fish-荧光原位杂交PPT课件
FISH——荧光原位杂交
FISH ——荧光原位杂交摘要：21三体综合征是怎样用FISH来诊断的？知识点：原位杂交菌落原位杂交荧光原位杂交( F luorescence I n S itu H ybridization, FISH)正常细胞异常细胞？21三体综合征的FISH产前诊断分子杂交(molecular hybridization)反应介质液相杂交固相杂交原位杂交印迹杂交原位杂交(in situ hybridization, ISH) 使探针进入细胞或组织内与待测核酸进行特异性结合形成杂交体从而对待测核酸进行细胞内定位1. 根据待测核酸序列信息设计合成带标记的特异性探针2. 制备待测样本(组织切片/细胞爬片)3. 经变性与复性探针与序列互补的待测靶核酸杂交4. 进行靶核酸的定位检测观察4. 进行靶核酸的定位检测观察 核酸探针的标记1.放射性核素标记：32P 、3H 、35S 等2.非放射性标记：荧光素等 1. 放射性原位杂交2. 荧光原位杂交 ( F luorescence I n S itu H ybridization, FISH) 原位杂交的分类含有目的基因的阳性菌落菌落原位杂交4. 进行靶核酸的定位检测观察荧光原位杂交 ( F luorescence I nS itu H ybridization, FISH)采用荧光素标记的探针与待测样本中的靶核酸进行原位杂交，在荧光显微镜下对荧光信号进行辨别和计数，达到对染色体或基因异常的细胞或组织标本进行检测诊断4. 进行靶核酸的定位检测观察21三体综合征的FISH产前诊断21号待检染色体的特异探针(红色) 和13号对照染色体的特异探针(绿色)与羊水间期细胞进行荧光原位杂交FISH20号染色体着丝粒探针(红色) 和20号染色体基因座特异性探针(绿色)20号染色体微缺失的FISH 检验荧光原位杂交检测染色体易位染色体核型分析检测染色体易位4. 进行靶核酸的定位检测观察荧光原位杂交的临床应用先天性疾病检验唐氏综合征肿瘤疾病检验慢性粒细胞白血病感染性疾病检验HPV、HBV4. 进行靶核酸的定位检测观察荧光原位杂交的临床应用常规诊断标本：全血、骨髓细胞、口腔细胞、精细胞、子宫颈细胞等产前诊断标本：羊水细胞、绒毛细胞等4. 进行靶核酸的定位检测观察FISH ——荧光原位杂交 安全无污染 快速 直观 特异。
荧光原位杂交技术FISH
荧光原位杂交技术FISH1 目的通过FISH实验检测两条Brd2基因cRNA探针的效价。
2材料与仪器2.1材料件为：95℃预变性3 min；95℃变性30 s；50℃退火45 s；72℃延伸45 s；循环30次；72℃再延伸8 min。
2) 将所有PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳检测，采用凝胶回收试剂盒回收并纯化PCR产物，并用微量分光光度计测定其浓度。
3) 进行体外转录反应合成Brd2 cRNA探针，20 μL体外转录反应体系如下：RNaseinhibitor 1μL，10×NTP dig labeling mixture 2μL，10×transcription buffer 2μL，Template DNA 13μL，RNA polymerase 2μL。
4) 37℃水浴孵育2 h，取0.5μL于1%琼脂糖凝胶电泳检测。
5) 加入2μL无RNase污染的Dnase I 37℃水浴孵育15 min来消化模板DNA。
6) 加入EDTA 0.8μL，加入5.6μL NH4Oac终止反应，再加入56μL无水乙醇并混匀，于-80℃放置20 min。
7) 15000 r/min,4℃离心15 min，弃上清，加入700μL 80%的无水乙醇混匀，15000 r/min,4℃离心10 min沉淀RNA。
8) 干燥后用DEPC处理的水50μL溶解RNA。
合成的两条探针经1%琼脂糖凝胶电泳鉴定并用微量分光光度计测定探针浓度，于-80℃保存备用。
3.2荧光原位杂交实验检测探针的效果1) 正常C57BL/6小鼠用1%戊巴比妥钠深麻后，依次以30 mL 0.01 mol/L DEPC-PBS和100 mL含4%多聚甲醛的磷酸缓冲液（PB）行左心室灌注，小心剥离脑组织，于4℃环境下用上述相同固定液进行后固定过夜，后将组织转移浸没于含30%蔗糖的PB溶液中脱水至沉底。
2) 最后取出组织用OTC包埋，冰冻切片机连续切片至需要的层面，切片厚度30 μm。
荧光原位杂交(fish)
荧光原位杂交技术荧光原位杂交技术（fluorescence in situ hybridization），简称FISH。
是利用荧光标记的特异核酸探针与细胞内相应的靶DNA分子或RNA分子杂交，通过在荧光显微镜或共聚焦激光扫描仪下观察荧光信号，来确定与特异探针杂交后被染色的细胞或细胞器的形态和分布，或者是结合了荧光探针的DNA区域或RNA分子在染色体或其他细胞器中的定位。
中文名fish外文名fluorescent in situ hybridization建立时间1986年发展历程1969年，Pardue和John等两个研究小组开始采用放射性标记DNA或28S RNA发明了原位杂交技术（ISH）。
尽管当时原位杂交技术已经具有较高的特异性和灵敏度，但鉴于放射性同位素自身特性的局限，如安全性、空间分辨率低、不稳定性等问题，这项技术仅限于实验室研究方面的应用。
1986年科研工作者开始利用异硫氰酸盐荧光素来标记探针，并在荧光显微镜下进行观察分析，建立了荧光原位杂交技术（FISH）。
1989年，Delong首次使用荧光标记寡核苷酸探针检测单个微生物细胞。
由于FISH技术具有敏感度高、信号强、背景低、快速等优点，该方法在环境微生物的检测中得到了广泛的应用。
随着科技的迅速发展，FISH探针标记物越来越多，不仅从单一荧光发展到多色荧光检测，而且应用范围也进一步扩大，不仅可以用于分裂相细胞而且可以用于间期细胞检测，为FISH技术的临床应用打下了坚实的基础。
操作步骤编辑播报（1）样品的固定；（2）样品的制备和预处理；（3）预杂交；（4）探针和样品变性；（5）用不同的探针杂交以检测不同的靶序列；（6）漂洗去除未结合的探针；（7）检测杂交信号，进行结果分析·荧光信号观察：将处理好的样品置于荧光显微镜下，选择分散较好的区域来观察。
三色（或者更多）荧光激发下，观察到不同颜色的荧光图像。
通常选用20X物镜来扫描样品杂交区域，40X或100X物镜下观察样品，从一定的方向进行计数，并对计数情况进行分析。
FISH荧光原位杂交
(1) 玻片预处理玻片清洗：载玻片与盖玻片用热肥皂水刷洗干净，清水浸泡过夜；1%的盐酸浸泡24小时，蒸馏水清洗干净后置0.1%焦碳酸二乙酯（DEPC）中浸泡过夜。
硅化处理：将载玻片和盖玻片用1%的盐酸煮沸10min后，用0.1%DEPC处理的蒸馏水冲洗，60℃烘干。
盖玻片用锡纸包好4℃保存备用。
黏附剂涂片制备：载玻片放入APES与丙酮的1:50溶液中约1min，取出用灭菌处理过的蒸馏水清洗后于室温下干燥，然后置4℃保存备用。
(2) 样品采集和预处理取样：用经高压灭菌的聚乙烯管子取湿地基质并称量，加灭菌蒸馏水适量振荡混匀，超声波处理使细菌分散。
取清洗下来的悬浊液约1ml进行后续处理。
样品固定与清洗：悬浊液中按1:1加入4%多聚甲醛于4℃固定24小时；将固定样本用磷酸缓冲液(PBS)10000r/min离心漂洗二次，弃去上清液。
用PBS与乙醇的1:1溶液稀释定容至1ml于-20℃保存备用。
热固定与脱水：取10μl样品在载玻片上涂抹24mm×24mm大小，37℃的烘箱热固定2h 后依次用50%，80%，96%乙醇室温下脱水3min，室温干燥。
(3) 杂交反应硝酸菌的探针见表4.2：杂交液配置：总细菌、硝酸细菌、亚硝酸细菌杂交液中去离子甲酰胺（DAF）浓度分别为20%、40%或55%去离子甲酰胺（DAF），其余的相同，SDS 0.1%，Tris-HCl（pH8.0）20mmol/L，NaCl 900mmol/L。
表5-1硝酸菌与亚硝化细菌探针序列Tab. 5-1 Probe and sequences of nitrifying bacteria, denitrifying bacteria and total bacteria 细菌探针名称探针序列（5’—3’）5’—标记总细菌EUB338 GCTGCCTCCCGTAGGAGT HEM硝酸细菌NIT3 CCT GTG CTC CA T GCT CCG FITCCNIT3* CCT GTG CTC CAG GCT CCG亚硝酸细菌NSO190 CGA TCC CCT GCT TTT CTCC HEXCNIT3* 为硝酸菌探针NIT3的竞争探针探针浓度均为50ng/μl。
免疫荧光原位杂交
免疫荧光原位杂交FISH（荧光原位杂交）荧光原位杂交用于通过互补探针序列的杂交来显示确定的核酸序列。
FISH 有很多应用，从基本的基因定位到染色体畸变的诊断（细胞遗传学）。
多色FISH 图像分析需要使用单独的滤光片激发块（立方体）或激发滤光片转轮结合多波段二向色镜和发射滤光片来隔离各种信号。
荧光免疫原位杂交（FISH）和多路复用（Densely Multiplexed）成像的串色当同时使用具有多个密集光谱的荧光染料时，区分荧光标记的能力决定了检测结果的速度和准确性。
在进行荧光免疫原位杂交（FISH）测量时，这种密集的图像复用特别重要。
因此，减少串色（即来自不希望的荧光染料的信号相对于所需荧光染料的信号影响）至关重要。
下表量化了使用特定的BrightLine 荧光免疫原位杂交（FISH）滤光片组时，相邻荧光染料之间的串扰值。
该串扰值决定于典型的归一化荧光染料光谱、滤光片的设计光谱和强金属卤化物灯光谱的重叠。
这些结果已经针对每个给定的滤光片组进行了标准化，因此用户应该读取每行（而不是每列）的值以查看给定滤光片组的预期串扰值。
例如，当使用SpectrumGold™滤光片组对标记有SpectrumGreen™、SpectrumGold™和SpectrumRed™荧光染料的样品进行成像时，不需要的SpectrumGreen 信号将小于所需要的SpectrumGold 信号的2%，并且SpectrumRed 信号将小于1%。
好的滤光片会带来哪些不同 ?BrightLine“不易烧熔”滤光片在多年的使用中，在研究和临床领域都得到了广泛的测试。
BrightLine 荧光免疫原位杂交FISH 滤光片组也进行了严格的独立测试。
结果显示：使用BrightLine 滤光片组进行荧光免疫原位杂交FISH 分析时，无论您是查找和分析中期分裂，还是通过点计数对细胞进行评分，都可以提高分析的速度和准确性。
荧光滤光片简介一个分子吸收其吸收谱带波长范围（即吸收光谱）内的光，然后几乎瞬间发出较长的、位于其发射谱带波长范围（即发射光谱）内的光，此时，就会发生光学荧光。
免疫荧光原位杂交技术FISH
变性杂交
结果统计
羊水标本玻片的制备
离心 胰酶消化 低渗（0.075M KCL） 预固定、固定 滴片（控制好悬液浓度、量、高度）
胰蛋白酶（Trypsin）消化
操作中要控制好酶的工作浓度,适量加大酶 有助于加强消化作用,但盲目加大酶量超过 酶饱和度不一定起到加强消化的作用。实 验中应控制好酶的工作浓度,不同批次、不 同储存时间及温度影响酶消化强度及饱和 度。
37º C 蛋白酶k 5-30min
洗片
DAPI染色
阅片
脱蜡
石蜡切片浸于二甲苯中3次,每次10分钟 浸入100%的乙醇中5分钟.然后梯度复水 各2分钟 浸入去离子水3分钟
(脱蜡不足会导致探针杂交强度和杂交率降低,荧光背景高等)
预处理
I. 100 º C沸水处理组织切片30分钟 II. 100ug/mL的蛋白酶K溶液,37 º C孵育5-30 分钟
HER-2基因扩增模式
肺癌细胞观察计数及结果分析
100X油镜下癌区随机计数100个细胞，计 算红绿信号的比值（Ratio） 扩增：I: Ratio>2 II:15copy>或=10% III:成簇扩增 IV： Ratio<2但4copy>或=40% 阴性：除以上扩增的情况
EGFR基因扩增检测试剂盒 （FISH）
低渗处理和固定
细胞置于KCL低渗溶液中吸收水分可使细胞 胀破，使探针更容易与核内DNA杂交结合 ，便于结果分析。
固定液（乙酸和甲醇1：3配比）加入后形 成核蛋白交联定型。提高细胞核与载玻片 的亲和力，使探针DNA易于进入细胞。
预处理
• • • • • • 37 º PBS 5min C 37 º 0.005%胃酶15min C 1xPBS 3min 1%多聚甲醛10min 1xPBS 3min 2次 梯度脱水
荧光原位杂交技术（FISH）的基本原理及应用
荧光原位杂交技术（FISH）的基本原理及应⽤我接触“FISH”也是刚刚两年多的时间，作为⼀个“初学者”刚开始接触“FISH”可能跟⼤多数⼈⼀样满脑⼦的疑惑：“FISH”是做什么的?有什么临床作⽤呢?那些红红绿绿的点都是些什么意思?……今天让我们慢慢的去揭开FISH的不太神秘的⾯纱。
1.FISH的前世今⽣在FISH技术问世之前，基于20世纪60年代，放射性核素探针的原位杂交⽅法，检测间期染⾊体和分裂期染⾊体上特定DNA和RNA序列的⽅法，该⽅法存在操做⽐较⿇烦、分辨率有限、探针不稳定、放射性同位素的危害较⾼等问题，故⽬前弃之不⽤。
20世纪80年代⽤⾮放射性半抗原如⽣物素进⾏核酸标记的技术逐渐开展后，探针也开始使⽤这种⾮放射性标记⽅法。
随后FISH技术逐渐开展起来，1986年以后该技术被应⽤于分析细胞分裂期染⾊体铺⽚的DNA序列。
相对于放射性来说，FISH具有稳定性好、操作安全、结果迅速、空间定位准确、⼲扰信号少、⼀张玻⽚可以标记多种颜⾊探针等优点。
这些优点逐渐使FISH成为⼀种研究分⼦细胞遗传学很好的⽅法。
FISH即染⾊体荧光原位杂交(Flourescence in situ hybridization,FISH)是通过荧光素标记的DNA探针与样本细胞核内的DNA靶序列杂交，从⽽获得细胞核内染⾊体或基因状态的信息。
FISH是将传统的细胞遗传学同DNA技术相结合，开创了⼀门新的学科——分⼦细胞遗传学。
（如下图所⽰)2.FISH信号解读-红红绿绿是什么⽬前临床上⽤于FISH检测的探针的荧光素⼤都是绿⾊的和橙红⾊标记，可⼤致分为：染⾊体计数(着丝粒)探针(centromere-enumerationprobes，CEP)，位点特异性识别探针(locus-specific identifier probes，LSI)，染⾊体涂染(paint，WCP)探针。
其中CEP和LSI探针中的计数探针、融合探针及分离重排探针，在⾎液病诊断与预后分型中最为常⽤。
酪胺信号放大(TSA)技术-免疫组织化学IHC和荧光原位杂交FISH
试剂盒保存：试剂盒中所有试剂均需4度保存，请在6个月内使用完。
其中，FITC-tyramide、Catalyzer需避光保存，Blocker可分装-20度保存，避免反复冻融。
试剂盒使用须知：本试剂盒针对⽯蜡切片免疫荧光优化。
同时也适用于冰冻切片免疫荧光和铺片细胞免疫荧光。
对于冰冻切片免疫荧光，在切片⽔化，固定后从本试剂盒操作说明第4步加Blocker开始操作。
⽽对于铺片细胞免疫荧光，则在固定，通透后从本试剂盒操作说明第四步加Blocker开始操作。
与传统使用荧光基团偶联⼆抗的显⾊⽅法相比，使用我们的显⾊系统可以将免疫荧光检测的灵敏性提⾼100倍以上，能显著地提⾼信噪比。
使用本试剂盒操作时，Catalyzer和FITC-tyramide的使用均需新鲜配制。
使用本试剂盒，需自备以下试剂：PBSTx：PBS加0.3%的TritonX-100柠檬酸钠缓冲液（10mM柠檬酸钠，0.05% Tween 20， pH 6.0）：Trisodium citrate dihydrate 2.94g加双蒸⽔到1000 ml混匀⾄溶解，使用盐酸将pH调制6.0加⼊0.5 ml的Tween 20，混匀。
可4度长期保存。
操作步骤：1、⽯蜡切片脱蜡⾄⽔：（⽯蜡切片脱蜡前应置于60度30分钟）⼆甲苯I、II，各洗3分钟；⼆甲苯与酒精1：1、洗3分钟。
梯度酒精：100%I，3分钟；100%II，3分钟；95%，3分钟；70%，3分钟；50%，3分钟。
自来⽔洗5分钟。
2、抗原修复：将0.1M柠檬酸盐缓冲液（PH=0.6），用微波炉加热⾄沸腾，将脱完蜡及复⽔好的片⼦置于缓冲液中，持续煮沸20分钟。
注意此过程中，玻片上组织要⼀直浸没于缓冲液中，以保证组织的抗原修复效果。
20分钟后，将玻片立即放⼊自来⽔中10分钟。
主要不要烫伤。
为了节省试剂，使用疏⽔笔将组织圈出，后续的加样与液体置换操作对象为疏⽔圈，加样体积每张玻片100-200ul。