分子生物学实验思考题 李明

思考题

1.在基因组DNA提取过程中应注意哪些问题？

1）EB一种诱变剂，操作时一定要注意安全操作，必须戴塑料或乳胶手套。

2)点样的时候要特别小心，注意不要把点样孔底部给刺穿，也要注意防止样品扩散到别的点样孔中去。

3）每取完一种试剂，必须换枪头，避免造成污染。

4）注意电极方向不要弄反。

5）操作是动作要轻柔，避免液体内以及液体与容器间产生的剪切力。

6）混合不同的液体时切忌震荡，甚至要静置。

7）之一各试剂的添加顺序。

2.在电场中，带负电荷的DNA向阳极迁移，该过程受哪些因素的影响

1）、 DNA的分子大小: 线状双链DNA分子在一定浓度琼脂糖凝胶中的迁移

速率与DNA分子量对数成反比，分子越大则所受阻力越大，也越难于在凝胶孔隙中蠕行，因而迁移得越慢。2）、琼脂糖浓度一个给定大小的线状DNA分子,其迁移速度在不同浓度的琼脂糖凝胶中各不相同。DNA电泳迁移率的对数与凝胶浓度成线性关系。凝胶浓度的选择取决于DNA分子的大小。分离小于0.5kb的DNA片段所需胶浓度是1.2-1.5%,分离大于10kb的DNA分子所需胶浓度为0.3-0.7%, DNA 片段大小间于两者之间则所需胶浓度为0.8-1.0%。3）、 DNA分子的构象当DNA分子处于不同构象时,它在电场中移动距离不仅和分子量有关,还和它本身构象有关。相同分子量的线状、开环和超螺旋DNA在琼脂糖凝胶中移动速度是不一样的,超螺旋DNA移动最快,而线状双链DNA移动最慢。如在电泳鉴定质粒纯度时发现凝胶上有数条DNA带难以确定是质粒DNA不同构象引起还是因为含有其他DNA引起时,可从琼脂糖凝胶上将DNA带逐个回收,用同一种限制性内切酶分别水解,然后电泳,如在凝胶上出现相同的DNA图谱,则为同一种DNA。4）、电源电压在低电

压时,线状DNA片段的迁移速率与所加电压成正比。但是随着电场强度的增加，不同分子量的DNA片段的迁移率将以不同的幅度增长,片段越大,因场强升高引起的迁移率升高幅度也越大,因此电压增加，琼脂糖凝胶的有效分离范围将缩小。要使大于2kb的DNA片段的分辨率达到最大,所加电压不得超过5v/cm。5）、嵌入染料的存在荧光染料溴化乙啶用于检测琼脂糖凝胶中的DNA,染料会嵌入到堆积的

碱基对之间并拉长线状和带缺口的环状DNA，使其刚性更强,还会使线状DNA迁移

率降低15％。6）、离子强度影响电泳缓冲液的组成及其离子强度影响DNA 的电泳迁移率。在没有离子存在时(如误用蒸馏水配制凝胶),电导率最小,DNA几乎不移动,在高离子强度的缓冲液中(如误加10×电泳缓冲液),则电导很高并明显产热,严重时会引起凝胶熔化或DNA变性。对于天然的双链DNA,常用的几种电泳缓冲液有TAE

3.如果提取的DNA产量较低，分析原因并提出解决办法

1）样本材料老化或反复动容导致DNA含量下降。

解决：应选择新鲜的材料样品，不能及时处理的样品应立即放入液氮或-70℃低温保存，以避免DNA降解。

样品破壁或裂解不完全，DNA未充分释放。

解决：动植物材料应在液氮中充分研磨匀浆，G 细菌就、酵母等破壁较困难的样品应用溶菌酶、Lyticase酶或机械协助破壁。

样品过多导致细胞裂解不充分

解决：不同来源样品根据查阅资料，加量不同。

DNA吸附不充分

解决：如在上吸附柱前未加入无水乙醇，或用低浓度乙醇代替无水乙醇，则导致DNA不能充分沉淀，与硅胶膜吸附不彻底，因此在样品裂解后加适量无水乙醇，在加上吸附柱使DNA与硅胶模充分吸附。

DNA洗脱不当

解决：洗脱缓冲液pH值过低会阻碍DNA从硅胶模上洗脱下来，应确保洗脱液pH在7.0~8.5之间。

习题：若PCR反应后琼脂糖凝胶电泳检测发现有多条扩增片段，如何获得单一、纯度高的目的基因片段，以保证后续实验的进行。简述方法及原理

DEAE-纤维素膜电泳法

透析袋电洗脱法

低熔点琼脂糖凝胶法

凝胶冻融法

滤纸法

挖孔法

DEAE-纤维素膜电泳法

原理：醋酸纤维素薄膜电泳仪醋酸纤维薄膜为支持物，他是纤维素的醋酸酯，由纤维素的羟基经乙酰化而制成。它溶于丙酮酸等有机溶液中，既可以涂布成为一系咪的微孔薄膜，厚度为0.1mm~0.15mm为宜。太厚吸水性差，分离效果不好；太薄则膜片缺少应有的机械强度则易碎。

透析袋电洗脱法

原理：将含有DNA片段的凝胶切下置于充满1xTAE的透析袋中，使凝胶块沉下，去掉大部分缓冲液，在凝胶上方加紧透析袋，不留气泡，将透析袋浸泡在1xTAE电泳槽中，电泳2至3小时，使DNA从凝胶中洗脱下来。

从低熔点琼脂糖凝胶中回收DNA

原理：琼脂糖的糖链上引入了羟乙基，在30℃左右成胶，大约在65℃熔化，在大多数双链DNA熔点温度下。

实验六感受态细胞的制备

思考题

感受态细胞的概念及作用？

概念：将外源DNA分子引入受体细胞一传递遗传信息的过程称为转化。作为重组DNA分子转化的受体细胞，在经过一些特殊方法（如CaCl2、电击法等）处理后，细胞膜的通透性发生变化，成为能接受外源DNA分子通过的细胞称为感受态细胞。

作用：将构建好的载体转入感受态细胞进行表达，不仅可以检验重组载体是否构建成功，最主要的是感受态细胞作为重组载体的宿主可以进行后续实验，如蛋白质表达纯化等工作。

若转化率较低，分析其原因？

可能是转化态细胞制得不够多，所以转化并成功导入菌体的目的基因个数比较少。也有可能是因为DNA的连接不好，就是DNA未成功连接在菌体DNA上。

连接缓冲液活性低，ATP降解或缓冲液稀释不当。

连接酶失活

PCR产物中含有抑制连接的成分，导致连接失败。

PCR产物没有3A’突出端，不能连接

载体T突出端丢失，引起载体平端连接

插入片段与载体比例不理想

污染

转染过程中，反应条件控制不当。

3.进行重组子筛选和鉴定时，若菌落PCR反应后无扩增产物，分析其原因？

1)挑出的菌落在转化的过程中出现了污染，导致在平板上长出的菌落并不是通过转化的细胞，而是污染的菌落。

2）挑出的菌落中转化的是空载体

3）挑选的菌落可能是在转化菌落旁边的卫星菌落

4）PCR体系存在问题，导致了最终PCR失败。