原位滚环扩增技术在肝组织HBVcccDNA表达的检测中的应用

３４８　《求医问药》下半月刊ＳｅｅｋＭｅｄｉｃａｌＡｎｄＡｓｋＴｈｅＭｅｄｉｃｉｎｅ　２０Ｉ１年第９卷　第１１期　原位滚环扩增技术在肝组织Ｈ　ＢＶｃｃｃＤＮＡ表达的检测中的应用　周冬青　钟彦伟　徐东平　王骥　王春颖　王海舰，刘成永，张启全，胡双烨！龙丽梅！　（１．桂林医学院病理与病理生理学２００９级研究生５４　ｌ　０００　２．北京３０２医院传染病研究所１０００００；３．徐州市传染病医院２２１０００）　【摘要】目的运用原位滚环扩增和原位ＰＣＲＪＹ法检测ＨＢＶｃｃｃＤＮＡ在肝组织中的表达。方法收集２０例乙肝表面抗原携带者、慢性乙型肝炎、　慢性乙型肝炎后肝硬化及肝细胞性肝癌患者的石蜡包埋肝组织切片，采用ＰＳＡＤ酶消化、原位滚环扩增方法及使用根据ＨＢＶｃｃｃＤＮＡ－￣ＨＢＶｒｃＤＮＡ结构上的差异　而设计的地高辛标记的原位跨缺口引物进行原位ＰＣＲ，然后用免疫组织化学方法进行显色，显微镜下观察ＨＢＶｃｃｃＤＮＡ在肝组织中表达分布，并对结果进行　评价分析。结果：２０例标本中有ｉ５例可见ＨＢＶｃｃｃＤＮＡ￣性信号，组织切片阳性表达率为平均４０—８５％．以核型为主，呈蓝色、紫色或紫蓝色，呈颗粒状、弧形或　圆形团块状，主要在核及核膜上表达。结论原位滚环扩增方法用于检测肝组织中ＨＢＶｃｃｃＤＮＡ￣９表达，具有敏感性高、特异性强的特点。　【关键词】ＨＢＶｃｃｃＤＮＡ（乙型肝炎病毒共价闭合环状ＤＮＡ）、ＰＳＡＤ酶（质粒安全ｆ＠ＡＴＰ依赖性的ＤＮＡ酶）、原位ＲＣＡ（原位滚环扩增）、原位ＰＣＲ（原位　聚合酶链反应）　

【中图分类号】Ｒ４４６．８　【文献标识码】Ａ　【文章编号】１６７２—２５２３（２０１　１）１　１－０３４８—０３　

目前世界范围内感染乙型肝炎病毒者已有３．５亿人，我国有９３ｏｏ万慢性　乙型肝炎病毒（ＨＢＶ）感染者，乙型肝炎病毒防控及治疗隋况仍然严　。　ＨＢＶｃｃｃＤＮＡ又称乙型肝炎病毒共价闭合环状ＤＮＡ，是ＨＢＶＤＮＡ复制的　中间体，亦是ＨＢＶ前基因ＲＮＡ复制的模板，只有彻底清除ＨＢＶｃｃｃＤＮＡ，　才能真正清除乙肝病　Ｉ，因Ｉ＿￣ｒｔＢＶｃｃｃＤＮＡｆ１９检测对研究乙型肝炎致病机　制和评价抗病毒药物的疗效及新药的研发等方面具有重要的意义。　利用原位滚环扩增和原位ＰＣＲ方法检测ＨＢＶｃｃｃＤＮＡ在肝组织中的　表达，可以在分子水平上将组织形态与基因定位、基因表达水平较好地联　系起来，还可进一步了解ＨＢＶＤＮＡ的复制能力，不但可以为临床抗病毒治　疗提供指导，而且为乙型肝炎的病理学研究提供了适宜的手段。目前国内　外检测ＨＢＶｃＣＣＤＮＡ大多采用各种液相ＰＣＲ和ＳＯＵｔｈｅｒｎ来检测　ＨＢＶｃｃｃＤＮＡ，亦有国内有学者将滚环扩增与荧光定量结合用来检测　ＨＢＶｃｃｃＤＮＡｔ４Ｉ，还有学者采用地高辛标记的引物利用直接原ＰＣＲ方法检　测肝组织中ＨＢＶｃｃｃＤＮＡ的表达ｌ＝Ｉ，但将原位滚环扩增与原位ＰＣＲ结合运　用以检测肝组织中ＨＢＶｃｃｃＤＮＡ的表达在国内外尚不多见。我们收集２０例　病例，其中包括乙肝表面抗原携带者、慢性乙型肝炎、乙型肝炎后肝硬化及　肝细胞性肝癌患者的石蜡包埋组织切片，采用质粒安全的ＡＴＰ依赖ＤＮＡ酶　（Ｐｌａｓｍｉｄ－Ｓａｆｅｒ　ＡＴＰ－Ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ　ＤＮａｓｅ，ＰＳＡＤ）消化，去除松弛的环　状ＨＢＶＤＮＡ（ＨＢＶｒｃＤＮＡ），利用原位滚环扩增只扩增共价闭合环状的　ＤＮＡ，然后采用针对ＨＢＶ￣Ｉ）ＮＡ与ＨＢｖｒｃＤＮＡ结构上的差异而设汁的地　高辛标记的特异性跨缺口引物进行直接原位Ｐ　Ｃ　Ｒ，进一步扩增　ＨＢＶ￣ｃＤＮＡ，接着用碱ｆ生磷酸酶标记的抗地高辛抗体与引物上的地高辛　（为半抗原）结合，用免疫组化方法达到显色的目的，提高了ＨＢＶｃｃＣＤＮＡ检　测的敏感性和特异性；而且能更直观地观察ＨＢＶｍｃＤＮＡ在肝组织中的分　布状况，为ＨＢＶｃｃｃＤＮＡ的检测提供了一种新的研究方法。　１材料与方法　１　１　标本的采集２Ｏ例乙肝表面抗原携带者、慢性乙型肝炎、慢性乙型肝　炎后肝硬化及肝细胞性肝癌患者的石蜡包埋肝组织切片来源于徐州市传　染病医院病理科，为２００９年４月一２０Ｉ１年４月住院病人，其中男性ｌ６例，女性　４Ｉ￣／ＩＪ，平均年龄为３７岁，均符合２０００年《病毒性肝炎防治指南　６】的诊断标准　并具备明确的病理学诊断。　表１引物序列　表示磷酸化修饰　１．２试剂及仪器自行设计原位滚环扩增引物和原位ＰＣＲ跨缺口引物并　由上海生工程有限公司合成并对跨缺口引物采用地高辛标记，ＰＳＡＤ酶、　Ｐｈｉ２９酶（滚环扩增用的ＤＮＡ聚合酶）及ＡＴＰ溶液购自北京纽英沦生物技术　公司，ｄＮＴＰｍｉｘｔｕｒｅ、ｔａｑ酶、ＰＣＲ反应缓冲液、氯化镁等购自北京天恩泽基　因科技有限公司，碱陆磷酸酶标记的抗地高辛酶标复合物、Ｔｒｉｔｏｎ　Ｘ一１００、　核快红等均为美国ｓｉｇｍａ公司产品，ＡＰＥＳ（３一氨基一丙基三乙基硅烷硅化，　３－Ａｍｉｎｏ　ｐｒｏｐｙＩｔｒｉｅｔｈｏｘｙ　ｓｉｌａｎｅ）及橡皮泥购自北京中杉金桥公司，　ＮＢＴ／ＢＣｌＰ　ｎｉｔｒｏ－ｂｌｕｅ——ｔｅｔｒａｚｏｌｉｕｍ／５——ｂｒｏｍｏ——４ｃｈｌｏｒｏ——３——ｉｎｄｏｔｙ－　ｐｈｏｓｐｈａｔｅ，四氮唑蓝／五溴四氯三吲哚磷酸盐）染色试剂盒、蛋白酶Ｋ、　ＥＤＴＡ购自博士德生物公司，Ｔｒｉｓ为北京经科化学试剂公司产品，其余产品　试剂均为国产分析纯。原位ＰＣＲ仪为美国Ｔｈｅｒｍｏ　ＰＸ２型。　１　３组织切片的处．Ｗ．｝ＬＰＳＡＤ酶消化为防止组织脱落并使ＰＣＲ反应成　分穿透组织到达肝细胞核内，并充分的与靶基因结合，常需要采取一系列　的措施对组织切片进行防脱及通透化处理；而ＰＳＡＤ酶具有消化包括　ｄｓＤＮＡ及ｒｃＤＮＡ在内的非共价闭合环状形式的所有核酸形式，因此使用　ＰＳＡＤ酶消化处理可起到相对纯化ＨＢＶｃｃｃＤＮＡ模板的作用。具体操作步骤　为：首先将石蜡包埋的肝组织切成５　ｍ厚度，贴于用ＡＰＥＳ处理过的载玻片　上，６Ｏ度烤片驯、时。组织切片按常规脱蜡至水洗；用０．２ｍｏ￣Ｌ的盐酸室温　作用ｌ０分钟，ｌｘＰＢＳ￣＃涤３次，每次３分钟；用含Ｏ．１％ｆｌ￣ＴｒｉｔｏｎＸ－ｔ００的ＰＢＳ　液室温作用Ｌ０分钟（增加细胞膜的通透性），ｌｘＰＢｓ洗涤３次，每次３分钟；５０　ｕ　ｇ／ｍｌ蛋白酶Ｋ３７＇Ｃ消化５一ｌＯ分钟（去除部分蛋白质有利于靶基因的暴　露），ｌｘＰＢＳ洗涤３次，每次３分钟；￣ｆＰＳＡＤ酶反应液滴加在组织切片上　（ＰＳＡＤ酶反应体系为ｔ０ｕ／ｕ　ｌ的ＰＳＡＤ酶０．３　ｕ　ｌ，反应Ｂｕｆｆｅｒ　ｌ“ｌ，ＡＴＰ溶　液０．６　ｌ，水１３．６　ｌ，共１５．５　１），反应条件为３０＂Ｃ消化３０分钟，７０Ｃ灭活酶　的活性３０分钟，ｌｘＰＢＳ￣涤３次，每次３分钟；玻片上滴加２　冰醋酸作用１０　分钟（目的：去除内源性碱性磷酸酶的影响），ｌｘＰＢＳ￣涤３次，每次３分钟；　４％多聚甲醛固定３Ｏ分钟，梯度乙醇脱水，室温干燥。　１　４原位滚环扩增根据我国常见ｆｌｇＨＢＶ基因型Ｂ、Ｃ基因组全序列，没　计引物４对（表１），ｂ￣ＳＡＤ酶消化处理过的组织切片作为反应模板，４Ｘ￣引　物，每条０．１２５“ｌ共ｌ　ｕＩ，反应ｂｕｆｆｅｒ　２　ｌ，水ｌｌ“ｌ共１４　ｌ滴加在Ｐ￣ＰＳＡＤ　酶消化处理过的组织切片上，进行第一步骤，使引物预结合到模板上：将切　片放人湿盒放入恒温水浴锅中９５Ｅ　５分钟，冰置ｌ５分钟。第二步骤（滚环扩　增）：４对引物，每条０．１２５　ｕｌ共ｌ　ｌ，反应ｂｕｆｆｅｒ　２　Ｉ；ＢＳＡ（１０ｍｇ／ｍ１）２　ｕ　ｌ；ｄＮＴＰ３¨１，Ｐｈｉ２９ＤＮＡ聚合酶２　ｌ（１０ｕ／ｕ１），双蒸水１ｌ　ｌ；总体，Ｒ２ｔ　ｌ；滴加在冰置后的组织切片上，３０￣Ｃ过夜／１６ｈ进行恒温扩增，６５Ｖ灭火酶　活ｈ生１０ｍｉｎ；扩增结束后立即用　多聚甲醛３７＇Ｃ固定１０ｒａｉｎ，梯度乙醇脱水。　１．５跨缺口原位ＰＣＲ扩增根据ＨＢＶ　ｃｃｃＤＮＡ与ＨＢｖｒｃＤＮＡ结构上的　差异，设计一对跨缺口的上下游引物（见表１），在引物的５’端用地高辛进行　标记，选择性的扩增ＨＢＶ　ｃｃｃＤＮＡ。先将组织周围用涂一圈橡皮泥，然后　将ＰＣＲ反应混合液３０　情加至切片上，覆以盖片，盖片的周围用橡皮泥封　边，以防切片干燥，再放Ｅ自制的基因框，最后用锡箔纸将切片包裹后放入　原位ＰＣＲ仪进行扩增；热循环条件为：９４＂Ｃ预变性５分钟；９４＂Ｃ　６０秒，５５℃　６ｏ秒，７２＂Ｃ　９０秒，３Ｏ个循环；最后７ＴＣ总延伸１Ｏ分钟。扩增结束后揭去盖片　及橡皮泥，用４％多聚甲醛３７＂Ｃ固定１０￣Ｈ￣Ｏ，ｔｘＰＢＳ￣涤３次，梯度乙醇脱水。　《求医问药》下半月刊ＳｅｅｋＭｅｄｉｃａｌＡｎｄＡｓｋＴｈｅＭｅｄｉｃｉｎｅ　２０１１年第９卷　第１１期　３４９　１　６应用免疫组织化学方法进行信号检测　由于原位ＰＣＲ扩增使用的为　地高辛标记的引物，因此需要用免疫组化的方法达到显微镜下观察阳性信　号的目的，即用碱性磷酸酶标记的抗地高辛抗体与引物Ｌ的地高辛（地高　辛为半抗原）结合，然后滴加ＮＢＴ／／３ＣＩＰ与酶作用出现呈色反应（蓝色或紫　色）。具体步骤如下：１ｘＴＢＳＴ洗涤３分钟，１ｘＴＢＳ洗涤３次，每次３ｒａｉｎ；　３％ＢｓＡ室温１０ｍｉｎ封闭非特异背景，滴加碱陛磷酸酶标记的抗地高辛抗体，　３７℃孵育２ｈ，ｌｘＴＢＳ洗涤３次，每次３ｍｉｎ；滴ＪＪＨＮＢＴ／ＢＣＩＰ，暗处室温显色　＂　ｒ—ｔ　：　＼Ｇ＼ｔ　‰　注：以上各图均为４０×除ＨＥ染色（Ａ图）外其余均为ＮＢ１、／ＢＣＩＰ显色，　核同红衬染；实线箭头所指为阳性细胞。　Ａ：慢性乙型肝炎轻度（Ｇ１Ｓ０）患者肝组织ＨＥ染色。Ｂ：为使用　２ｕＰＳＡＤ酶消化采用原位滚环扩增和跨缺Ｖ１引物原位ＰＣＲ的慢性乙型肝炎　患者肝组织切片ＨＢＶｃｃｃＤＮＡ的表达（＋＋），　日性信号多为颗粒状位于胞核　上为紫色或紫蓝色。。Ｃ：为使用４ｕＰＳＡＤ￣化后用原位滚环扩增和跨缺口　引物原｛￣ＰＣＲ的慢性乙型肝炎患者肝组织切ＨＢＶｃｃｃＤＮＡ的表达（＋＋），细　胞阳性程度（紫色）明显低于２ｕＰＳＡＤ酶消化组。Ｄ：为使用３ｕＰＳＡＤ￣化后　用半套式原位ＰＣＲ检测的慢胜乙型肝炎肝组织（Ｇ１Ｓ０－ｌ切片ＨＢＶｃｃｃＤＮＡ　的表达（＋＋＋），阳性信号多为颗粒状位于胞核上为紫色或紫蓝色。Ｅ：为　使用３Ｌｌｆ）ＳＡＤ消化后用原位滚环扩增和跨缺口引物原｛￣ｚＰＣＲ的慢ｆ生乙型肝　炎（Ｇ１ＳＯ－１）患者肝组织切ＨＢＶｃｃｃＤＮＡ的表达（＋＋），但细胞信号阳性程度　（紫色）明显低于用ＰＳＡＤ消化后用半套式检测的肝组织切片。Ｆ：为ＰＳＡＤ　消化后用滚环扩增和跨缺口引物原位ＰＣＲ的ＨＴ－￣Ｍ胞性肝癌患者肝组织切　片ＨＢＶｃｃｃＤＮＡ的表达（＋＋＋），阳性信号位于胞核呈颗粒状或团块状，甚至　整个胞核浓然呈蓝色或蓝黑色。（此样本组织结构不太清晰可能由于切片　较厚，加之肿瘤细胞非特异性增生，细胞密集而导致消化不充分以及分辨　率降低）．Ｇ：为本实验方法的阴性对照，用ＰＳＡＤ￣ｊ化后，原位滚环扩增未加　引物和标记的地高辛引物，其余条件相同的肝癌患者阴性对照切片，未见　ＨＢＶ０ｃｃＤＮＡ的表达。　０．５　２ｈ，蒸馏水洗涤终止显色；０．１％核固红衬染胞核３—５分钟；室温或３７￣Ｃ　干燥后水溶性封片剂或中性树胶封片，显微镜下观察分析并记录结果。　１　７　ＨＢＶｃｃｃＤＮＡ表达结果的判定由于ＨＢＶｃｃｃＤＮＡ主要在肝细胞核上　表达，需用核固红对细胞核进行衬染，但核固红衬染对细胞核的光密度测　量造成了严重干扰，会导致光密度测量值出现极大的误差，不适合用病理　图像半定量分析，因此我们仍然由高年资的病理科主任医师采用与相关文　献类似的方法［７，８１即主观的定量方法就是在显微镜下用肉眼判断阳性细胞　与阴性细胞，计算肝细胞中总阳性表达率的平均值。　阳性胞核为蓝色、紫色及紫蓝色，阴性胞核为淡红色或不着色　１．７．１细胞内阳性颗粒半定量分析：（一）未见阳性结果；（十）细胞核上　存在散在、稀疏的阳性颗粒；（＋＋）胞核上阳性颗粒易见；　＋＋）介于（＋＋）　与（＋＋＋＋）之间；（＋＋＋＋）阳性结果布满整个胞核。　１．７．２　组织切片阳性分析：根据切片中阳性信号表达数量／该片中　估算的细胞总量，计数高倍镜下５—１０个视野或中倍镜２个视野，计算肝细胞　中总阳性表达率的平均值。　１　８　阴性对照阴性对照采用ＰＣＲ反应液不加引物、ＤＮＡ聚合酶或信号　检测时不加碱性磷酸酶标记的抗地高辛酶标复合物，其余条件与上述相　同。另采用丙肝和脂肪肝等非乙肝组织切片各・例作对照。　２结果　２０ｆｉｌ标本中有１５例可见ＨＢＶｃｃｃＤＮＡＦＨ性信号，组织切片阳性表达率　为平均４０－８５％，以核型为主，呈浓密的蓝色、紫色或紫蓝色，呈颗粒状、弧形　或圆形团块状，主要在核及核膜上表达，（＋）——（＋＋＋＋）之间不等。用　ＰＳＡＤ酶消化后再用滚环扩增和跨缺口引物原｛ｇ＿ＰＣＲ的肝组织切片附陆信　号多呈蓝黑色颗粒状位于细胞核上，与周围边界清楚，使用不同剂量（２ｕ、　４ｕ）ＰＳＡＤ酶处理的肝组织切片，表现为阳性程度不同，但当肝细胞内　ＨＢＶｃｃｃＤＮＡ￣Ｎ较多或组织切片较厚、ＰＳＡＤ酶消化不充分时，则阳性信　号呈团块状与周围界限不清甚至整个胞核浓染呈蓝色或蓝黑色。　２Ｏ例患者中，ｌ例酒精性肝硬化合并乙肝肝硬化静止期的患者和１例肝　细胞性癌及１例乙肝慢性重症患者的组织切片中出现ＨＢＶｃｃｃＤＮＡ强阳性　表达；使用不同剂量ＰＳＡＤＸ￣ＪＪ￣组织切片进行消化后扩增，所得结果不完全　相同，使用２ｕＰＳＡＤ组附陛程度（深蓝色及蓝黑色）明显高于４ｕＰＳＡＤ组（紫　色）（见Ｂ图和Ｃ图），使用相同剂量的ＰＳＡＤ酶（３ｕ）消化的肝组织切片，由于　采用方法不同，细胞阳性程度也出现了差异，使用半套式原位ＰｃＲ方法　阳　性程度明显高于使用原位滚环扩增的方法（见Ｄ图和Ｅ图），肝穿组织（慢性　乙型肝炎）经过ＰｓＡＤ消化后，胞核Ｊ二阳性呈圆形颗粒状与周围界限较明显　出现空晕，而肝癌组织标本阳性则为团块状甚至整个胞核浓染。‘例血清　ＨＢＶＤＮＡ和乙肝表面抗原为阴性而肝组织中ＩＩＢＶＤＮＡ为１　０　５、　ｔｔＢＶｃｃｃＤＮＡ为阴性的肝硬化患者肝组织中出现了ＨＢＶｃｃｃＤＮＡ的表达；还　有一例肝组织免疫组化表面抗原为阴性，而血清中ＨＢＶＤＮＡ及ＨＢｓＡｇ、　Ｈ　Ｂ　ｅＡ　ｇ和Ｈ　Ｂ　ＣＡ　ｇ均为阳性的肝硬化患者的肝组织中亦出现了　ＨＢＶｃｃｃＤＮＡ的表达。阴性对照组肝细胞胞核为红色或不着色，均未见　ＨＢＶｃｃｃＤＮＡ的阳性表达。　３讨论　鉴于ＨＢＶｃｃｃＤＮＡ的检测在乙型肝炎治疗和诊断中的重要价值，如何　检测ＨＢＶｃ。（＝［）ＮＡ已成为国内外研究热点，利用分子病理学原｛ＦｚＰＣＲ方法　检ｉＮＨＢＶｃｃｃＤＮＡ的方法相对于分子生物学方法来言却少了许多，多为直　接或问接原位ＰＣＲ方法，所使用的方法为使用标记的跨缺口引物直接原位　ＰＣＲ方法或用跨缺口引物扩增后用原位杂交来显示信号的间接原位ＰＣＲ　方法，我们将组织切片用ＰＳＡＤ酶消化后先后使用原｛￣ＲＣＡ和原ｆ￣ｚＰＣＲＸ￣　ＨＢＶｃｃｃＤＮＡ进行基因扩增，然后用免疫组化方法显示信号，较传统方法相　比不但可以提高特异性，而且起到了放大信号的目的，增加了检测的敏感　性。荧光定量ＰＣＲ虽然亦能利用滚环扩增和荧光定量ＰＣＲ检测福尔马林固　定的石蜡包埋肝组织中的ＨＢＶｃｃｃＤＮＡ而且能够很好的定量，但扩增的　ｔｔＢＶｃｃｃＤＮＡ产物不能在肝组织细胞中定位，因而不能直接与肝组织细胞　特征相联系，而且需要从肝组织中提取ＤＮＡ，这是该技术一个局限性。而原　位ＲＣＡ和原位ＰＣＲ不需从肝组织中提取ＤＮＡ只需在切片上用蛋白酶Ｋ、　ＰＳＡＤ酶消化后进行扩增即可，不但省略　午多繁琐的操作步骤，避免了许　多人为因素的影响，减少了误差，而且大大降低了经济成本。并且组织切片　可长期保存，用于抗病毒药物治疗前后的参考依据，对乙型肝炎诊断、治疗　以及判断预后具有极其深远的意义。　（下转封三）