初级检验士考试(临床免疫学和免疫检验)讲义第三章免疫原和抗血清的制备复习过程

第三章免疫原和抗血清的制备

第一节免疫原的制备

第二节免疫佐剂

第三节抗血清的制备

第四节抗血清的鉴定和保存

第五节抗血清的纯化

第一节免疫原的制备

免疫原指能诱导机体产生抗体或致敏淋巴细胞，并能在体内外与抗体或致敏淋巴细胞发生特异性反应的物质。免疫原相当于抗原。

一、颗粒性抗原的制备

颗粒性抗原：各种细胞、细菌、寄生虫。

1.细胞抗原（如绵羊红细胞）一般情况下经生理盐水或其他溶液洗净，配制一定浓度即可。

2.细菌抗原多用液体或固体培养物，经集菌后处理。颗粒性抗原大多用静脉内注射免疫法，较少加佐剂作皮内注射。

二、可溶性抗原的制备和纯化

（一）可溶性抗原的制备

蛋白质、糖蛋白、脂蛋白、酶、补体、细菌毒素、免疫球蛋白片段、核酸等皆为良好的可溶性抗原，免疫前常需提取和纯化。

1.组织细胞抗原的制备

细胞破碎方法有：

（1）高速组织捣碎机法。

（2）研磨法，可用组织匀浆器或乳钵。

2.组织细胞或培养细胞可溶性抗原制备

第一步单个细胞获得的方法

（1）机械捣碎

（2）酶处理法，常用胃蛋白酶或胰酶

第二步细胞破碎方法有：

（1）反复冻融法

（2）超声破碎法

（3）自溶法

（4）酶处理法，常用溶菌酶、蜗牛酶、纤维素酶

（5）表面活性剂处理法

3.免疫球蛋白片段的制备

五种免疫球蛋白都具抗原性，皆可提取及纯化，但如分解成片段（如Fab片段、Fc片段、轻链片段等）

作为免疫原可制备出分辨力更高的特异性抗血清。

（1）非共价键解离法

（2）共价键解离法

（3）溴化氰裂解法

（4）酶解法

1）木瓜酶可将IgG裂解成2个Fab片段及1个Fc片段。

2）胃蛋白酶可将IgG裂解成F（ab’）2片段及数个小片段。

3）胰蛋白酶可将IgG切成不规则的肽链。

（二）可溶性抗原的纯化

1.超速离心法仅适用于少数大分子抗原及一些比重较轻的抗原，而不适用于大多数中小分子抗原。

2.选择性沉淀法

（1）核酸去除法可采用氯化锰、硫酸提取鱼精蛋白等核酸提取沉淀剂。核糖核酸降解法更简便（采用DNA或RNA酶）。

（2）盐析法常采用硫酸铵使蛋白抗原进行粗筛、提取丙种球蛋白及抗原浓缩。

（3）有机溶剂沉淀法常采用乙醇或丙酮。

（4）聚合物沉淀法常用非离子型聚合物，如分子量为2000～6000的聚乙二醇（PEG）。

3.凝胶过滤法

又叫分子筛层析。通过凝胶分子筛作用，可将大、中、小三类分子分开，选择凝胶柱时应注意选用适于分离范围内的凝胶。

4.离子交换层析法离子交换层析是利用一些带电离子基团的凝胶或纤维素，吸附带有相反电荷的蛋白质抗原常用的离子交换剂有离子交换纤维素、离子交换凝胶、离子交换树脂。

5.亲和层析法

亲和层析是利用生物分子间所具有的专一性亲和力而设计的层析技术。如抗原和抗体、酶和酶抑制物、酶蛋白和辅酶、激素和受体、DNA和RNA等之间有特殊亲和力，一定条件下，两者可紧密结合成复合物，如将复合物的一方固定于固相载体上，则可从溶液中分离和提纯另一方。

（1）亲和层析支持物的选择

常用的有琼脂糖珠（sepharose2B、4B、6B）、琼脂糖、聚丙乙烯酰胺、多孔玻璃球等。

（2）抗原或抗体与支持物的结合

载体结合法、物理吸附法、交联法和网络法。

6.电泳法

（三）纯化抗原的鉴定

1.蛋白含量测定采用紫外光吸收法、双缩脲法、酚试剂法等,常用的是紫外光吸收法，该法测定280nm 和260nm的吸光度值，并根据公式计算蛋白含量。

2.分子量测定采用聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）法、凝胶过滤法等。

3.纯度鉴定采用醋酸纤维膜电泳、SDS-PAGE、毛细管电泳、等电聚焦、高效液相层析法。

4.免疫活性鉴定采用双向免疫扩散法、免疫电泳法或ELISA法等。

三、半抗原性免疫原的制备

半抗原指某物质在独立存在时只具有抗原性而无免疫原性，这些物质称为半抗原

半抗原与蛋白质载体或高分子聚合物结合后才有免疫原性。

（一）载体

1.蛋白质类以牛血白蛋白最常用。

2.多肽聚合物常用多聚赖氨酸。

3.大分子聚合物和某些颗粒聚乙烯吡咯烷酮、药用炭、羧甲基纤维素等皆常用。

（二）半抗原与载体的连接方法

1.物理方法

物理方法是用通过电荷和微孔吸附半抗原，吸附的载体有淀粉、聚乙烯毗咯烷酮、硫酸葡聚糖、羧甲基纤维素。

2.化学方法

化学方法是利用某些功能基团将半抗原连接到载体上

（三）半抗原性免疫原的鉴定

1.吸收光谱分析法

2.放射性核素标记半抗原渗入法

第二节免疫佐剂

一、佐剂的种类

（一）化合物包括氢氧化铝、明矾、矿物油、吐温-80、弗氏不完全佐剂（羊毛脂与液状石蜡的混合物）以及人工合成的多聚肌苷酸：胞苷酸、脂质体等。

（二）生物制剂

1.经处理改造的细菌及其代谢产物，如卡介苗。

2.细胞因子及热休克蛋白

最常用于免疫动物的佐剂是弗氏佐剂，弗氏佐剂分为弗氏完全佐剂（弗氏不完全佐剂加卡介苗）和弗氏不完全佐剂两种。使用时加入水溶性抗原并充分乳化，使抗原与佐剂形成油包水乳剂。佐剂和抗原的比例为1：1。乳化的方法有两种：①研磨法②搅拌混合法。

二、佐剂的作用机制

（一）改变抗原的物理性状，延缓抗原降解和排除，从而更有效地刺激免疫系统。

（二）刺激单核-吞噬细胞系统，增强其处理和提呈抗原的能力。

（三）刺激淋巴细胞增殖和分化

免疫佐剂：与抗原同时或预先注射于机体能增强机体免疫应答或改变免疫应答类型的辅助物质。

第三节抗血清的制备

一、抗血清的概念