蛋白的半衰期短、蛋白生产困难和生物活性蛋白的长期贮存，阻碍了其治疗。
此外，抑制肿瘤血管生成是一个长期而慢性的治疗过程。
基因治疗可以通过将人内皮抑素cDNA导入宿主并利用机体作为内源性工厂来产生具有高度生物活性的基因产物来克服这些困难。
腺病毒基因转移表达内皮抑素（Ad-rhEndo，E10A）对小鼠实体瘤模型有很强的全身治疗作用。
E10A 一种复制缺陷型重组人内皮抑素基因腺病毒E10A是一种复制缺陷型重组腺病毒，含有由5型腺病毒（Ad5）构建的野生型人内皮抑素转基因。
临床前研究表明，在肝癌、鼻咽癌和舌癌动物模型中，瘤内注射E10A可显著抑制肿瘤生长，并使血液和肿瘤组织中内皮抑素持续升高。
转染肿瘤细胞后，E10A表达人内皮抑素，抑制血管内皮细胞增殖和肿瘤血管生成，阻断肿瘤血供，从而特异性抑制肿瘤生长，诱导肿瘤细胞凋亡。
临床前和动物模型均证实了E10A的抗肿瘤作用，其治疗头颈部肿瘤的安全性和有效性也在一期和二期研究中得到证实。
注射方式：瘤内注射临床试验最新情况1期临床实体瘤的生长和转移依赖于血管生成。
提高腺病毒载体的感染效率的研究进展
达Ｃ Ａ Ｒ的感 染效率 ，从而扩 大 了Ａ ｄ 趋 向性 ，找到一 种Ａ ｄ 的受体在 正 常 细胞 不表达 或低 表达 ，而在肿 瘤细胞不 同发展阶段都高 表达的受体
是 关键 。
３通 过 改变Ａ ｄ 的环境 来增 加 感染 研 究发现磷酸钙可 以增｝ Ｊ ￣ Ａ ｄ 对气道上 皮的感染效率 ，磷 酸钙提高 Ａ ｄ 对 气道上 皮感染 效率 的主要机 制是增￣ Ｊ ［ １ Ａ ｄ 与上 皮表面 的结合 【 。 】 ２ ０ １ ０ 年Ａ ｈ ｏ ｎ ｅ ｎ 等人 发现溶 解在磷酸盐缓 冲液 中的葡萄糖酸钙 可以明显 增｝ Ｊ Ｅ Ｉ Ａ ｄ 的感染 效率 ，但是溶解在生理 盐水中的葡糖糖酸钙 则不能 ，并 且 使用 钙离子螯合 剂 乙二 胺四 乙酸盐 （ Ｅ ＤＴ Ａ）后葡糖糖酸 钙的作 用 消失 ，证实磷 酸根离子和钙 离子必须 同时存在才是 发挥作用” 。２ ０ ０ ０ 年 ，路秀英 ；杨贵贞等人应 用噬菌体展示 短肽探索腺 病毒表位 ，并在 第 七届 中国抗炎免疫药理学术 会议论 文中进行了发表” “ 。
提高腺病毒载体的感染效率的研究进展
陈 红 霞 沈 际 佳
（ 安徽 医科 大学病 原生物学教研 室 ，安徽 合肥 ２ ３ ０ ０ ３ ２ ）
【 摘要】人 类腺病毒 （ ａ ｄ ｅ ｎ ｏ ｖ ｉ ｒ ｕ ｓ ，Ａ ｄ ）常作为肿瘤治疗 的溶瘤细胞介质或抑瘤基因递送载体 ，其中最为常用的就是腺病毒 ５型 （ Ａｄ ５ ） 。
［ ３ ］ 方志峰， 唐 振柱 ． 广西 城 乡居 民血 脂水平 调查 分析 ［ Ｊ ］ ． 广西 预 防医
学， ２ ０ ０ ６ ， １ ２ （ ２ ｊ ： ９ １ － ９ ３ ．
［ ４ ］ 赵 水 平． 血 脂异常与冠心病防治［ Ｊ ］ ． 中国 民 康 医 学杂 志 ， ２ ０ ０ ５ ，
腺病毒载体构建的基本原理与应用
腺病毒载体构建的基本原理与应用1. 简介腺病毒（Adenovirus）是一类非常常见的病毒，它可引起呼吸道、眼部和肠道感染等问题。
在基因工程领域，腺病毒被广泛应用作为基因传递载体。
通过对腺病毒进行适当的改造，可以将外源基因有效地传递到目标细胞中，并实现基因的高表达。
本文将介绍腺病毒载体构建的基本原理以及其在实际应用中的主要用途。
2. 腺病毒载体构建的基本原理腺病毒载体构建的基本原理主要包括以下几个步骤：2.1 选择适当的腺病毒亚型腺病毒有多个亚型，其中最常用的是腺病毒2（Ad2）和腺病毒5（Ad5）。
选择适当的腺病毒亚型取决于目标细胞的特点以及需要传递的基因。
2.2 构建质粒载体构建质粒载体是腺病毒载体构建的第一步。
质粒载体通常由多个部分组成，包括腺病毒的核心序列、外源基因表达的启动子和终止子等。
通过合成或PCR扩增等方法，可以将这些部分组装到一起构建质粒载体。
2.3 建立包装细胞系在构建过程中，需要建立一个能够产生包装腺病毒的细胞系。
这些细胞系通常包括两种类型的细胞：一种是质粒携带者，将质粒转染进细胞内；另一种是包装细胞，它们能够提供所需的腺病毒包装蛋白和其他辅助蛋白。
2.4 转染质粒载体将质粒载体转染到包装细胞系中，使其进入细胞内。
转染的方法可以采用常规的化学方法，如钙磷共沉淀法或使用商业化学试剂。
2.5 腺病毒产生与包装质粒载体进入到包装细胞中后，通过转染和转座等过程，腺病毒基因组会产生复制和转录。
最终，腺病毒包装蛋白和基因组会组装成腺病毒颗粒，从而完成腺病毒载体的构建。
3. 腺病毒载体的应用腺病毒载体在基因治疗、疫苗开发、基因功能研究等方面具有广泛的应用。
以下是腺病毒载体的主要应用领域的列点介绍：•基因治疗：腺病毒载体可以用于治疗多种遗传性疾病，如囊性纤维化、遗传性视网膜疾病等。
通过将治疗基因成功地传递到患者细胞中，可以恢复或增强正常基因的功能，从而治疗相关疾病。
•疫苗开发：腺病毒载体在疫苗开发中具有重要的作用。
腺病毒载体的高分子修饰
中国生物工程杂志!"#$%&'$()*+#%(,(-. /011 21 3 111 114收稿日期 /011501520!!修回日期 /0115025/6国家自然科学基金 20600241 福建省自然科学基金/0067040/6 福建省生物医药工程研究生教育创新基地 03080/04 资助项目通讯作者 电子信箱9$:;*$<#9:=*>:=+%综!!述腺病毒载体的高分子修饰魏!林1 /!邱!飞1 / !刁!勇1 /1华侨大学分子药物学研究所!泉州!23/0/1!/分子药物教育部工程研究中心!泉州!23/0/1摘要!腺病毒载体是基因治疗的常用载体之一 已经广泛应用于肿瘤和遗传疾病等的基因治疗研究中 但是临床发现腺病毒载体有较高的免疫原性 同时缺乏组织或细胞特异性 制约了其在临床上的应用 通过共价键结合或者静电力作用 将高分子修饰到病毒衣壳上 利用高分子的特殊性质可以降低载体的免疫原性和提高载体的靶向性 同时载体保持了较高的转染能力 主要综述了近年来采用高分子对腺病毒载体进行修饰的研究进展 关键词!腺病毒载体!高分子!靶向性!免疫原性中图分类号!?@16!!基因治疗是近几十年来发展起来的一种治疗疾病的手段 已经成功地应用于临床 具有广阔的发展前景 1 腺病毒载体具有宿主范围广 病毒颗粒比较稳定以及基因组较少发生重排等优点 是基因治疗研究中最常用的病毒载体之一 / 至/010年底 全世界已批准进行临床研究的基因治疗案例共有13AA 例 其中有A00例使用腺病毒作为载体 约占总数的/2B @C 2 但是人体内的多种细胞都表达腺病毒受体 载体的特异性比较低 靶向性较差 另外 血液内的各种中和抗体 吞噬细胞对腺病毒载体有较高的识别和吞噬能力 使得载体存在严重的免疫原性 不利于病毒载体的重复给药 制约了它在临床上的应用 因此 如何降低腺病毒载体的免疫原性 提高其靶向性 成为基于腺病毒载体的基因治疗亟需解决的问题 近年来 研究人员发现对腺病毒载体进行高分子修饰 可以降低腺病毒载体的免疫原性 提高载体的靶向性 同时保持较高的转染能力 本文主要对高分子修饰腺病毒载体的研究进展进行综述!"腺病毒载体与高分子修饰腺病毒的直径在30D 60%E 之间 是一种无包膜的双链FG H 病毒 主要由二十面体结构的衣壳蛋白和长度为20D A0IJ 的线性双链F G H 构成 腺病毒的衣壳蛋白主要有六邻体 五邻体和蛋白纤维构成腺病毒衣壳蛋白上大约有1@00个氨基酸残基 这些氨基酸残基可以通过共价键和高分子如聚乙二醇 聚G 5 /K 羟丙基 甲基丙烯酰胺等结合 A 此外 腺病毒衣壳带负电性 能够与带正电的聚阳离子高分子通过静电力结合 经过修饰后 高分子可以直接与腺病毒载体抗原决定簇结合或者通过其长链将抗原决定簇包裹住 从而可以避开血液中的各种中和抗体和吞噬细胞的识别 有效降低免疫反应 利于腺病毒载体的重复摄入而且能保持转染效率不变 此外 高分子的官能团上还可以连接靶向配体使载体具有新的靶向性 高分子修饰可以在病毒经过分离纯化后进行 可以保持较高病毒滴度 非常适于改造病毒载体 因此 高分子修饰已经成为改造腺病毒载体的重要方法 下面将根据高分子的不同类型进行综述#"腺病毒的聚乙二醇 L M N 修饰1666年 O P Q $(R >&%等 4 首次报道了L M N 通过共价中国生物工程杂志"#$%&'$()*+#%(,(-.S(,=21G(=3/011结合方式修饰腺病毒载体来降低其免疫性 经过修饰的腺病毒保持了病毒颗粒的完整性 同时覆盖了病毒载体的免疫结合位点 而L M N自身又无免疫原性 因此载体的免疫原性得到了有效的降低 体内实验表明 在抗体存在的条件下 载体依然表现出了良好的基因转染能力#$!"降低载体的免疫原性和毒性深入研究发现经过修饰后 病毒的转染能力 抵抗中和抗体的能力与L M N分子量 末端活性基团以及L M N改性后的结构等有关 3 采用含不同末端活性基团的L M N衍生物 琥珀酸琥珀酰亚胺5L M N TTL M N 三氟代乙基磺酰5L M N U V L M N 和三聚氯氰5L M N ""L M N 对腺病毒载体修饰后发现 与未经L M N修饰的对照组相比 小鼠的脾细胞中的W X G5-和W Y5/的含量均明显降低 三种衍生物组间没有显著性差异 但是TTL M N与U V L M N组小鼠脾细胞中的W Y510含量却是""L M N组的两倍 8 说明""L M N修饰的载体的免疫原性更低 更有利于其应用于临床不同分子量L M N修饰后的病毒载体在血液中受到的阻力也不同 使得载体在体内有着不同的分布结果 如小分子量的L M N 2B4D4IF& 修饰不能阻断载体在肝组织细胞中富集 @ 但是高分子量的L M N能够显著降低载体在肝脏中富集的能力 /0IF&L M N修饰的载体在肝脏中的富集水平仅为/或4IF&L M N的十分之一 6 Z(;#*R R等 10 就不同分子量 4 /0 24IF& 的L M N修饰后 病毒载体对肝细胞的转染能力进行研究 发现经4 IF&L M N修饰的载体转染能力最强 表明载体能够有效富集在肝脏细胞中 而其他两种分子量修饰的载体转染能力较差 动态光散射法得到4 /0和24IF&分子量L M N修饰的腺病毒在缓冲溶液中的直径分别为12/ 1A4 14@%E 因此Z(;#*R R认为 粒径大小可能是影响载体进入肝脏软组织的重要原因 近年 有研究发现大分子量L M N修饰的载体降低血液中补体蛋白水平的能力较小分子量的L M N要强 11 因此 对病灶位于肝脏外的患者 采用大分子量的L M N修饰更具优势比较多聚赖氨酸接枝L M N L Y Y5-5L M N 和嵌段L M N L Y Y5J5L M N 两种不同结构L M N修饰载体的转基因表达效率时发现 在没有血清的情况下 两者的转染效率相当 但是在血清存在的条件下 嵌段聚合物修饰的载体的表达量要比接枝聚合物修饰的载体高出3倍 1/ 该结果表明 聚赖氨酸嵌段聚乙二醇结构能够更好地包裹在腺病毒的表面 抵抗血清内中和抗体的作用#$#"靶向性修饰腺病毒能够与表达柯萨奇K腺病毒受体 "H Q 的细胞非特异性地结合 并以内吞的方式进入细胞 体外实验表明 L M N修饰后的载体对"H Q阳性的细胞的转染量下降了约66C 证实L M N修饰能有效阻断载体与细胞"H Q结合 6L M N在有效地阻断"H Q受体与病毒的结合的同时 需要引入新的靶向结构来解决靶向性的问题 7$等 12 利用肿瘤细胞表皮生长因子受体 M N X Q 较多的特点 以表皮生长因子 M N X 作为靶向材料 连接在L M N修饰的载体上 与不含M N X的载体相比 表达效率明显提升 经过M N X修饰的载体在含有M N X Q细胞中的转染量比在不含M N X Q细胞中转染量可高出约3倍 表现出了很好的靶向性目前常用的靶向材料多为多肽 蛋白和抗体 这些靶向材料也可能会带来新的免疫问题 1A 因而选用更安全的靶配体对提高载体安全性颇有价值 利用肿瘤细胞表面叶酸受体过表达这一特点 O#等 14 以小分子叶酸为靶配体 连接在L M N修饰后的腺病毒载体末端 不仅降低了载体免疫原性 靶向性也显著提高 端粒逆转录酶是近年发展起来的治疗癌症的新靶点 有报道以端粒逆转录酶启动子作为靶配体连接在L M N修饰的腺病毒载体上 能够有效抑制转移肺癌细胞增值 且副作用较小 13%"腺病毒的聚G5 #&羟丙基 甲基丙烯酰胺 [Z L V H 修饰!![Z L V H是临床研究中常用的亲水性的高分子材料 分子量小于20IF&的[Z L V H有着较低的免疫原性和良好的生物相容性 可用作药物载体 18 以[Z L V H作为病毒载体的修饰材料也有相关的报道 1@ [Z L V H对腺病毒进行修饰的常用的活化衍生物有A K 硝基苯氧基取代物和噻唑烷K/K硫酮取代物 A K硝基苯氧基酯取代物单体在聚合过程中 活性酯基容易水解 导致产物性能不稳定 16 噻唑烷K/K硫酮取代物化学选择性更强 不易水解但是氨解速度却很快 利于聚合物与氨基酸残基的反应 /0%$!"降低载体的免疫原性和毒性癌细胞转移是导致癌症患者死亡的主要原因 对于已经转移的癌细胞 系统给药无疑是最佳治疗途径 但是人血液中红细胞上的"H Q和补体受体1 "Q1 会/11/011 21 3 魏!林等 腺病毒载体的高分子修饰与腺病毒发生凝聚而降低载体的转染效率 影响了系统给药的疗效 经过修饰后 病毒与"H Q的结合能力显著降低 甚至失去进入"H Q阳性的H4A6细胞的能力 /1 在含有红细胞的缓冲溶液中 经过[Z L V H修饰的载体活性大约是未经修饰的载体的10倍 // S,&>$E$R等 /2 深入地研究了[Z L V H修饰后的载体抵抗血液凝聚的能力 结果证明经过修饰后的载体基本失去了与"H Q结合的能力 与红细胞以及"Q1的结合能力也显著降低 最高可降低84C 此外[Z L V H 还能有效阻断五邻体基底与\因子的结合 降低载体的毒性 N R**%等 /A 将经过[Z L V H修饰和未经修饰的腺病毒载体通过静脉注射到不同小鼠体内 发现注射修饰载体的小鼠体内丙氨酸转氨酶水平较注射未修饰载体的一组要低10倍以上 与空白对照组相同 基本没有肝毒性经过[Z L V H修饰后 腺病毒与表达"H Q的细胞的结合能力显著降低 避免抗体的凝聚和各种嗜性细胞的吞噬 降低了毒性 增加载体血液停留时间 为治疗癌症 尤其是癌细胞已经转移的患者提供可能%$#"靶向性修饰[Z L V H可以通过多个共价键与病毒衣壳结合 /1 未成键的活性基团可以接上靶向配体 使修饰后的载体具备靶向性V(R R$](%等 /4 以E M N X作为靶向配体 并采用腹腔给药用以治疗癌症小鼠模型 T^O S2 取得了良好的治疗效果 N R**%等 /3 使用X N X5/作为靶向配体 发现修饰后的载体 不仅在体内停留时间延长 而且还能避免与表达"H Q受体的细胞结合 腹腔注射未修饰 H> 靶向修饰 X N X5[+5H> 和未经靶向修饰 [+5H> 的载体用以治疗癌症小鼠模型 T^O S2 三者都表现出了治疗效果 [+5H>给药组的治疗效果较其他两者要差而H>给药组的治疗效果虽好 却出现了较严重的肠粘连 只有X N X5[+5H>给药组不仅治疗效果良好 且副作用小除了通过连接靶向配体得到趋向性的载体外 利用M L Q效应 也能实现载体的靶向性 如[Z L V H修饰的腺病毒载体 能有效富集在肿瘤部位 病毒数目可达到未修饰载体的A0倍 而在肝脏中病毒的数目仅为未修饰载体的A0C左右 /8'"其他高分子修饰的腺病毒载体除了L M N与[Z L V H外 近年来 采用其他高分子对腺病毒载体进行修饰也有相关报道^&]E&%等 /@ 利用阳离子的正电性 将乙烯二醇二缩水甘油基醚K2 2_ M N F M52 2_ 与腺病毒直接结合 形成复合物 对U""T`L细胞 一种几乎不表达"H Q的细胞系 的转染实验表明 修饰后的载体转染能力显著提高 聚乙二胺也能与腺病毒结合 经过修饰后 载体的a*)&电位由K12B6E S上升到12B/E S 对显负电性的细胞膜的亲和力显著提高 实验结果表明 修饰后的腺病毒载体对"H Q表达或者不表达的细胞的转染能力较未经修饰的载体均得到了显著提高 /6 虽然聚阳离子修饰腺病毒载体能够提高载体转染能力 但是由于阳离子的细胞毒性 副作用较明显 7$等 1/ 在多聚赖氨酸 L Y Y 末端引入L M N链段 降低了L Y Y的细胞毒性 而载体的转染能力却比仅采用L Y Y修饰要高 M][*%,&:J等 20 采用多糖修饰腺病毒载体 结果发现即使在"H Q高表达的细胞系中 载体的转染水平仅为未修饰载体的百分之一 小鼠体内试验表明 采用系统给药 修饰载体也不会在肝脏中富集 表明多糖能够有效降低腺病毒载体与"H Q受体的结合能力 L&R I 等 21 合成了壳聚糖5L M N共聚物 并接上叶酸作为靶向基团 利用壳聚糖与腺病毒载体的静电结合力形成纳米粒子 实验结果表明 修饰后的载体对叶酸受体过表达的癌细胞转染效率显著提高 表现出了良好的靶向性 壳聚糖还能够直接利用共价键将壳聚糖与腺病毒载体结合 虽然修饰后载体的转染能力有所下降 但是在抗体存在的条件下 转染能力要高于未经修饰的载体 2/ 研究发现壳聚糖对粘膜组织具有粘附性和较高的渗透性 22 可以利用这一特点定向给药("展"望高分子独特的性能使其不仅能阻断病毒衣壳蛋白的抗原决定簇 还能在高分子的官能团上连接靶向配体 实现靶向给药 克服了病毒载体自身免疫原性高 靶向性差的缺点 但是鉴于目前高分子材料和修饰方法的限制 修饰后腺病毒载体的性能并未达到理想状态 今后 可以从以下几个方面进行研究 设计结构特异的高分子材料 如星型 梳状 树枝状改性的L M N等 使能够更好地包裹在腺病毒的表面 抵抗血清内中和抗体的作用等 开发定向与病毒载体衣壳蛋白特异氨基酸残基反应 比如与半胱氨酸的巯基反应 的方法 选择温和的反应条件 提高修饰载体的选择性 降低修饰的随机性 同时 将修饰后的病毒载体制备成不同剂型 拓宽给药途径等211中国生物工程杂志"#$%&'$()*+#%(,(-.S(,=21G(=3/011除了对腺病毒载体进行修饰外 采用高分子修饰其他病毒载体的研究也有报道 2A524 随着高分子材料的发展 利用高分子修饰病毒载体 提高载体的性能 必将受到越来越广泛的应用 必将在基因治疗的研究中扮演越来越重要的角色参考文献1 ^$ET b L*%-aZ ^&%*>&bX *)&,=":R R*%)])&):](;-*%*)#*R&[.$%H]$&=V(,U#*R /00@ 13 / /285/A2=/ c(%-&%&%L "R(.,*VH=L M N.,&)*>&>*%(d$R:]*] ;R(EE$+*)( E(%I*.]=S$R:]*] /010 / A3@540/=2 ",$%$+&,U R$&,]$)&S*+)(R]:]*>$%-*%*)#*R&[.+,$%$+&,)R$&,=#))[ e e f f f=&J*>$&=+(E e f$,*.e d*+)(R]=[#[=A O,$d*R V U ^*R R.FX 7:,$&Z *)&,=N,.+(d$R:]*] 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腺病毒载体工艺平台介绍
腺病毒载体工艺平台介绍腺病毒载体是一种常用的基因传递工具，被广泛应用于基因治疗和基因工程研究领域。
为了应对不同研究需求和提高载体表达效率，许多研究人员和企业建立了腺病毒载体工艺平台，以帮助加速基因传递和基因治疗的研究进展。
腺病毒载体工艺平台是一种综合的研究和生产系统，主要包括以下几个方面：1. 载体构建：利用分子生物学技术，将感兴趣的基因序列插入腺病毒基因组的合适位点。
在载体构建过程中，可以根据需要选择不同的载体类型、启动子、响应元件等，以调控基因的表达水平和时机。
2. 载体包装：通过与辅助质粒（helper plasmid）共转染细胞，使细胞内形成完整的腺病毒基因组，并通过细胞内重组事件来复制和包装腺病毒颗粒。
载体包装的过程中，通常需要参考文献中的方法和优化步骤，以获得高效的包装效率。
3. 病毒扩增：将包装好的腺病毒载体接种到适宜的宿主细胞中，通过培养和扩增过程，使腺病毒繁殖并增加至足够的浓度。
扩增过程中要注意控制细胞的生长状态、感染剂量和细胞培养条件，以获得高产量和活性的腺病毒。
4. 病毒纯化：通过离心、超滤和柱层析等技术手段，从扩增培养物中纯化腺病毒颗粒。
纯化过程中，可以采用单步或多步骤的方法来去除杂质、浓缩和提纯腺病毒。
5. 固定化：对腺病毒进行固定化处理，可用于获得更稳定、可储存和长期使用的腺病毒制剂。
常用的固定化方法包括酶解固定化、化学固定化、冻干固定化等。
6. 质量检测：对纯化的腺病毒产品进行质量鉴定，包括病毒滴度测定、细胞感染测定、基因表达水平测定等。
同时，还可以进行病毒颗粒观察、基因序列测定、重组蛋白表达等验证实验。
腺病毒载体工艺平台的建立有助于提高基因治疗和基因工程研究的效率和可靠性。
通过系统、规范和高效的工艺流程，可以大幅度减少研究人员在载体构建、病毒包装和纯化等环节上的工作量，同时提高腺病毒的产量和纯度。
这为基因治疗的临床应用以及基因工程研究提供了可靠的技术支持。
腺病毒载体工艺平台是基因治疗和基因工程研究中不可或缺的一部分。
小鼠SIGIRR基因重组腺病毒的构建及鉴定
１ ． ２ 方 法
并检测 Ｓ Ｉ ＧＩ ＲＲ ｍＲ ＮＡ 及 蛋 白在 感 染 细 胞 中 的表 达 。通过 多次 扩 增后 ， 大 量 制 备 高 滴 度 腺 病 毒 以备 作 研究 Ｓ Ｉ ＧＩ Ｒ Ｒ在 ＡＬ Ｉ 中的保 护作 用 。
１ ｒ ｅ ｃ ｅ ｐ ｔ ｏ ｒ ｒ ｅ ｌ ａ ｔ ｅ ｄ ｐ ｒ ｏ ｔ ｅ ｉ ｎ ， Ｓ Ｉ ＧＩ ＲＲ） 是 新 近 发 现 的
司产 品 ； 小 量质 粒 抽 提 试 剂 盒、 Ｔｒ ａ ｎ ｓ ２ Ｋ Ｐ ｌ ｕ ｓⅡ
ＤＮＡ Ｍａ ｒ ｋ ｅ ｒ ， 北京 全时 金 生 物公 司产 品 ； 琼 脂 糖 凝
样 受体 （ ＴＬ Ｒ ）
中图分类号 ： Ｑ７ ８ ４ 文献标识码 ： Ａ 文章编号 ： １ ０ ０ ７ — ５ ０ ３ ８ （ ２ ０ １ ３ ） １ ０ — ０ ０ ０ １ — ０ ８
急性肺 损 伤 （ ａ ｃ ｕ ｔ ｅ ｌ ｕ ｎ ｇ ｉ ｎ ｊ ｕ ｒ ｙ ， ＡＬ Ｉ ） 是 临床 上
常 见 的急危 重 症 之 一 ， 其 危 害 主 要 由炎 症 失 控 而 引
委员 会 的批 准 ） 。
１ ． １ ． ２ 主要 试 剂 兔抗 鼠 Ｓ Ｉ ＧＩ Ｒ Ｒ抗 体 、 ＨＲ Ｐ标
记 羊抗 兔 二 抗 ， 美 国 Ａｂ ｃ ａ ｍ 公 司产 品 ； 苏木 素 伊 红 （ ＨＥ ） 染色 试剂 盒 、 免 疫 组织化 学试 剂 盒 （ Ｓ Ｐ法 ） ， 为
（ 第 四军 医 大 学 唐 都 医 院胸 腔 外 科 ， 陕西西安 ７ １ ０ ０ ３ ８ ）
摘 要 ： 拟 构建 小 鼠 Ｓ Ｉ Ｇ Ｉ ＲＲ基 因重 组腺 病毒 并进 行鉴 定 ， 为Ｓ Ｉ ＧＩ ＲＲ在 小 鼠急性 肺损 伤 预 防及 治 疗方
共表达口蹄疫病毒VP1-2A基因与猪IL-2重组腺病毒的构建及其免疫效果研究
摘 要 ： 构 建共表 达 口蹄 疫病 毒 （ Ｆ ＭＤＶ）ＶＰ １ — ２ Ａ 基 因和猪 白细胞介 素 ２ （ Ｉ Ｌ 一 ２ ） 基 因的 重组 腺 病毒 ， 并
研 究重组病 毒 对 小鼠特 异性 免疫 的影 响 。将 Ｆ ＭＤ Ｖ ＶＰ １ — ２ Ａ 基 因和猪 Ｉ Ｌ － ２基 因先后 克 隆到腺 病毒 的穿梭 载体 ｐ Ａｄ ｅ ｎ ｏ Ｖａ ｔ ｏ ｒ — Ｃ ＭＶ５ 一 Ｉ Ｒ Ｅ Ｓ — ＧＦ Ｐ 中， 在 受 体 茵 中与腺 病毒 骨 架 载 体 ｐ Ａｄ ｅ ｎ ｏ Ｖａ ｔ ｏ ｒ Ａ Ｅ １ ／ Ｅ ３同 源重 组 。
ｒ Ａｄ ５ ＶＰ １ — ２ Ａ — ｐ ｏ Ｉ Ｌ 一 ２可望成 为 口蹄 疫 的候 选 疫 苗。
关键 词 ： 口蹄 疫病毒 ； 重组腺 病 毒 ； ＶＰ １ － ２ Ａ基 因； 白细 胞介素 ２
中图 分 类 号 ： ￥ ８ ５ ２ ． ６ ５ ９ ． ６ 文献 标 识 码 ： Ａ 文章编号 ： １ ０ ０ ７ — ５ ０ ３ ８ （ ２ ０ １ ４ ） ０ ２ — ０ ０ ０ １ — ０ ５
点的研究 表 明， 发 挥 主 要 作 用 的 是 ＶＰ １蛋 白 ， 但 ＶＰ １ 蛋 白上 线性表 位诱 导 的免疫应 答不 能有 效保 护 病毒 的攻 击 ， 研 究者 试 图通 过各 种 细胞 因子佐 剂 ， 刺 激 Ｔ 细胞 ， 提 高细 胞免 疫应答 ， 抵抗 强毒 的攻 击 ］ 。 白细胞介 素 ２ （ ｉ ｎ ｔ ｅ ｒ ｌ ｅ ｕ ｋ ｉ ｎ － ２ ， Ｉ Ｌ 一 ２ ） 是 一 种 广 泛 使 用 的疫 苗佐 剂 。Ｑｉ ｎ Ｙ等 ＿ ７ ］ 通 过 内部 核 糖体 进 入 位点成 功 构建 了 串联表 达 Ｂ Ｃ Ｒ／ ＡＢ Ｌ和 Ｉ Ｌ 一 ２ 的
中药抗病毒研究进展
长久以来，由 微 生 物 感 染 引 起 的 疾 病 曾 一 直 困 扰 着 人 类， 自 １９２９年人类首次发现青霉素开始，越来越多的抗生素被发现 并应用于临床疾病的治疗，在人类历史上发挥了重大作用。然 而由于病毒结构的特殊性，时至今日仍然缺乏特异性的抗病毒 药物。面对不断涌现的威胁人类生命健康的新病毒种类，我们 迫切地需要研制 出 疗 效 肯 定、具 有 针 对 性、安 全 风 险 低 的 新 型 药物。中药在治疗病毒感染性疾病方面具有独特效果，近年在 国际上也掀起了研究中药制剂抗病毒的热潮。本课题组针对 目前常见病毒种类及中药疗效研究进展进行概述。
１．２ 乙型肝炎病毒
到目前为止乙型肝炎病毒仍然是严重威胁人类生命健康 安全的全球性问 题，目 前 对 于 乙 型 肝 炎 病 毒 缺 乏 特 异 性 疗 法， 临床上主要应用的干扰素以及核苷类药物存在副作用大、应答 率低的缺点，因此亟需研发新型低毒性的抗 ＨＢＶ药物。目前 发现的有效抗病 毒 单 味 中 药 主 要 有 黄 芩、苦 味 叶 下 珠、赛 菊 宁 黄质、姜黄属、绿茶多酚、刺槐、虎杖、红背叶根等。赛菊宁黄质 为台湾柳杉中提 取 的 一 种 活 性 成 分，一 项 研 究 表 明 ［８］，赛 菊 宁 黄质能够抑制肝癌细胞中乙型肝炎病毒的复制与表达，主要机 制是抑制 ＨＢｓＡｇ核心启动因子转录复合物的形成。苦味叶下 珠属大戟科油柑 属，具 有 利 水 解 毒、平 肝 清 热 等 功 效。 近 年 研 究［９］表明苦味叶下珠可体外抑制乙型肝炎病毒的 ＲＮＡ转录， 也能够通过减少转录因子 Ｃ／ＥＢＰ与乙型肝炎病毒 ＤＮＡ的结 合，特异性抑制 ＨＢＶＥｎｈＩ的活性。吴莹等［１０］发现经叶下珠提 取物治疗的乙型肝炎病毒感染伴急性肝炎的小鼠模型，其病毒 的表达与复制受到明显抑制，经叶下珠处理过的 ＨｅｐＧ２细胞 中的乙型肝炎病毒 ＤＮＡ释放量也明显减少。苦参中含有苦参 碱和氧化苦参碱，能够保护肝细胞，促进肝细胞的修复和再生， 实验表明［１１］氧化苦参碱能抑制 ＨＢＶ的 ＤＮＡ复制。黄芪的主 要活性成分包含 黄 芪 总 苷、黄 芪 多 糖，能 够 通 过 调 节 慢 性 乙 型 肝炎患者免疫功能发挥保肝作用。吴晓蔓等［１２］将等量黄芪药 液分别作用于健康受试者和慢性乙型肝炎患者的外周血单个 核细胞，于 ４８小时后收集上清液，结果显示黄芪能明显提高慢 性乙型肝炎患者和健康受试者体内的 Ｔｈ１类细胞因子的表达 水平，且慢性乙型肝炎患者 Ｔｈ１类细胞因子上升水平显著高于 健康受试者组。表明黄芪能够通过上调 Ｔｈ１类细胞因子水平 参与抗乙型肝炎病毒的效用。
重组腺病毒载体介导外源性XIAP抑制听皮层GABA能神经元凋亡与老年性聋相关性研究进展
楚 ， 研 究 发 现 外 周 听觉 系 统 和 听 觉 中 枢 功 能 失 调 共 同参 与 但
了 老 年 性 聋 的 发 病 ， 中 听 觉 中 枢 神 经 细 胞 凋 亡 引 起 听 觉 中 其
枢 功 能 障 碍 是 老 年 性 聋 患 者 听 力 下 降 、 言 理 解 能 力 降 低 的 语
主要 原 因 之 一 。 。
凋 亡 抑 制 蛋 白（ｎ ｉｉ ｒｏ ａ ｏ ｔｓ ｒｔｉ，ＡＰ 是 一 ｉｈｂｔ ｆ ｐ ｐｏｉ ｐ ｏｅ Ｉ ） ｏ ｓ ｎ 类 抑 制 细胞 凋 亡 的 内 源 性 抑 制 蛋 白 。Ｌ ｉ Ｍｉ ｒ 验 室 成 ｏｓ ｌ 实 ｅ 员 最 早 在杆 状病 毒 体 内发 现 一 组 能 抑 制 被 感 染 细 胞 发 生 凋 亡 的蛋 白 ， 将 其 命 名 为 Ｉ 并 ＡＰ蛋 白 。 随 后 的研 究 发 现 ， ］ 与 Ｉ Ｐ蛋 白具 有 同源 性 的 蛋 白在 哺 乳 动 物 、 虫 、 菌 等 许 多 Ａ 昆 细 物 种 体 内普 遍 表 达 。 迄 今 为 止 ， 究 者 们 发 现 人 体 内 Ｉ 研 ＡＰ 家族共包 含 ８ 成员 ， 中 ｘ 染色体连 锁凋亡抑 制蛋 白 （ 个 其 Ｘ
至少包 含 １ ４个 成 员 ， 中 ｃｓａｅ ９是 线 粒 体 中 ｃｓａｅ 其 ａｐｓ － ａｐ ｓ 途 径 的起 始 因 子 ，ａｐｓ 一 ３和 ｃｓａｅ ７是 下 游 的执 行 者 。 ｃｓａｅ ａｐ ｓ一 Ｘ Ａ 中 ＢＲ ＩＰ Ｉ ３结 构 域 能 直 接 与 ｃａ ａｅ ｓｐ ｓ 一９结 合 ， ｃｓａｅ 使 ａｐｓ
明确 Ｘ ＡＰ对 老 年性 聋 听 皮 层 相 关 细 胞 的 抗 凋 亡 作 用 ， Ｉ
９保 持 单 体 形 式 ， 制 ｃｓ ａｅ 游 级 联 反 应 ， 而抑 制 相 抑 ａｐ ｓ 下 从