拉米夫定与IFNα-2b序贯治疗对肝癌细胞HBsAg、HBeAg表达及细胞增殖的影响

・基础研究・　山东医药２０１５年第５５卷第３４期　拉米夫定与ＩＦＮｏＬ一２ｂ序贯治疗对肝癌细胞　ＨＢｓＡｇ、ＨＢｅＡｇ表达及细胞增殖的影响　

丁扬　，杨伟　，李婧　，潘晓　，王雪　（１潍坊医学院，山东潍坊２６１０００；２中国人民解放军第８９医院）　

摘要：目的探讨拉米夫定与干扰素（ＩＦＮ）ｏＬ一２ｂ序贯治疗对肝癌ＨｅｐＧ２．２．１５细胞ＨＢｓＡｇ、ＨＢｅＡｇ表达及细胞　增殖的影响。方法取对数生长期ＨｅｐＧ２．２．１５细胞，分为对照组、Ｌａｉｎ组、ＩＦＮ组、联合组和序贯组。对照组不加　药常规培养；Ｌａｉｎ组加入５　ｍＬ拉米夫定２００　，ＩＦＮ组加入１０　０００　ＩＵ／ｍＬＩＦＮｄ一２ｂ　２００　，联合组将拉米夫定、　ＩＦＮ　－２ｂ混合后加入，均培养６　ｄ；序贯组先加拉米夫定培养３　ｄ，再加ＩＦＮｄ一２ｂ培养３　ｄ。采用ＥＬＩＳＡ法检测各组　ＨＢｓＡｇ、ＨＢｅＡｇ表达情况，ＭＴＴ法检测各组细胞增殖情况。结果　实验结束后Ｌａｍ组、ＩＦＮ组、联合组、序贯组的　ＨＢｓＡｇ、ＨＢｅＡｇ表达量均低于对照组，Ｐ均＜０．０５。序贯组ＨＢｓＡｇ、ＨＢｅＡｇ表达量均低于Ｌａｍ组、ＩＦＮ组、联合组，Ｐ　均＜０．０５。对照组、Ｌａｉｎ组、ＩＦＮ组、联合组、序贯组ＯＤ值分别为１．１６±０．０７、１．０８±０．０４、０．５９±０．３１、０．５０±　０．０３、１．０９±０．０４，ＩＦＮ组与联合组ＯＤ值明显低于对照组、Ｌａｉｎ组、序贯组，Ｐ均＜０．０５。其余各组两两比较，Ｐ＞　０．０５。结论　拉米夫定与ＩＦＮ　一２ｂ序贯应用可以抑制ＨｅｐＧ２．２．１５细胞ＨＢｓＡｇ、ＨＢｅＡｇ表达，降低ＩＦＮ　一２ｂ对肝癌　细胞增殖的抑制作用，提示序贯治疗安全、可行。　关键词：拉米夫定；干扰素；序贯疗法；肝肿瘤；细胞增殖　ｄｏｉ：１０．３９６９／ｊ．ｉｓｓｎ．１００２—２６６Ｘ．２０１５．３４．００８　中图分类号：Ｒ７３５．７　文献标志码：Ａ　文章编号：１００２－２６６Ｘ（２０１５）３４－００２２￣２　

拉米夫定、干扰素（ＩＦＮ）抗ＨＢＶ效果确切，但　能否序贯应用仍存在争议。有学者认为，序贯抗　ＨＢＶ治疗可引起耐药¨’　；也有学者认为，序贯抗　ＨＢＶ治疗可有效控制ＨＢＶ数量，改善患者的生活　质量　Ｊ。２０１４年９～１０月，我们观察了拉米夫定、　ＩＦＮ　一２ｂ序贯抗ＨＢＶ治疗对体外培养的肝癌　ＨｅｐＧ２．２．１５细胞ＨＢｓＡｇ、ＨＢｅＡｇ抗原表达及细胞　增殖的影响。现报告如下。　１材料与方法　１．１材料人肝癌ＨｅｐＧ２．２．１５细胞株购于上海　瑞鹿生物科技有限公司。取拉米夫定片（福建广生　堂股份有限公司）０．２　ｇ研磨成粉，加入ＰＢＳ　２０　ｍＬ　配制成拉米夫定母液，４℃保存，实验中稀释至５　ｇ／ｍＬ。将重组人ＩＦＮ￣－２ｂ注射液（天津华利达生　物有限公司）３００万Ｉｕ用蒸馏水稀释至１０　０００　ＩＵ／　ｍＬ。Ｍ１＿ｒ试剂盒购于北京Ｓｏｌａｒｂｉｏ科学技术有限公　司，ＨＢｓＡｇ与ＨＢｅＡｇ检测试剂盒购于北京生物技术　研究所。　１．２细胞分组及干预将ＨｅｐＧ２．２．１５细胞迅速　水浴后，加入含有细胞培养液的离心管中，离心弃上　清，将细胞悬液置于５　ｍＬ细胞培养基中，放人细胞　培养箱。待细胞长成单层后，用０．２５％的胰酶消　２２　化，每１周传代１次。取对数生长期细胞接种于９６　孔板培养２４　ｈ，设对照组、Ｌａｉｎ组、ＩＦＮ组、联合组和　序贯组各５孔。对照组不加药常规培养，Ｌａｉｎ组加　入拉米夫定２００　，ＩＦＮ组加入ＩＦＮ￣－２ｂ　２００　，联　合组将拉米夫定、ＩＦＮｏ【　２ｂ各２００　Ｌ混合后加入，　均培养６　ｄ；序贯组先加拉米夫定２００　培养３　ｄ，　再加ＩＦＮ　一２ｂ　２００　Ｌ培养３　ｄ。　１．３　ＨＢｓＡｇ、ＨＢｅＡｇ表达检测采用ＥＩ　ＩＳＡ法。所　有操作均严格按试剂盒说明书进行，于波长４５０　ｎｌｎ　处用酶标仪读取各孔吸光度（ＯＤ）值。以空白培养　液为阴性对照。　１．４细胞增殖情况检测采用ＭｒＩ’ｒＩ１法。吸取各组　培养孔内液体２００　，加入新鲜培养液９０　，再加　入ＭＴＴ液１１０　继续培养４　ｈ。取上清，每孔加入　Ｆｏｒｍａｚａｎ溶解液１１０　Ｌ，低速振荡１０　ｍｉｎ，使结晶　充分溶解。于波长４９０　ｎｍ处用酶标仪读取各孔ＯＤ　值。　１．５统计学方法采用ＳＰＳＳ１７．０统计软件。计量　资料以　±Ｓ表示，组问比较采用独立样本ｔ检验。　Ｐ＜０．０５为差异有统计学意义。　２　结果　２．１各组ＨＢｓＡｇ、ＨＢｅＡｇ表达比较见表１。　山东医药２０１５年第５５卷第３４期　表１各组ＨＢｓＡｇ、ＨＢｅＡｇ表达比较（ｘ±　）　

注：与对照组相比，　Ｐ＜０．０５；与Ｌａｍ组、ＩＦＮ组、联合组相比，　Ｐ＜０．０５。　２．２各组细胞增殖情况比较对照组、Ｌａｉｎ组、ＩＦＮ　

组、联合组、序贯组的ＯＤ值分别为１．１６±０．０７、　１．０８±０．０４、０．５９±０．３１、０．５０±０．０３、１．０９±０．０４，　对照组、Ｌａｍ组、序贯组ＯＤ值相比差异无统计学意　义，ＩＦＮ组与联合组ＯＤ值相比差异无统计学意义，　但明显低于其余三组，Ｐ均＜０．０５。　３讨论　肝癌ＨｅｐＧ２．２．１５细胞株是由两个头尾相连的　ＨＢＶ—ＤＮＡ全基因重组质粒沾染受体细胞ＨｅｐＧ２而　获得的，可在体外增殖，在细胞培养上清中分泌　ＨＢｓＡｇ、ＨＢｅＡｇ和完整的ＨＢＶ大球形颗粒，同时还　能产生大量的复制中间体，是目前各实验室广泛用　于筛选和评价体外抗ＨＢＶ药物良好的实验模型【４　Ｊ。　拉米夫定是核苷酸类似物中的代表性药物，能　阻止ＨＢＶ在肝细胞内逆转录过程中ＤＮＡ链的延　伸，使病毒停止扩增。但拉米夫定对ＨＢＶ环ＤＮＡ　无直接清除作用　，只有长期使用才能维持病毒低　表达水平，易诱导病毒产生耐药变异，导致用药期间　病毒反跳。ＩＦＮｃ￣一２ｂ是一种多功能免疫调节因子，　可诱导细胞产生抗病毒蛋白，具有特殊的抗病毒作　用。其抗ＨＢＶ的机制可能涉及以下方面：①通过细　胞内信号转导途径，激活细胞内相关酶，直接降解　ＨＢＶ的ＤＮＡ或ｍＲＮＡ，介导ＮＫ、ＮＫＴ、ＣＴＬ等免疫　细胞吞噬ＨＢＶ感染的肝细胞；②诱导感染ＨＢＶ的　肝细胞死亡；③刺激巨噬细胞吞噬ＨＢＶ颗粒等　。　体外实验证实，拉米夫定、ＩＦＮｏ￣－２ｂ序贯治疗对　ＨｅｐＧ２．２．１５细胞ＨＢｓＡｇ、ＨＢｅＡｇ表达的抑制作用　强于二者单独或联合应用　。其可能机制是由于　拉米夫定在ＨｅｐＧ２．２．１５细胞内磷酸化，在ＨＢＶ复　制过程中磷酸化的拉米夫定与ｄＣＴＰ竞争起到抗病　毒作用，拉米夫定协同ＩＦＮｃ￣－２ｂ可通过诱导２　．５　寡　聚腺苷酸合成酶降解ＨＢＶ　ＲＮＡ，进而导致ＨＢｓＡｇ、　ＨＢｅＡｇ表达下调。　ＩＦＮｏ￣．２ｂ单独应用细胞毒性较强。本研究显　示，ＩＦＮａ－２ｂ对ＨｅｐＧ２．２．１５细胞增殖的抑制作用强　

于拉米夫定，但两者联合以及序贯应用时，拉米夫定　可以减轻ＩＦＮ仅－２ｂ对细胞增殖的抑制作用。ＩＦＮｃ￣一　２ｂ对不表达ＨＢＶ的ＨｅｐＧ２细胞无细胞增殖抑制作　用，而对ＨｅｐＧ２．２．１５细胞有明显的致细胞凋亡作　用　。其主要原因在于ＩＦＮｏＬ－２ｂ对ＨｅｐＧ２．２．１５细　胞增殖的抑制作用与ＨＢＶ的表达呈正相关　加　，因　此ＩＦＮｏｔ－２ｂ很难单独作为抗病毒药物在临床上应　用。　综上所述，在拉米夫定和ＩＦＮ　＿２ｂ序贯治疗中，　拉米夫定可抑制ＨｅｐＧ２．２．１５细胞ＨＢＶ复制，降低　ＩＦＮ仅＿２ｂ的细胞增殖抑制作用。　参考文献：　［１］Ｊａｎｓｓｅｎ　ＨＬ，ｖａｎ　Ｚｏｎｎｅｖｅｌｄ　Ｍ，Ｓｅｎｔｕｒｋ　Ｈ，ｅｔ　ａ１．Ｐｅｇｙｌａｔｅｄ　ｉｎｔｅｒ－　ｆｏｒｏｎ　ａｌ　－２ｂ　ａｌｏｎｅ　ｏｒ　ｉｎ　ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ　ｗｉｔｈ　ｌａｍｉｖｕｄｉｎｅ　ｆｏｒ　ＨｂｅＡｇ—　ｐｏｓｉｔｉｖｅ　ｃｈｒｏｎｉｃ　ｈｅｐａｔｉｔｉｓ　Ｂ：８　ｒａｎｄｏｍｉｓｅｄ　ｔｒｉａｌ［Ｊ］．Ｌａｎｃｅｔ，２００５，　３６５（９４５４）：１２３－１２９．　［２］Ｂｕｓｔｅｒ　ＥＨ，Ｔｅｒ　Ｂｏｒｇ　ＭＪ，Ｊａｎｓｓｅｎ　ＨＬ．Ｐｅｇｙｌａｔｅｄ　ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ　ａｌｐｈａ　ｆｏｒ　ｃｈｒｏｎｉｃ　ｈｅｐａｔｉｔｉｓ　Ｂ—ａｌｏｎｅ　ｏｒ　ｉｎ　ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ　ｗｉｔｈ　ｌａｍｉｖｕｄｉｎｅ　［Ｊ］．Ｈｏｔ　Ｔｏｐｉｃｓ　ｉｎ　Ｖｉｒａｌ　Ｈｅｐａｔｉｔｉｓ，２００７，４（３９）：２１－２８．　［３］田群，左维泽，曹玉文，等．拉米夫定与ＩＦＮａ一１ｂ序贯治疗　ＨＢｅＡｇ阳性慢性乙肝患者临床疗效观察［Ｊ］．现代生物医学进　展，２０１１，１９（１１）：３６９４－３６９５．　［４］徐艳玲，刘令九，侯丽娟，等．干扰素ｄ－２ｂ与白细胞介素－２联合　作用对体外ＨｅｐＧ２．２．１５细胞增殖及乙肝病毒复制的影响　［Ｊ］．中国生物制品杂志，２０１３，２６（７）：９７０．　［５］Ｗｅｒｌｅ—Ｌａｐｏｓｔｏｒｌｌｅ　Ｂ，Ｂｏｗｄｅｎ　Ｓ，Ｌｏｃａｒｎｉｎｉ，ｅｔ　ａ１．Ｐｅｒｓｉｓｔｅｎｃｅ　ｏｆｃ—　ｃｃＤＮＡ　ｄｕｒｉｎｇ　ｔｈｅ　ｎａｔｕｒａｌ　ｈｉｓｔｏｒｙ　ｏｆ　ｃｈｒｏｎｉｃ　ｈｅｐａｔｉｔｉｓ　Ｂ　ａｎｄ　ｄｅｃｌｉｎｅ　ｄｕｒｉｎｇ　ａｄｅ　ｆｏｖｉｏｒ　ｄｉｐｉｖｘｉｌ　ｔｈｅｒａｐｙ［Ｊ］．Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ，２００４，１２６　（７）：１７５０．　［６］Ｇｕｉｄｏｔｔｉ　ＬＧ，Ｃｈｉｓａｒｉ　ＦＶ．Ｃｙｔｏｋｉｎｅ—ｍｅｄｉａｔｅｄ　ｃｏｎｔｒｏｌ　ｏｆ　ｖｉｒａｌ　ｉｎｆｅｃ　ｔｉｏｎｓ［Ｊ］．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，２０００，２７３（２）：２２１－２２７．　［７］Ｚｈｏｕ　Ｔ，Ｇｕｏ　ＪＴ，Ｎｕｎｅｓ　ＦＡ，ｅｔ　ａ１．Ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ　ｔｈｅｒａｐｙ　ｗｉｔｈ　ｌａｍｉ－　ｖｕｄｉｎｅ　ａｎｄ　ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ　ｃａｕｓｅｓ　ｔｒａｎｓｉｅｎｔ　ｓｕｐｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｏｆ　ｃｈｒｏｎｉｃ　ｗｏｏｄｃｈｕｃｋ　ｈｅｐａｔｉｔｉｓ　Ｂ　ｖｉｒｕｓ　ｉｎｆｅｃｔｉｏｎｓ［Ｊ］．Ｊ　Ｖｉｒｏｌ，２０００，７４　（２４）：１１７５４—１１７６３．　［８］Ｓｈｉ　Ｈ，Ｇｕａｎ　ＳＨ．Ｉｎｃｒｅａｓｅｄ　ａｐｏｐｔｏｓｉｓ　ｉｎ　ＨｅｇｐＧ２．２．１５　Ｃｅｌｌｓ　ｗｉｔｈ　ｈｅｐａｔｉｔｉｓ　Ｂ　ｖｉｒｕｓ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｂｙ　ｓｙｎｅｒｇｉｓｔｉｃ　ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ　ｏｆ　ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ—　ｇａｍａ　ａｎｄ　ｔｕｍｏｒ　ｎｅｃｒｏｓｉｓ　ｆａｃｔｏｒ—ａｌｐｈａ［Ｊ］．Ｌｉｖｅｒ　Ｉｎｔ，２００９，２９　（３）：３４９—３５５．　［９］Ｓｕ　Ｆ，Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒ　ＲＩ，Ｈｅｐａｔｉｔｉｓ　Ｂ．ｖｉｒｕｓ　ＨＢｘ　ｐｒｏｔｅｉｎ　ｓｅｎｓｉｔｉｚｉｅｓ　ｃｅｌｌｓ　ｔｏ　ａｐｐｏｐｏｔｏｔｉｃ　ｋｉｌｌｉｎｇ　ｂｙ　ｔｕｍｏｒ　ｎｅｃｒｏｓｉｓ　ｆａｃｔｏｒ　ａｌｐｈａ［Ｊ］．Ｐｒｏｃ　Ｎａｔｌ　Ａｃａｄ　Ｓｃｉ　ＵＳＡ，１９９７，９４（１６）：８７４４—８７４９．　［１Ｏ］Ｒｅｉｆｅｎｂｅｒｇ　Ｋ，Ｈｉｌｄｔ　Ｅ，Ｌｅｃｈｅｒ　Ｂ，ｅｔ　ａ１．ＩＦＮ　ｇａｍａ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｉｎ－　ｈｉｂｉｔｓ　ＬＨＢｓ　ｓｔｏｒａｇｅ　ｄｉｓｅａｓｅ　ａｎｄ　ｇｒｏｕｎｄ　ｇｌａｓｓ　ｈｅｐａｔｏｅｙｔｅ　ａｐｐｅａｒ－　ａｎｃｅ，ｂｕｔ　ｅｘａｃｅｒｂａｔｅｓ　ｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ　ａｎｄ　ａｐｏｐｔｏｓｉｓ　ｉｎ　ＨＢＶ　ｓｕｒｆａｃｅ　ｐｒｏｔｅｉｎ—ａｃｃｕｍｕＬａｔｉｎｇ　ｔｒａｎｓｇｅｎｔｉｃ　ｌｉｖｅｒｓ［Ｊ］．Ｌｉｖｅｒ　Ｉｎｔ，２００６，２６　（８）：９８６－９６３．　（收稿日期：２０１４—１０—３１）