重组水蛭素
重组水蛭素Ⅲ分子改建及其构效关系的初步研究
重组水蛭素Ⅲ分子改建及其构效关系的初步研究
谭树华;李香玉;崔莉;陈法才;吴梧桐
【期刊名称】《中国生物工程杂志》
【年(卷),期】2003(23)8
【摘要】采用一种新的PCR定点诱变技术成功地对野生型水蛭素Ⅲ进行了定点诱变 ,这种方法快速、简便 ,有效。
通过突变 ,将野生型水蛭素Ⅲ分子的活性功能非必需区的指状结构顶端第 33～36位的氨基酸残基替换为RGDS序列 ,并进行了高效分泌表达 ,表达产物分泌到细胞外发酵液中。
改构的水蛭素突变体与野生型水蛭素Ⅲ相比 ,两者的抗凝血酶活性基本一致 ,但体外抗血小板凝集试验结果表明 ,前者除原有的抗凝活性外还具有显著的抗ADP诱导的血小板凝集活性 ,该研究为水蛭素Ⅲ分子的结构功能关系研究以及新型抗凝药物的研制打下了基础。
【总页数】5页(P69-73)
【关键词】重组水蛭素Ⅲ;分子改建;PCR定点诱变技术;活性;指状结构
【作者】谭树华;李香玉;崔莉;陈法才;吴梧桐
【作者单位】中国药科大学生物制药学院
【正文语种】中文
【中图分类】Q51
【相关文献】
1.重组水蛭素延缓部分肾切除大鼠慢性进行性肾损伤的初步研究 [J], 陈香美;徐启河;张颖
2.重组水蛭素Ⅲ口服制剂给药系统的初步研究 [J], 崔莉;欧瑜;袁瑞瑛;黄晓东;吴梧桐
3.分离纯化重组水蛭素Ⅲ工艺的优化研究及重组水蛭素Ⅲ的分子鉴定(英文) [J], 韦利军;刘军;吴斌;李雪峰;叶双宁;章良;吴梧桐
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水蛭素科普与健康
水蛭素科普与健康中文名称：水蛭素英文名称：hirudin定义：水蛭体内的一种蛋白质，含65个氨基酸残基和3对二硫键，具有高度特异的抗凝血酶活性，抑制凝血酶结合底物，故有抗凝血作用。
所属学科：生物化学与分子生物学（一级学科）；氨基酸、多肽与蛋白质（二级学科）本内容由全国科学技术名词审定委员会审定公布百科名片水蛭素(hirudin)是水蛭（Leech）及其唾液腺中已提取出多种活性成分中活性最显著并且研究得最多的一种成分，它是由65—66个氨基酸组成的小分子蛋白质(多肽)。
水蛭素对凝血酶有极强的抑制作用，是迄今为止所发现最强的凝血酶天然特异抑制剂。
1.作用动物试验与临床研究表明，水蛭素能高效抗凝血、抗血栓形成，以及阻止凝血酶催化的凝血因子活化和血小板反应等进一步血瘀现象。
此外，它还能抑制凝血酶诱导的成纤维细胞的增殖和凝血酶对内皮细胞的刺激。
与肝素相比，它不仅用量少，不会引起出血，也不依赖于内源性辅助因子；而肝素则有引起出血的危险，在弥漫性血管内凝血的发病过程中抗凝血酶III往往减少，这将限制肝素的疗效，采用水蛭会有较好的效果2.应用水蛭素是一类很有前途的抗凝化瘀药物，它可用于治疗各种血栓疾病，尤其是静脉血栓和弥漫性血管凝血的治疗；也可用于外科手术后预防动脉血栓的形成，预防溶解血栓后或血管再造后血栓的形成；改善体外血液循环和血液透析过程。
在显微外科手术中常因为吻合处血管栓塞而导致失败，采用水蛭素可促进伤口愈合。
研究还表明，水蛭素在肿瘤治疗中也能发挥作用。
它能阻止肿瘤细胞的转移，已证明有疗效的肿瘤如纤维肉瘤，骨肉瘤，血管肉瘤，黑素瘤和白血病等。
水蛭素还可配合化学治疗和放射治疗，由于促进肿瘤中的血流而增强疗效。
动物试验和临床研究表明，静脉或皮下注射水蛭素均无明显毒副作用，无论急性、亚急性的毒性试验，对血压、心率、血相、出血时间和血液化学成分均不受影响，呼吸系统也没有影响，无过敏反应，一般无特异抗体发现。
半致死剂量LD50＞50mgAg，远大于治疗所用的剂量(1mgAg)。
水蛭素
水蛭素的核心环肽结构如下：
• 1986年科学基酸 密码子 基因探针 提取基因
2、选择基因载体获得重组DNA
• 在体外将含目的基因的DNA片段和具 有自我复制功能、并带有选择标记的 载体分子进行酶切连接，获得重组 DNA分子。 • 可以作为载体的主要有质粒、噬菌体、 黏粒、病毒载体等。
水蛭素
在古代医书《神农 本草经》中早有水 蛭素的记载，为我 国传统中药。中医 认为它有破血、逐 瘀、通经的功能。 它是迄今为止所发 现最强的凝血酶天 然特异抑制剂。
水蛭素的临床应用
• 预防外科手术后的静 脉血栓形成 • 预防和治疗（阻断） 急性或慢性血管内凝 血（DIC） • 预防血栓溶解后再栓 塞 • 预防经皮血管腔内形 成术（PTCA）后的再 狭窄 • 作为透析和体外循环 中的抗凝剂
基因工程技术获Leabharlann 水蛭素• 1、获得具有遗传信息的目的基因 • 2、选择基因载体获得重组DNA • 3、将重组DNA分子导入宿主细胞 • 4、鉴定带有目的基因的克隆 • 5、目的基因的扩增及获得目的产物
1、获取目的基因
现已知水蛭素有11种类型，其中3种具 有抗凝血活性，它们分别命名为HV1、 VH2和VH3。 天然水蛭素是酸性多肽，其一级结构中 含有6个半胱氨酸，形成3对链内二硫键， 位于肽键N端；另一特点是在63位酪氨酸 处有硫酸酯化。
• 导入方法：
该菌主要采用形成圆 球体、在有氯化锂和 聚乙二醇-1000的条件 下用整体细胞以及电 穿孔等方法进行基因 转化。
• 载体选择：
毕赤酵母载体均为大 肠杆菌-毕赤酵母穿梭 质粒。故在上一步的 载体选择中应选取质 粒。
4、鉴定带有目的基因的克隆
• 从大量的细胞繁殖群体中，筛选出克隆有 重组DNA分子的寄主细胞。 • 方法： 采用各自特有的测活方法确定其生物活性； 采用酶联免疫方法确定其抗原性； 以目的基因为探针，通过DNA杂交方法可以 直接确定重组子。
重组水蛭素通过降低白细胞浸润减轻心肌缺血再灌注损伤
重组水蛭素通过降低白细胞浸润减轻心肌缺血再灌注损伤冷立娟;杨欣国;李波;冷钦;李文联;张红爱【期刊名称】《第四军医大学学报》【年(卷),期】2004(025)008【摘要】目的:探讨重组水蛭素(r-hirudin)对兔心肌缺血/再灌注损伤的保护作用及其对缺血心肌中白细胞浸润的影响.方法:24只日本大耳白兔随机分为2组,每组12只.缺血再灌注(I/R)组:心脏左冠状动脉前降支缺血45 min、再灌注120 min;重组水蛭素(r-H)组:缺血45 min、再灌注120 min,再灌注前15 min静注重组水蛭素(1 mg/kg),再灌注时继以持续静滴重组水蛭素[1 mg/(kg*h)]120 min.测定血浆肌酸磷酸激酶(CK)和乳酸脱氢酶(LDH)活性,并观察缺血心肌内白细胞聚集、心肌缺血及梗死范围的变化.结果:I/R组缺血心肌内白细胞聚集,血浆CK、LDH活性明显增高,心肌梗死面积明显增大;给予重组水蛭素,可显著降低缺血心肌内白细胞聚集,降低梗死面积,减轻心肌再灌注损伤(P<0.05).结论:重组水蛭素能够抑制再灌注期缺血心肌内白细胞浸润,拮抗心肌缺血/再灌注损伤.【总页数】3页(P712-714)【作者】冷立娟;杨欣国;李波;冷钦;李文联;张红爱【作者单位】第四军医大学唐都医院心血管内科,陕西,西安,710038;第四军医大学唐都医院心血管内科,陕西,西安,710038;第四军医大学唐都医院心血管内科,陕西,西安,710038;青岛市胶州中心医院小儿科,山东,胶州,266300;第四军医大学唐都医院小儿科,陕西,西安,710038;第四军医大学唐都医院小儿科,陕西,西安,710038【正文语种】中文【中图分类】R542.2【相关文献】1.水蛭注射液通过降低白细胞浸润减轻鼠脑缺血再灌注损伤 [J], 高林;柴立辉;文曙光2.白细胞介素1及白细胞介素8在心肌缺血再灌注损伤中的动态演变及药物干预效果 [J], 张艳芳;张俊河;杨廷桐;李磊3.川芎嗪通过JAK2/STAT3信号通路调节线粒体自噬减轻心肌缺血再灌注损伤的机制研究 [J], 陈乘波;陈天宝;许友榜4.七氟烷预处理减轻体外循环心肌缺血再灌注损伤的作用机制 [J], 蒋伟;王晓娟;梁姣;吴韬;谢东玮;曹兴华5.大鼠心肌缺血再灌注损伤及中性粒细胞浸润与一氧化氮心肌保护作用的研究 [J], 吴丹宁;贾国良;马颖艳;李伟因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
RGD水蛭素的相关材料
水蛭素(Hirudin)是水蛭(Leech)及其唾液腺中已提取出多种活性成分中活性最显著并且研究得最多的一种成分，它是由65—66个氨基酸组成的小分子蛋白质(多肽)。
水蛭含有丰富的水蛭素[1] ，水蛭素对凝血酶有极强的抑制作用，是迄今为止所发现最强的凝血酶天然特异抑制剂。
作用：动物试验与临床研究表明，水蛭素能高效抗凝血、抗血栓形成，以及阻止凝血酶催化的凝血因子活化和血小板反应等进一步血瘀现象。
此外，它还能抑制凝血酶诱导的成纤维细胞的增殖和凝血酶对内皮细胞的刺激。
与肝素相比，它不仅用量少，不会引起出血，也不依赖于内源性辅助因子；而肝素则有引起出血的危险，在弥漫性血管内凝血的发病过程中抗凝血酶III往往减少，这将限制肝素的疗效，采用水蛭会有较好的效果。
应用：水蛭素是一类很有前途的抗凝化瘀药物，它可用于治疗各种血栓疾病，犹其是静脉血栓和弥漫性血管凝血的治疗；也可用于外科手术后预防动脉血栓的形成，预防溶解血栓后或血管再造后血栓的形成；改善体外血液循环和血液透析过程。
在显微外科手术中常因为吻合处血管栓塞而导致失败，采用水蛭素可促进伤口愈合。
研究还表明，水蛭素在肿瘤治疗中也能发挥作用。
它能阻止肿瘤细胞的转移，已证明有疗效的肿瘤如纤维肉瘤，骨肉瘤，血管肉瘤，黑素瘤和白血病等。
水蛭素还可配合化学治疗和放射治疗，由于促进肿瘤中的血流而增强疗效。
动物试验和临床研究表明，静脉或皮下注射水蛭素均无明显毒副作用，无论急性、亚急性的毒性试验，对血压、心率、血相、出血时间和血液化学成分均不受影响，呼吸系统也没有影响，无过敏反应，一般无特异抗体发现。
半致死剂量LD50>50mgAg，远大于治疗所用的剂量(1mgAg)。
尤其值得指出的是，水蛭素可以口服，这给用药带来很大方便。
水蛭素比较稳定，胰蛋白酶和糜蛋白酶并不破坏其活性，而且水蛭素的某些水解片段仍有抑制凝血酶的作用，这就可以解释为何口服中药水蛭提取液仍然有疗效的原理。
其年产值达数千万元。
水蛭素的研究进展
文章编号：１６７３ ２９９５（２０２１）０２ ０１３５ ０３·综 述·水蛭素的研究进展程晓梅１，张 萌２，王继红１，吕 莉２，宁淑香１ （１．辽宁师范大学生命科学学院，辽宁大连 １１６０３３；２．大连医科大学药学院，辽宁大连 １１６０４４）摘 要：水蛭素是一种来源于水蛭唾液腺的天然肽类活性物质，具备强抗凝血和抗血栓功效，现已被广泛应用于治疗和预防各种心脑血管疾病。
研究表明，水蛭素对癌症、痛风、肾脏疾病等也具有较好的治疗效果。
因此，本文将就水蛭素的结构特性及其药理作用等方面进行综述，以期为水蛭素在临床上更多的应用提供参考。
关 键 词：水蛭素；抗血栓；抗肿瘤；临床应用中图分类号：Ｒ２８ 文献标志码：Ａ 水蛭属环节动物门，具有吸食哺乳动物血液的生物习性，分布在中国的大部分地区。
古人很早就发现水蛭可用于入药疏瘀。
在中医学上水蛭可以通过将其虫体进行干燥、炮制等步骤后入药，用于破血、梳通脉络、除瘀等方面，临床上可减轻中风、偏瘫、血瘀等病症的痛苦［１］。
随着科技的发展，科学家于２０世纪６０年代首次对水蛭唾液腺中的活性物质———水蛭素实现了区别于传统意义上的提纯［２ ３］，这一成果加速了对水蛭素的研究进程。
近年来，有许多科研团队发现水蛭素不仅在抗凝血、抑制血栓形成方面具有显著的作用，而且还可以起到较为明显的抑制肿瘤转移的效果。
因此水蛭素这种活性物质的发现不仅会开辟出多种抗凝血、抗血栓药物的研发新途径，而且还为身患脑血栓、恶性肿瘤等多种疾病的广大患者群众带来了新的希望和福音。
本文将近些年来水蛭素的结构、药理功效及其临床应用的研究情况作一概述。
１ 水蛭素的结构与功能目前科学家已从水蛭体内成功分离出两大类活性物质：一类是可以直接作用于凝血系统，比如水蛭素（ｈｉｒｕｄｉｎ）、菲牛蛭素（ｂｕｆｒｕｄｉｎ）等是较为常见的凝血酶抑制剂；另一类是包括抗栓肽（ｄｅｃｏｒｓｉｎ）等在内的其他蛋白酶类抑制剂和其他活性物质。
重组水蛭素III滴眼液新剂型研究
医学信息２０１３年４月第２６卷第４期（下半月）Ｍｅｄｉｃａｌ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ．Ａｐｒ．２０１３．Ｖｏ１．２６．Ｎｏ．４ 其他报道相似嘲。近年来，随着性观念的逐渐开放，社会活动和人际交往日益 增多，婚外、婚前性行为日益普遍。青壮年人群正处于性活跃期，由于中国性 教育的不足，青年人发生性行为的年龄逐渐年轻化，通过性途径感染艾滋病的 风险较大，应将其作为健康教育和行为干预的主要群体之一。 ３．２求询者男性略多于女性，和国内其他地区报道结果相同ｐ，４１，。应有针对性的 开展对女性的艾滋病自愿咨询检测和艾滋病知识的宣传，特别在娱乐场所、大 学等高危人群集聚地大力开展艾滋病知识宣传、减低恐惧和歧视的心理，使更 多女性性能主动进行咨询检测。 ３．３艾滋病目前已经不仅仅是医学问题，也是一个社会问题。调查结果显示， １３８３２例求询者中已婚有配偶有８６０１例（６２．１８％１，其中有８８９例检测结果呈 阳性反应，显示目前婚外性行为引起婚内传播已经成了艾滋病防治的一个重 要的研究课题。 ３．４求询者中男男同性性行为人群只占０．５１％，和北京、江苏等地区的结果有 较大差距１５，ｑ，说明在针对男男同性恋人群的宣传工作做得还不足，宣传工作 还亟待加强。 ３．５目前在没有有效的药物和疫苗防治艾滋病的情况下，加强艾滋病早期检测 工作是艾滋病综合防治的一个重要组成部分，在医院内逐步开展ＶＣＴ工作， 提高ＶＣＴ门诊的覆盖面，给予有需要的人群提供更方便，更有效的服务。同时 加大对ＶＣＴ的宣传力度，也可以针对娱乐场所和重点人群提供主动的ＶＣＴ 服务，提升ＶＣＴ工作主动性。 参考文献： ｆ１１中国疾病预防控制中心艾滋病预防控制中心．史滋痛自愚咨询检洲【Ｍ】北京：人民卫生 ☆版社．２００６ 【２】李旺华，汤恒，彭国平，等湖北省２００８—２０１０年ＶＣＴ情况分析町．中圆性痛艾滋病， ２０１１．１７（６）：６５７—６５９ ｐ】金丹丹，陈树昶，罗艳，等２００８—２０１０年浙江省杭州市史滋病自愿咨询检测 果分析Ⅱ］．疾 病监测，２０１２，２７（３）：２０５—２０７ ［４】蒋辽远，吴小刖，魏庆，等２００８年史滋痛自悬咨询检洲结果分析硼中国麻风皮肤病杂志， ２００９，２５（１ ２】：８９０． １５１赵丽英，张海艳，周艳丽．等．北京市东城区１１３５名艾滋痛自愚咨询检测情况调查Ⅱ］．首 都公共卫生，２０１２。６（２）：８７—８９ ｌ ６】周欣，马瞧勤，蔡高峰，等２０１１年浙江省疾控机构艾滋痛自愿咨询检测主动和被动求询 者筛查阳性情况对比分析Ｕ］中国预防医学杂志，２０１２，１４（２）：１３６—１３９ 编辑，申磊
局部应用重组水蛭素对脑出血大鼠的治疗作用
局部应用重组水蛭素对脑出血大鼠的治疗作用魏秀娥;荣良群【期刊名称】《山东医药》【年(卷),期】2011(51)9【摘要】目的观察局部应用重组水蛭素(RH)对脑出血(ICH)大鼠的治疗作用.方法采用自体血注入大鼠尾状核方法建立ICH模型,将大鼠随机分为正常组、模型组和RH干预组.干-湿重法观察各组48 h时的脑含水量,HE染色观察6、12、24、48、72 h及7 d时的血肿周围组织病理改变,免疫组织化学法检测各组血肿周围脑组织Bcl-2、Bax蛋白表达.结果①HE染色:对照组右侧基底节区细胞形态结构完整;模型组血肿周围神经元数目明显减少,组织水肿明显,大量炎性细胞浸润;RH干预组与模型组比较血肿周围水肿带缩小,炎症细胞浸润程度减轻.②脑水肿测定:模型组和RH干预组脑含水量均显著高于对照组(P均＜0.05),RH干预组与模型组比较含水量明显降低(P＜0.05).③免疫组织化学:对照组进针点周围偶见Bcl-2表达,未见Bax表达;模型组和RH干预组Bax、Bcl-2均以出血灶周围表达为主,出血后6 h可见Bax 阳性细胞表达,24 h达高峰,48 h后逐渐减少;出血后12 h可见Bcl-2明显表达,48h达高峰,7 d时仍有表达.RH组Bcl-2表达在12、24、48、72 h与ICH组比较显著增强(P均＜0.01),Bax表达显著降低(P均＜0.01).结论凋亡相关蛋白Bax、Bcl-2参与了ICH后脑损伤;局部应用RH可显著减轻ICH后脑水肿,并可下调促凋亡蛋白Bax的表达、上调凋亡抑制蛋白Bcl-2的表达,发挥脑保护作用.【总页数】3页(P33-35)【作者】魏秀娥;荣良群【作者单位】徐州医学院第二附属医院,江苏徐州221006;徐州医学院第二附属医院,江苏徐州221006【正文语种】中文【中图分类】R743.34【相关文献】1.局部应用重组水蛭素对脑出血模型大鼠血肿周边组织损伤的干预作用 [J], 周中和;王景周;曲方;何祥;陈曼娥;王耀山2.局部应用重组水蛭素治疗脑出血后脑水肿的实验研究 [J], 时宏娟;沈霞;荣良群;魏秀娥3.局部应用重组水蛭素对大鼠脑出血神经细胞凋亡的干预作用 [J], 周中和;曲方;何祥4.重组水蛭素对大鼠脑出血血肿周边组织炎性反应的干预作用 [J], 周中和;曲方;何祥5.重组水蛭素对大鼠脑出血血肿周边组织炎性反应的干预作用 [J], 周中和;范刚花;曲方;何祥因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
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重组水蛭素
一、重组水蛭素的理化性质
1、天然水蛭素的结构
水蛭素是一种单链环肽化合物，由65个氨基酸残基组成，分子量7KD，N端有三个硫键，，分别在6～14位，16～28位和22～39位的半胱氨酸残基，使N端肽链绕迭成密集形核心环肽结构。
N端的5个氨基酸残基为疏水基团，C端则为亲水基团，并游离在分子的表面。
肽链中部还有一个特殊序列，不被蛋白酶所降解。
素存在10种以上变异体，主要有3种变异体，简称为HVl、HV2和HV3。
2、重组水蛭素的结构
重组水蛭素除了63位Tyr残基上脱SO3－外，其他与天然水蛭素一样。
3、重组水蛭素的等电点：为3.9。
4、重组水蛭素的溶解性质
溶于水或吡啶，几乎不溶于醇、乙醚、丙酮或苯
5、重组水蛭素的稳定性
1）、水蛭素干燥状态下稳定；室温下水中可稳定存在6个月；80℃下加热15min不被破坏。
2）、pH值升高则稳定性下降，在0.1mol／L盐酸溶液或0.1m01／L氢氧化钠溶液中可稳定15min。
3）、水蛭素不被胰蛋白酶水解，对α－糜蛋白酶一定的耐受性；但番木瓜蛋白酶、胃蛋白酶和枯草杆菌蛋白酶A则可使之失去活性。
4）、描述了稳定的制剂处方重组水蛭素与二价金属离子(ca2+，zn2+或M矿+)形成性螯合物，在水中可稳定储存，用于静脉或皮下注射。
二、重组水蛭素的提取纯化工艺
1、发酵液经超滤、透析、离子交换层析，分离纯化目的蛋白
1.1 超滤与透析发酵液于5000rpm冷冻离心20min，离心上清液超滤(MWCO=30000)并收集透过液，加入蒸馏水重复超滤，合并透过液。
透过液超滤浓缩（MWCO=3000），加入蒸馏水重复透析除盐，最终浓缩至所需体积，置于4℃冰箱保存备用。
1.2离子交换层析平衡缓冲液为PH3.0和PH5.0的甘氨酸缓冲液（50mmol/L），梯度洗脱缓冲液为1/LNaCL(于50mmol/L的甘氨酸缓冲液中）。
样品SP-Sepherose FF吸附并洗脱后，收集重组水蛭素活性峰，测定蛋白浓度和比活力。