单克隆抗体药物关键技术分析

单克隆抗体药物关键技术分析

1.高通量的动物细胞表达技术

一方面，从表达体系来看，近年来，人们不断发展和完善了许多抗体分子的表达体系，如：细菌、酵母、昆虫细胞、哺乳动物细胞、植物细胞表达系统和体外翻译系统等。哺乳动物细胞表达系统具有活性高、稳定性好等重要优点，已成为抗体等生物技术产品最重要的系统。2007年销售额排名前列的6类生物技术药物中，有5类是由动物细胞表达生产（肿瘤治疗抗体类、抗TNF-α抗体类、EPO类、β干扰素类、凝血因子类），仅胰岛素类药物是由大肠杆菌和酵母表达的。欧美国家哺乳动物细胞表达产品种类占60%-70%，市场份额占65%以上。

另一方面，从抗体制备规模、速度和功能来看，高通量抗体制备技术的发展十分重要。哺乳动物细胞表达生物技术产品大规模高效培养技术是生物医药产品主要的生产方式和关键“瓶颈”技术。目前，国际上该项技术发展较快，已趋成熟，以默克公司为代表的流加培养生产规模达10,000L以上，以贝尔公司为代表的灌流培养生产规模达200L以上，蛋白表达浓度为0.5-2g/L；我国在该技术

领域起步较晚，基础较差，但近年来经过努力，已经实现了该项技术的突破。

2.人源化抗体的构建及优化技术

随着免疫学和分子生物学技术的发展以及抗体基因结构的阐明，DNA重组技术开始用于抗体的改造。抗体药物已经进入基因工程抗体时代。基因工程抗体具有以下优点：①降低人体对异种抗体的排斥反应；②减小抗体的分子量，利于其穿透血管壁，进入病灶的核心部位；③根据需要，制备新型抗体；④采用多种表达方式，大量表达抗体分子，降低生产成本。

(1)表面重塑抗体

对鼠抗体表面氨基酸残基进行人源化改造。该方法的原则是仅替换与人抗体SAR差别明显的区域，在维持抗体活性并兼顾减少异源性基础上选用与人抗体表面残基相似的氨基酸替换；另外，所替换的区段不应过多，对于影响侧链大小、电荷、疏水性，或可能形成氢键从而影响到抗体互补决定区（CDR）构象的残基尽量不替换。我国也已经开始这方面工作的尝试。

(2)重构抗体

由异源抗体中与抗原结合相关的残基与人抗体重新拼接构建的，包括CDR区移植，部分CDR移植和特定决定区（SDR）转移。我国在这方面工作已经取得进展，如北京天广实，回而生公司都在开展这方面工作。

3.全人源化抗体的构建及优化技术

全人源化抗体即抗体的轻重链都是来源于人的抗体，是治疗性抗体的发展趋势。目前获得全人源化抗体方法有抗体库筛选技术，如链置换、基因工程小鼠制备全人抗体。目前比较成熟的是抗体库筛选技术：抗体库筛选技术主要包括噬菌体抗体库、合成抗体库和核糖体展示技术。

(1)噬菌体抗体库技术

1985年，Smith第一次将外源基因插入丝状噬菌体f1的基因Ⅲ，使目的基因编码的多肽以融合蛋白的形式展示在噬菌体表面，从而创建了噬菌体展示技术。20世纪90年代初，人们认识到了噬菌体展示技术在筛选上的巨大潜力，并把它应用于基因工程抗体的制备中，建立了噬菌体抗体库技术，即用已知抗原从较大的抗体库中筛选出目的抗体。该技术在人源性抗体的生产、抗体性能改造和抗体基因研究等方面具有较大的实用价值。

与传统的杂交瘤技术相比，噬菌体抗体库技术具有明显的优越性，即操作简单、稳定有效、筛选容量大、生产成本低等。

(2)核糖体展示技术

目前抗体库技术还受2方面的因素影响：①从未经免疫动物的抗体库获得的抗体亲和力不高；②受外源基因转化率的限制，抗体库的库容不足以涵盖某种动物的抗体多样性。大容量抗体库是获得高亲和力抗体和针对稀有抗原抗体的关键。核糖体展示技术避开了上述不足，可制备大容量抗体库。该技术依赖于mRNA、核糖体和抗体蛋白（或多肽）通过非共价结合形成三联复合体，在无细胞体系中完成转录和翻译，实现了基因型和表型的偶联，翻译出来的抗体可用抗原进行筛选，由于不经过体内转化，构建的抗体库库容可达到甚至超过1011。利用核糖体展示技术可以获得特异的、高亲和力的抗体。

(3)基因工程小鼠技术

基因工程小鼠技术包括人外周血淋巴细胞一严重联合免疫缺陷小鼠、转基因小鼠和转染色体小鼠制备人抗体技术。前者制备人抗体仍存在不少问题，如抗原免疫后

难以产生抗体，无靶向性等；后两者始于20世纪末，技术难度较大，但可制备完整分子、高亲和力的全人抗体。

转基因小鼠技术用于制备全人抗体时，具有功效高、靶亲和力强的优点。但也存在一些缺陷，即该技术生成的抗体具有不完全的人序列和鼠糖基化模式。

由于转基因小鼠不能携带完整人抗体基因，限制了一系列免疫球蛋白的制备。Tomizuka等首先建立并以染色体为载体成功培育了转染色体小鼠，且用该技术制备了高亲和力的抗体。该技术是基因工程小鼠领域的新进展，2004年中国科学院上海生化细胞所开始了转染色体小鼠的研究工作。但至今尚无用转染色体小鼠技术生产的制品问世。