shRNA原理及设计
第六章：常用分子生物学技术——RNA干扰技术
识别并切割(qiēgē)与siRNA反义链互补的靶mRNA
（5）dsRNA的再生成
第十ānrǎo)
第十七页，共四十页。
RNA干扰(gānrǎo)
（RNA interference, RNAi）
siRNA（小干扰RNA）：21-23nt，由dsRNA裂 解而成的小片段，可诱导mRNA降解。siRNA主要
药学 分子生物 (yào xué)
学
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生物芯片 （biochip） (shēnɡ wù xīn piàn)
以生物、电子、机械和信息技术为基础，在 固相支持物表面建立集成、连续、微型分析系 统(xìtǒng)，形成芯片，实现对生物大分子的准确、 快速、高通量、自动化检测。
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REGγ基因敲除鼠（下图）出现脊椎(jǐ zhuī)弯曲等早衰现象
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Gab1基因(jīyīn)敲除导致小鼠缺血性血管新生、侧枝循环建立出现 缺陷（图示上半部分），主要是由于血管内皮细胞管状结构形成的 信号调控通路出现障碍而引起的（图示下半部分）。
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2、 RNA干扰技术缺点
“脱靶效应”（off-target effects）
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RNA干扰技术(jìshù)的应用
1、基因功能研究（功能失活策略） “基因敲减（knockdown）”
2、基因治疗（基因(jīyīn)失活性治疗） （1）病毒感染性疾病
通过RNAi抑制 RNA病毒(bìngdú)复制 （2）基因过表达引起的疾病（如肿瘤）
特定功能基因的部分片段被同源的外源DNA片 段替代，从而使靶基因失活。
siRNA质粒载体构建技术
siRNA质粒载体构建技术点击次数：408 发布时间：2011/4/26siRNA质粒载体构建技术RNAi （RNAinterference, RNA干扰）技术，即将与内源 mRNA 编码区同源的小片段（19 －23bp）外源双链 RNA（double s`tranded RNA ）导入细胞中，通过一系列细胞内反应引发细胞中相应 mRNA 的降解，从而导致特定基因表达沉默的一种技术。
RNAi的作用提供了一种经济、快捷、高效的抑制特异基因表达的技术手段，有助于研究该基因在生物模型系统中的作用，是研究基因功能的重要工具，并且逐步成为病毒性疾病、遗传性疾病以及肿瘤等的基因治疗研究的一种手段。
基本原理示意图siRNA构建技术服务本公司提供siRNA 载体的构建服务，siRNA 载体可以在细胞内直接转录出 shRNA ，其干扰效果等同于siRNA ，而且能够解决 siRNA干扰时间短的缺点。
您只需提供需干扰基因的详细信息，包括基因的 mRNA 序列，Genbank Accession No. 和所属物种，本公司负责设计3条针对目的mRNA的siRNA 靶序列，在短时间内构建三个可用于目的mRNA干扰实验的siRNA 载体。
可以为您节省大量的时间与精力。
此方法是多种siRNA制备方法中唯一可以进行长期基因沉默研究的方法。
闪晶生物siRNA载体构建服务程序：1. siRNA表达载体的选用：本公司选用的siRNA 表达载体含新霉素抗性基因和GFP绿色萤光标记，可以建立稳定表达系，同时可以实时监测载体在细胞中的转染效率。
载体中还含有Amp抗性基因，可以无限扩增。
2. 设计siRNA靶序列A 、根据目的mRNA序列，设计3条RNA干扰靶序列，靶序列一般为19 － 21nt 长。
B 、对于每条选定的siRNA 靶序列，设计 siRNA 正义链和反义链，以 loop（9nt）相连，称为 shRNA（short hairpin RNA）。
sirna设计原理
sirna设计原理小伙伴们！今天咱们来唠唠siRNA设计原理这个超有趣的事儿。
咱先得知道啥是siRNA。
简单说呢，siRNA就像是细胞里的小特工，专门去对付那些捣乱的基因。
它是一种双链RNA分子，长度不长不短，大概20 - 25个核苷酸左右。
这个长度可很有讲究哦。
你想啊，如果太短了，就像小短腿去追坏人，根本够不着目标；要是太长了呢，又容易拖泥带水，在细胞里施展不开手脚。
那怎么设计出有效的siRNA呢？这就像给小特工定制一套完美的装备。
首先得从基因序列下手。
我们要找的是基因的那些关键部位，就好比是坏人的弱点。
一般来说，要找那些相对特异的区域。
如果选的区域在很多基因上都有类似的，那就糟糕啦，小特工可能就认错目标，开始乱打一气了。
这就好比你要抓小偷，结果抓错成了路人甲，多尴尬呀。
而且哦，在基因序列里，有些地方是比较容易被小特工结合的，就像有些地方是小偷爱出没的角落。
这些地方的核苷酸组成有一定的特点。
比如说，GC含量就很重要。
GC含量不能太高也不能太低。
要是GC含量太高了，就像给小特工设置了一个超级复杂的密码锁，它很难解开然后去和目标结合；要是GC含量太低呢，又像是锁太简单，容易被其他不相干的东西干扰。
通常啊，GC含量在30% - 70%之间是比较理想的范围。
这就像是 Goldilocks原则，不多不少刚刚好。
再说说这个双链结构。
siRNA的双链可不是随随便便就形成的。
两条链之间的互补性要足够好。
这就像两个人跳舞，得配合得默契才行。
如果两条链之间互补性不好，就像跳舞的时候老是踩对方的脚，这个siRNA就不稳定，在细胞里还没发挥作用可能就散架了。
而且两条链的末端结构也有说法。
一般来说，末端要是平端或者有一点突出，就像小特工的武器有不同的造型，不同的末端结构会影响它和细胞里其他分子的相互作用。
另外呢，在设计siRNA的时候，还得考虑细胞环境这个大舞台。
细胞里可是一个超级复杂的世界，有各种各样的分子在跑来跑去。
RNA干扰技术基本原理和应用
RNAi旳主要过程
效应阶段 RNA诱导沉默复合体（RNA-induced silencing complex，RISC） 旳形成 RISC旳激活：ATP依赖旳解双链过程 在siRNA反义链旳指导下(靶序列旳辨认）， RISC特异性切 割、降解靶mRNA，造成基 因体现失活
NS3-1948 siRNA +
HCV体现质粒
共转染
Huh-7 细胞
HCV RNA ↓ 23倍
GAPDH siRNA
+
HCV RNA 无变化
谢 谢!
2023 年 Berstein 等 提出只有22 核苷酸dsRNA才有特异性旳
阻断效应，并发觉体内分解dsRNA 为 siRNAs (short/small interfering RNA) 旳 DICER 酶
RNAi旳发觉和发展历程
2002 年 Novina 等 用RNAi 技术实现了对HIV-1 病毒旳阻抑
Dicer酶
RNAase III超家族组员。构造中涉及一种 螺旋酶构造域，两个RNA酶Ⅲ构造域，一 种双链RNA结合位点 对单链RNA没有活性 对200~500nt旳dsRNA作用效果最佳，能 降解成25nt左右旳siRNA 广泛存在
RdRp（RNA dependent RNA polymerase）
siRNA旳制备措施
细胞内制备措施 依赖体现质粒或病毒载体在细胞内获取 siRNA 经过PCR介导旳siRNA体现试剂盒获取 siRNA
siRNA载体
依赖RNA聚合酶III 开启子(pol III) ，操纵一 段小旳发夹siRNA在哺乳动物细胞中旳体 现。
miRNA194-5p的克隆及其功能分析实验报告
microRNA-X的克隆及其功能分析摘要：微小核糖核酸（Has-miR-194-5p）是一类长20-22个核苷酸的小分子非编码RNA，它通过与靶基因3'端非编码序列结合促进靶基因降解或抑制翻译过程，从而抑制靶基因表达。
本实验通过具体操作对特定基因克隆并研究其功能，从而理解并掌握基因工程的基本思路和分子生物学、细胞生物学的核心技术。
关键词：质粒DNA，MTT，RNA抽提纯化，逆转录PCR引言：miRNA参与生物体的生长、发育和凋亡的调控，并在疾病发生和发展过程中起着重要作用。
基于miRNA所产生的多种多样的生物学功能，近年来对miRNA 的研究成为科学研究的热点之一。
克隆获得特定的miRNA是研究其功能的前提。
重组质粒经测序验证后经过质粒抽提，进行转染真核细胞，质粒pSuper带有EGFP 标记，可以在荧光显微镜下观察转染效率，通过MTT实验检测miRNA过表达对细胞活力的影响；通过RT-PCR检测miRNA对其特定靶基因的表达调控；在蛋白水平通过Western blot进行验证。
一、实验内容1.对特定microRNA-X的生物信息分析；2.人工合成shRNA与pSuper载体的体外连接与转化；3.质粒DNA的抽提与鉴定；重组质粒DNA序列测定；4.转染真核细胞；MTT法检测对细胞活力的影响；5. RNA的抽提纯化及逆转录PCR扩增目的基因；6.Western blot 对特定蛋白表达的检测。
二、实验目的（一）实验部分：1.掌握基本的分子生物学实验技术DNA重组、质粒抽提、RNA抽提、RT-PCR、Western blot2.掌握基本的细胞生物学实验技术细胞培养、MTT、转染（二）理论部分：生物信息预测分析1.掌握基因克隆的策略（目的DNA获得、体外连接方式、重组克隆的筛选与鉴定）2.掌握基因分析的基本策略（细胞活力、mRNA水平、蛋白水平等进行分析）3.掌握基本的生物大分子相关的数据库的使用及相关生物信息分析软件的使用（NCBI数据库、Targetscan、Pictar、mirbase等）实验一对特定miRNA-X的生物信息分析目的：掌握对特定microRNA的生物信息学分析1 mirbase使用2 特定miRNA序列的获得（成熟和前体序列）3 特定miRNA target预测分析实验二人工合成shRNA分子与pSuper载体体外连接与转化目的：1 利用shRNA设计的基本原理，掌握microRNA的设计；2 掌握DNA酶切与连接的基本技术；3 掌握质粒转化的基本技术。
小干扰RNA综述
小干扰RNA的设计方法及研究进展10药学01班20109830129 沈洪秀【前言】RNA干扰(R N Ai)在抵抗病毒感染抑制转座子活动调控内源性基因表达等方面发挥重要作用，其高特异性高效性等显著优势将成为研究基因功能的全新手段。
本文简要概括R N Ai 作用机制和siRNA技术的原理, 同时也讨论了RNAi技术在各领域的应用。
【摘要】小干扰RNA(siRNA)是生物界普遍存在的一种抵御外来基因和病毒感染的转录后基因调控方式,也是一种重要的研究工具大量的研究工作致力于设计合理的RNA片段用于基因功能研究,并将其作为一种治疗方法用于肿瘤病毒性疾病等基因治疗以及药物靶向研究.然而随机设计的RNA对靶点的沉默效应差别很大。
因此设计siRNA直接针对靶向基因的高效成为关键的问题。
生物信息学热力学计算，计算机辅助设计等方法和手段成为设计siRNA的新热点。
本文对设计siRNA原则及方法研究进行总结论述。
【关键词】RNA干扰；siRNA；在线设计；基因沉默；基因治疗；药物筛选；基因表达调控近年来研究表明[1], 引入双链RNA( double-strandedRNA, dsRNA)可以促使特定因的mRNA降解, 从而高效、特异地阻断体内特定基因表达, 诱使细胞表现出特定基因缺失的表型, 此现象称为RNA干扰( RNA interference, RNAi)。
短链RNA干扰( short interferingRNAs, siRNAs)是引入dsRNA被Dicer酶(一种dsRNA特异的核酸内切酶, RNaseÓ家族中特异识别dsRNA的一员)切割形成的21~ 23核苷酸( nt)的短片段, 能够以序列同源相应的mRNA靶目标, 高度特异性降解靶目[2]。
以siRNAs为基础的基因沉默技术近年来发展迅速, 并成功地阻抑了疾病相关基因如病毒基因、原癌基因等; 成功构建的转基因动物模型,为高通量研究功能基因组学、药物筛选、基因治疗等提供了新途径。
shRNA-resistant Gankyrin质粒的构建及鉴定
shRNA-resistant Gankyrin质粒的构建及鉴定赵青;柏兆方;徐广;刘朝山;巩伟丽;周涛【摘要】Gankyrin, an oncoprotein, has been reported to be associated with tumorigenesis. Previous study in laboratory showed that Gankyrin was highly expressed in human breast cancer tissues than in adjacent normal tissues and affected the breast cancer metastasis in many stages. A shRNA-resistant Gankyrin plasmid is constructed by PCR induced site-directed mutagenesis. Identification by restriction endonuclease digestion and sequencing analysis indicated that the resistant plasmid was constructed successfully. Moreover, the expression of shRNA-resistant Gankyrin Plasmid was detected in HEK293T cells by Western blot. An important tool is provided for the further research of Gankyrin functions and its molecular mechanism in breast cancer.%gankyrin是近年来发现的一种癌基因,研究表明其表达产物Gankyrin与肿瘤发生密切相关.实验室前期工作发现Gankyrin表达水平与临床乳腺癌转移存在正相关,并可能通过多个环节影响乳腺癌的转移.本研究利用PCR介导的定点突变技术,构建了shRNA-resistant Gankyrin抵抗型质粒.经酶切鉴定及DNA测序证实序列完全正确,抵抗型质粒构建成功；经Western Blot检测,抵抗型质粒在HEK293T细胞中正确表达,为进一步研究Gankyrin在乳腺癌转移中的作用及其分子机制提供了重要的实验材料.【期刊名称】《科学技术与工程》【年(卷),期】2013(013)012【总页数】4页(P3238-3241)【关键词】Gankyrin;定点突变;抵抗型质粒;RNA干扰回复【作者】赵青;柏兆方;徐广;刘朝山;巩伟丽;周涛【作者单位】国家生物医学分析中心,北京100850【正文语种】中文【中图分类】Q343.17每年大约有90%的肿瘤患者死于肿瘤转移［1，2］。
rnai的原理与应用
RNAi的原理与应用1. RNAi的定义RNA干扰（RNA interference，RNAi）是一种在生物体内通过特定的RNA序列对靶基因进行抑制的现象。
它是由双链RNA（dsRNA）介导的基因沉默机制，可在转录后水解转录物或转录前阻断特定的mRNA来抑制基因表达。
2. RNAi的基本原理RNAi的基本原理是通过引入外源性的小RNA分子（小干扰RNA，siRNA）或合成人工的小RNA分子（小干扰RNA，shRNA），将其与目标mRNA相互配对，从而刺激酶的活性，引发mRNA的降解，在转录或翻译水平抑制目标基因的表达。
3. RNAi的步骤RNAi的过程主要包括以下几个步骤：•小RNA分子的合成：通过化学合成或由内源性基因产生的方式，合成得到小RNA分子。
•外源性小RNA的进入细胞：将合成得到的外源性小RNA引入目标细胞内。
•小RNA与RISC复合体结合：外源性小RNA与细胞内的RNA诱导靶向复合物（RISC）结合。
•小RNA的导引：外源性小RNA通过RISC复合体将其导引到目标mRNA上。
•目标mRNA的降解或抑制：外源性小RNA与目标mRNA配对后，通过RISC复合体的活性，引发目标mRNA的降解或抑制。
4. RNAi的应用领域RNAi技术已经广泛应用于许多生物学研究领域和医学领域：4.1 基因功能研究RNAi技术可以通过针对特定基因靶点的干扰，研究基因的功能和调控机制。
研究人员可以设计特定的siRNA或shRNA靶向目标基因，并观察目标基因沉默后细胞或生物体的表型变化。
通过这种方式，可以深入了解基因在生物体中的作用和相互关系。
4.2 病毒抑制RNAi技术可以用于抑制病毒的复制和传播。
例如，在研究HIV感染机制时，可以设计特定的siRNA或shRNA靶向HIV基因，抑制其复制和扩散。
这为研究病毒感染的治疗方法提供了新的思路。
4.3 肿瘤治疗RNAi技术可以用于抑制肿瘤细胞的生长和扩散。
通过设计特定的siRNA或shRNA靶向与肿瘤相关的基因，可以抑制肿瘤细胞的增殖和侵袭能力，从而达到治疗肿瘤的目的。
sgrna序列设计原理
sgrna序列设计原理sgRNA (single guide RNA) 是一种用于CRISPR-Cas9系统中的RNA分子，它能够指导Cas9酶在基因组中特定位置上剪切DNA。
sgRNA序列设计原理是CRISPR-Cas9系统中至关重要的一环，它直接决定了Cas9的特异性和效率。
本文将详细介绍sgRNA序列设计原理，并探讨其在基因编辑领域的应用。
在进行sgRNA序列设计时，需要考虑以下几个关键因素：目标序列选择、PAM序列、长度、GC含量、互补性和剪切效率。
目标序列的选择是sgRNA设计的第一步。
目标序列是指想要编辑的基因组中的特定位置。
在选择目标序列时，需要考虑到其在基因组中的重要性和独特性。
此外，还需要避免选择在非目标基因上的相似序列，以确保编辑的特异性。
PAM序列是sgRNA设计中的重要因素之一。
PAM序列是与Cas9酶结合的关键部分，它决定了Cas9是否能够结合并剪切DNA。
在大多数CRISPR-Cas9系统中，PAM序列为NGG（N表示任意核苷酸）。
因此，在sgRNA序列设计中，需要选择能够与目标序列相配合的PAM序列。
sgRNA的长度也是设计中需要考虑的因素之一。
一般来说，sgRNA的长度应该在18-20个核苷酸左右。
过短的sgRNA可能导致特异性降低，而过长的sgRNA可能会增加非特异性的剪切。
GC含量也是sgRNA设计中需要注意的因素之一。
一般来说，sgRNA的GC含量应该在40-60%之间，过高或过低的GC含量都可能影响Cas9的结合和剪切效率。
在sgRNA序列设计中，互补性也是一个重要的考虑因素。
sgRNA 的互补性是指其序列与目标DNA序列的互补性。
为了确保Cas9能够与目标DNA结合并剪切，sgRNA的序列应该与目标DNA序列互补，并能够形成稳定的RNA-DNA双链结构。
剪切效率是sgRNA设计中需要评估的重要指标之一。
剪切效率可以通过实验验证，也可以使用一些计算工具进行预测。
sgrna设计原理
sgrna设计原理sgrna（single guide RNA）是一种用于CRISPR-Cas9系统的关键分子，它能够指导Cas9蛋白在基因组中特定位置进行剪切。
sgrna 设计的准确性和有效性直接影响到基因编辑的成功率。
本文将介绍sgrna设计的原理和相关技术，以及在基因编辑领域的应用。
1. sgrna设计原理sgrna是由两个部分组成的：CRISPR RNA（crRNA）和转录后修饰的RNA（tracrRNA）。
crRNA负责与目标DNA序列互补配对，而tracrRNA则与Cas9蛋白相互作用，形成复合物。
在实际应用中，crRNA和tracrRNA可以通过合成成一个单一的分子，即sgrna。
sgrna设计的关键在于选择合适的目标序列。
目标序列通常是要编辑的基因的靶点，通常位于编码区域或调控区域。
为了选择合适的目标序列，需要考虑以下几个因素：- 互补性：sgrna需要与目标DNA序列互补配对，因此目标序列应具有与sgrna互补的碱基序列。
- 特异性：目标序列应尽可能与其他基因组中的序列不同，以避免非特异性剪切。
- PAM序列：Cas9蛋白需要在目标序列上游存在特定的PAM （Protospacer Adjacent Motif）序列，以识别并结合到目标序列上。
- 结构稳定性：目标序列及其周围应具有合适的DNA二级结构，以便sgrna和Cas9蛋白能够有效结合。
2. sgrna设计技术sgrna的设计可以通过多种方法实现，以下是常用的几种技术：- 人工设计：根据以上原理，可以手动选择合适的目标序列，并设计相应的sgrna。
这种方法需要对基因组结构和序列进行详细分析和预测，需要一定的专业知识和经验。
- 计算机辅助设计：利用计算机算法和数据库，可以自动化地设计sgrna。
这种方法能够快速筛选出大量可能的目标序列，并进行评估和优化。
- 实验筛选：通过实验方法，如荧光素酶报告基因系统，可以快速筛选出具有高效编辑能力的sgrna。
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shRNA原理及设计
RNAi概述：
RNA干扰（RNA interference, RNAi）是指在进化过程中高度保守的、由双
链RNA（double-stranded RNA，dsRNA）诱发的、同源mRNA高效特异性降解的现象。简
单的说是指一种分子生物学上由双链RNA诱发的基因沉默现象。当细胞中导入与内源性
mRNA编码区同源的双链RNA时，该mRNA发生降解而导致基因表达沉默，是一种特异
性的转录后基因沉默(post-transcriptional gene silencing and transgene silencing)。由于RNAi
具有高度的序列专一性和有效的干扰，可以特异地将特定的基因沉默，从而获得基因功能丧
失或基因表达量的降低，因此可以作为功能基因组学的一种强有力的研究工具。RNAi技术
可广泛应用到包括功能学，药物靶点筛选，细胞信号传导通路分析，疾病治疗等等。
RNAi基本原理示意图：
RNAi类别：
1、siRNA合成：原理：在RNAi效应阶段，siRNA双链结合一个核酶复合物从而形成所
谓RNA诱导沉默复合物（RNA-induced silencing complex, RISC）。激活的RISC通过碱基配
对定位到同源mRNA转录本上，并在距离siRNA3’端12个碱基的位置切割mRNA。
化学合成的siRNA具有操作简便、转染效率高、对细胞的或者组织的毒副作用小、可大规
模制备等优点，特别适用于基因靶位点不确定情况下，进行siRNA有效片段的筛选。
2、microRNA干扰载体构建：原理：载体采用Pol II启动子表达人工设计的微小RNA
(miRNA), 后者从长的转录本被加工，进而导致特异性的mRNA的降解。
3、shRNA干扰载体构建：短发卡RNA (shRNA) 是可以克隆到表达载体并表达短的干扰
RNA (siRNA, 19-21个核苷酸的RNA 双链)的DNA分子。我们可根据靶标设计短发卡RNA
(shRNA)序列并将其克隆到特定载体上。
4、慢病毒RNAi：原理：慢病毒是逆转录病毒的一种，具有逆转录病毒的基本结构，但
也有不同于逆转录病毒的组份和特性，作为基因治疗载体发展起来，最近已用于转基因动物
制备。利用慢病毒构建的shRNA/miRNA载体，与化学合成的siRNA和基于瞬时表达载体
构建的shRNA相比，一方面可以扩增替代瞬时表达载体使用，另一方面，lentivirus－
shRNA/miRNA克隆经过慢病毒包装系统包装后，可用于感染依靠传统转染试剂难于转染的
细胞系如原代细胞、悬浮细胞和处于非分裂状态的细胞，并且在感染后可以整合到受感染细
胞的基因组，进行长时间的稳定表达。
5、腺病毒RNAi：原理：腺病毒（adenovirus，AV）是一种没有包膜的线状双链DNA，
它能感染分裂细胞和非分裂细胞，在核内以神经元细胞的形式复制，存在多种AV血清型。
到目前为止，构建的绝大多数载体都是基于血清型2和5，通过转基因的方法取代E1或E3
基因，降低病毒的复制能力。这些重组病毒仅在表达高水平E1和E3基因的细胞中复制，
因此适合应用于治疗的高效控制系统。腺病毒载体能够高效传递和表达基因的能力（尤其是
在体外），由于具有宿主范围广，对人致病性低；在增殖和非增殖细胞中感染和表达基因；
能有效进行增殖，滴度高；与人类基因同源；不整合到染色体中，无插入致突变性。对于难
转染的细胞，如原代或非分裂细胞，采用病毒递送miRNA/shRNA的方式是非常有效的选择。
几个概念的区分：
shRNAs (RNA-Short hairpin RNAs)：即短发夹RNA，是设计为能够形成发夹结
构的非编码小RNA分子，可通过RNA干扰来抑制基因的表达。Thomas
Rosenquist和Greg Hannon小组联合研究了在哺乳动物种系细胞中shRNAs的转
移导致基因长时间稳定沉默的机制。
microRNA（miRNA，微小RNA）是由内源性发夹（hairpin）结构转录产物衍
生而来的一种长为19 nt~25 nt的单链RNA。在每种高等动物中，存在200种以
上的miRNA，是最大的基因家族之一，约占基因组的1%。
siRNA：(short/small interfering RNAs)：即小干扰RNA，是一种短片断双链RNA
分子，能够以同源互补序列的mRNA为靶目标降解特定的mRNA，这个过程就
是RNA干扰途径（RNA interference pathway）
miRNA，siRNA，dsRNA和shRNA都是RNA干扰技术中用到的小分子RNA，
其不同之处在miRNA 是单链RNA，其余均为双链RNA；siRNA和dsRNA
相似；shRNA需通过载体导入细胞后，然后利用细胞内的酶切机制得到
siRNA而最终发挥RNA干扰作用。
miRNA与shRNA图示：
shRNA（短发夹RNA）的设计：
1.克隆到shRNA表达载体中的shRNA包括两个短反向重复序列，中间由一茎环（loop）序
列分隔的，组成发夹结构，由polⅢ启动子控制。随后在连上5-6个T作为RNA聚合酶Ⅲ
的转录终止子。
2.两个互补的寡核苷酸两端须带有限制性酶切位点。
3.Stratagene发现29个寡核苷酸较之原先推荐的23个寡核苷酸可以更有效的抑制目的基因。
4.在启动子下游的酶切位点下方紧连一个C，使插入片段和启动子有一定空间间隔以确保转
录的发生。
5.ShRNA目的序列的第一个碱基必须是G以确保RNA聚合酶转录。如果选择的目的序列不
以G开头，必须在紧连正义链的上游加一个G。
6.ShRNA插入片段中的茎环应当靠近寡核苷酸的中央。不同大小和核苷酸序列的茎环都被
成功的运用过。其中包含一个独特的限制性酶切位点的茎环利于检测带有shRNA插入片段
的克隆。在比较了众多不同长度和序列的茎环，5'TCAAGAG3'序列最为有效。
7.5-6个T必须放置在shRNA插入片段尾部以确保RNA聚合酶III终止转录。
8.在正义链和反义链序列上不能出现连续3个或以上的T。这可能导致shRNA转录的提前
终止。