人基质金属蛋白酶-13(MMP-13)说明书
联科生物 Human MMP-2 ELISA Kit 说明书
Catalog Number EK1M02-48EK1M02-96定量检测血清、血浆和细胞培养上清中的人基质金属蛋白酶2(MMP-2)浓度。
本产品仅用于科学研究，非诊断试剂，不能用于临床诊断。
1.背景介绍基质金属蛋白酶2(MMP-2)，又名72kDa 的IV 型胶原酶和明胶酶A ，在人类中由MMP2基因编码。
激活MMP-2需要蛋白水解加工。
MMP-2在子宫内膜破裂、调节血管形成和炎症应答中起作用。
MMP-2参与许多事件，如癌症进程、癌细胞浸润、细胞信号转导、新血管形成和淋巴管生成。
MMP2基因突变与Torg-Winchester 综合征、多发性骨溶解、关节炎综合征有关，可能与瘢痕疙瘩有关。
非囊性纤维化支气管扩张中，相比于呼吸道感染铜绿假单胞菌的患者，感染流感嗜血杆菌患者的MMP-2浓度是升高的。
2.检测原理本试剂盒采用双抗体夹心酶联免疫吸附检测技术。
特异性抗人MMP-2抗体预包被在高亲和力的酶标板上。
酶标板孔中加入标准品、待测样本和生物素化的检测抗体，经过孵育，样本中存在的MMP-2与固相抗体和检测抗体结合。
洗涤去除未结合的物质后，加入辣根过氧化物酶标记的链霉亲和素(Streptavidin-HRP)。
洗涤后，加入显色底物TMB ，避光显色。
颜色反应的深浅与样本中MMP-2的浓度成正比。
加入终止液终止反应，在450nm 波长(参考波长570-630nm)测定吸光度值。
3.试剂盒检测的局限1)请在本试剂盒标示的有效期内使用。
2)试剂盒的试剂不能与其他批号的试剂或其他来源的试剂混合使用。
3)任何标准品稀释、操作人员、移液技术、洗涤技术、孵育温度、试剂盒保存时间的改变，都将影响结合反应。
4)本试剂盒在设计上去除或降低了生物学样本中的一些内源性干扰因素，并非所有可能的影响因素都已经去除。
Human MMP-2ELISA Kit 检测试剂盒（酶联免疫吸附法）EK1M02-01二、基本信息1.2.未提供的材料设备1)能够检测450nm吸光度的酶标仪，参考波长570nm或630nm2)移液器及枪头、加样槽3)准备试剂用的试管、离心管、量筒等4)蒸馏水或去离子水5)涡旋振荡器、微孔板振荡器3.贮存试剂盒保存于2-8℃，有效期标注于标签上。
IL-32、MMP-13及IL-1O在类风湿关节炎中的表达及意义研究
Ｇｅ ｎ ｅ ｒ ａ ｌ Ｈｏ ｓ ｐ ｉ ｔ ａ ｌ ， Ｔ ａ ｎ ｇ ｓ ｈ ａ ｎ ０ ６ ３ ０ ０ ０ ， Ｃ ｈ ｉ ｎ ａ
Ｃ ｏ ｒ ｒ ｅ ｓ ｐｏ ｎ ｄ ｉ ｎ ｇ ａ ｕ ｔ ｈ ｏ ｒ ： ＡＮ ｘｉ ｎ ． Ｅ ｍａ ｉ ｌ ： ｋ ｌ ｙ ｙ ａ ｎ ｘ ｉ ｎ ＠ｌ ６ ３ ． ｃ ｏ ｍ
（ Ｅ Ｌ Ｉ Ｓ Ａ ） ． Ｔ ｏ ａ ｐ ｐ ｌ ｙ Ｓ ｐ ｅ ａ ｒ ｍａ ｎ ａ ｎ ａ ｌ ｙ ｓ ｉ ｓ ｔ ｏ ｔ ｅ ｓ ｔ ｔ ｈ ｅ ｃ ｏ ｒ ｒ ｅ ｌ ａ ｉ ｔ ｏ ｎ ｓ ｏ ｆ ａ ｂ ｏ ｖ ｅ ｒ ｅ ｓ ｕ ｌ ｔ ｓ ａ ｎ ｄ ｎｔ ａ ｉ － Ｃ Ｃ Ｐ ａ ｎ ｔ ｉ ｂ ｏ ｄ ｙ ， ｒ ｈ ｅ ｕ ｍａ ｔ ｏ ｉ ｄ
【 摘要】 目的 探 讨 白细胞介 素． ３ ２（ 几． ３ ２ ）、 基质金属蛋 白酶． １ ３（ ＭＭＰ ． １ ３ ） 、白细胞介素． １ Ｏ（ 几． １ ０ ） 在类风湿关节炎 （ Ｒ Ａ）发生、病程发展 中的意义 。方法 采用 Ｅ Ｌ Ｉ Ｓ Ａ法 ，检测 １ １ ５例 Ｒ Ａ、７ ６ 例对照 组血
（ ＭＭＰ － １ ３ ）ａ ｎ ｄ ｉ ｎ ｔ ｅ ｒ ｌ ｅ ｕ ｋ ｉ ｎ － １ ０（ Ｉ Ｌ － １ ０ ） ｉ ｎ ｒ ｈ ｅ ｕ ｍａ ｔ ｏ ｉ ｄ ａ ｒ ｔ ｈ ｉ ｒ ｔ ｉ ｓ（ Ｒ Ａ ） ． Ｍｅ ｔ ｈ ｏ ｄ ｓ Ｉ Ｌ ３ ２ ， ＭＭＰ ． １ ３ ａ ｎ ｄ Ｉ Ｌ ． １ ０ ｗ ｅ ｒ ｅ
酶谱法检测血清中基质金属蛋白酶活性
➢ MMP-2又叫明胶酶A， 其蛋白主要由纤维结缔组织细胞和肿瘤细胞产生，分子量 为72kDa。
➢ MMP-9又称为明胶酶B，主要由单核细胞、巨噬细胞多形核白细胞和肿瘤细胞产 生。分子量为92kDa，是MMPs中分子量最大旳酶。
➢ NGAL能与MMP-9以二硫键旳方式结合，能起到保护和调整MMP-9功能旳作用，所以NGAL 与肿瘤旳侵袭移动有亲密旳联络。
➢ 汕头大学医学院生物化学与分子生物学教研室李恩民教讲课题组以转染有pcDNA3 空白质粒 载体旳SHEEC 细胞为对照，酶谱法检测成果表白，转染有pcDNA-NGAL (-) 旳SHEEC 细胞 分泌旳MMP-9 和MMP-2旳活性均明显降低；而与此同步，转染有pcDNA-NGAL (＋) 旳 SHEEC 细胞分泌旳MMP-9 和MMP-2旳活性均明显升高。表白经过有义、反义技术使NGAL 基因体现发生变化能够对SHEEC 细胞分泌旳MMP-9 和MMP-2 旳活性产生明显影响。
➢ 胶原是ECM旳主要成份，目前已发觉，至少有12种不同胶原类型，其中以I、Ⅱ、Ⅲ 型胶原是间质结缔组织中旳主要成份。Ⅳ型胶原则主要存在于基底膜内。
➢ 肿瘤细胞旳侵袭是需要与细胞增殖、分化、移动旳有关基因及其体现调控模式旳变化 和增进细胞移动旳外界原因两者旳共同作用。
➢ 虽然肿瘤细胞侵袭旳分子机制还不是十分清楚，但已发觉许多调控细胞侵袭转移旳关 键分子及其信号通路。
脱色至蓝色背景和白色条带均十分明显时，用5％乙酸中断脱色； （4）待凝胶在5％乙酸中恢复到合适大小后，用凝胶图象处理系统分析成果，以白色条 带旳净光密度值相对定量样品中酶活性。
人基质金属蛋白酶-9(MMP-9)ELISA试剂盒说明书
人基质金属蛋白酶-9（MMP-9）酶联免疫分析（ELISA）试剂盒使用说明书厦门慧嘉生物科技有限公司本试剂仅供研究使用目的：本试剂盒用于测定人血清，血浆及相关液体样本中基质金属蛋白酶-9（MMP-9）含量。
实验原理：本试剂盒应用双抗体夹心法测定标本中人基质金属蛋白酶9（MMP-9）水平。
用纯化的人基质金属蛋白酶9（MMP-9）抗体包被微孔板，制成固相抗体，往包被单抗的微孔中依次加入人基质金属蛋白酶9（MMP-9），再与HRP标记的基质金属蛋白酶9（MMP-9）抗体结合，形成抗体-抗原-酶标抗体复合物，经过彻底洗涤后加底物TMB显色。
TMB在HRP酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色。
颜色的深浅和样品中的人基质金属蛋白酶9（MMP-9）呈正相关。
用酶标仪在450nm波长下测定吸光度（OD值），通过标准曲线计算样品中人基质金属蛋白酶-9（MMP-9）浓度。
试剂盒组成：样本处理及要求：1. 血清：室温血液自然凝固10-20分钟，离心20分钟左右（2000-3000转/分）。
仔细收集上清，保存过程中如出现沉淀，应再次离心。
2. 血浆：应根据标本的要求选择EDTA或柠檬酸钠作为抗凝剂，混合10-20分钟后，离心20分钟左右（2000-3000转/分）。
仔细收集上清，保存过程中如有沉淀形成，应该再次离心。
3. 尿液：用无菌管收集，离心20分钟左右（2000-3000转/分）。
仔细收集上清，保存过程中如有沉淀形成，应再次离心。
胸腹水、脑脊液参照实行。
4. 细胞培养上清：检测分泌性的成份时，用无菌管收集。
离心20分钟左右（2000-3000转/分）。
仔细收集上清。
检测细胞内的成份时，用PBS（PH7.2-7.4）稀释细胞悬液，细胞浓度达到100万/ml左右。
通过反复冻融，以使细胞破坏并放出细胞内成份。
离心20分钟左右（2000-3000转/分）。
仔细收集上清。
保存过程中如有沉淀形成，应再次离心。
2酶谱法检测血清基质金属蛋白酶MMP2MMP9活性护理课件
某大型综合医院利用酶谱法检测血清MMP-2、MMP-9活性，成功监测了一例结直肠癌患者的病情进展。通过定 期检测血清中MMP-2、MMP-9的活性，医护人员能够及时了解患者病情变化，为调整治疗方案提供科学依据。
失败案例分析
案例一
某医疗机构在采用酶谱法检测血清MMP-2、MMP-9活性时 ，由于试剂质量不过关，导致检测结果不准确，未能及时发 现患者的恶性肿瘤。该案例提示我们，选用质量可靠的试剂 是保证酶谱法检测准确性的关键。
实验环境要求
实验室应保持清洁、干燥、通风良好 ，避免有害气体滞留。
实验室的废弃物应分类存放，并及时 处理，避免对环境和人体造成危害。
实验室的温度和湿度应控制在适宜范 围内，避免影响实验结果和仪器设备 的正常运转。
废弃物处理
实验中产生的废液、废气和固体 废弃物应分类收集，并按照相关
规定进行处理。
实验中使用的危险化学品和放射 性物质应存放在专用的安全柜内
。
操作步骤
按照酶谱法检测血清基质金属蛋白 酶mmp2、mmp9活性的实验操作 步骤进行实验，确保每一步操作准 确无误。
质量控制
在实验过程中进行质量控制，确保 实验结果的准确性和可靠性。
结果报告与反馈
结果分析
对实验结果进行分析，包 括数据整理、统计和图表 制作等。
结果报告
根据分析结果撰写实验报 告，包括实验目的、方法 、结果和结论等。
有助于早期发现疾病 ，提高治疗效果和患 者生存率。Leabharlann 02酶谱法检测技术
酶谱法原理
酶谱法是一种通过检测酶的活性 来反映生物体生理或病理状态的
方法。
酶是生物体内的一种蛋白质，具 有催化特定化学反应的能力。
通过检测酶的活性，可以了解生 物体内相关生化过程的状况，进
原发性肝癌中MMP-9、MMP-13和TIMP-3的表达及意义
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ｔ ｈｅ ｔ ｕｍｏ ｒ ｓ ｉ ｚ ｅ，ｈ ｉ ｓ ｔ ｏ ｌ ｏ ｇ ｉ ｃ ａ ｌ ｇ ｒ ａ ｄ ｅ，ａ ｎｄ ｍｅ ｔ ａ ｓ ｔ ａ ｓ ｉ ｓ ｓ ｔ ａ ｓ ｕ ｌ ｔ ｓ Ｃｏ ｍｐａ ｒ ｅ ｄ ｗｉ ｔ ｈ ｎ ｏ ｍ ａ ｒ ｌ ｌ ｉ ｖ ｅ ｒ ｔ ｉ ｓ ｓ ｕ ｅ ｓ，
MMP基础知识
M atrix M etallo p roteinase soverviewMMPs ：一类锌依赖性的内肽酶家族，最早因为其分解胶原蛋白的活性而被发现，顾名基质金属蛋白酶特点：•至少对一种ECM 物质具有蛋白分解活性•锌依赖性•激活•抑制功能：在胚胎发育，器官重塑，组织形成，损伤修复，炎症过程，心血管疾病发生，癌症进展，神经突触发育等方面发挥作用ECM ：胶原，蛋白多糖，氨基糖苷，生物活性分子储存库历史milestones•1962发现by Woessner一种能够分解胶原蛋白的酶命名为间质胶原酶，即MMP-1•1966从水螅尾部及背部首次纯化出来•MMP-2明胶酶A（1970s）与MMP-3基质降解酶1（1985）相继发现并纯化发现MMP-2的不同特点特点•1972组织金属蛋白酶抑制剂-1（TIMP-1）首次发现•1980s首次使用MMP命名•1994催化区域结构首次发表•1997第一种MMP-7缺陷小鼠问世历史milestones现在•26种脊椎动物MMP，其中人类发现23种•5种TIMP•各种类型的缺陷小鼠研究热点心血管疾病MMP调控MMP imaging分类•外肽酶&内肽酶•丝氨酸蛋白酶半胱氨酸蛋白酶天冬氨酸蛋白酶金属蛋白酶•5个超家族中的锌蛋白酶：催化结构中三个组氨酸与锌离子配位，一个甲硫氨酸转角•zinc-binding motif reads HEBXHXBGBXH Z•根据Z的不同可分为四类：Serralysin脯氨酸Astacin（虾红素）谷氨酸Adamalysin（去整合素）天冬氨酸包括与MMPs密切相关的是一种解聚素-金属蛋白酶(a disintegrin and metalloprotease，ADAM)和I型血小板结合蛋白基序的解聚蛋白样金属蛋白酶(a distintegrin and metalloprotease with thrombospondin motifs，ADAMTS)家族。
人基质金属蛋白酶-2(MMP-2)酶联免疫分析
人基质金属蛋白酶-2（MMP-2）酶联免疫分析试剂盒使用说明书本试剂盒仅供研究使用。
检测范围：96T20 ng/ml -480 ng/ml使用目的：本试剂盒用于测定人血清、血浆及相关液体样本中基质金属蛋白酶-2（MMP-2）含量。
实验原理本试剂盒应用双抗体夹心法测定标本中人基质金属蛋白酶-2（MMP-2）水平。
用纯化的人基质金属蛋白酶-2（MMP-2）抗体包被微孔板，制成固相抗体，往包被单抗的微孔中依次加入MMP-2，再与HRP 标记的MMP-2 抗体结合，形成抗体-抗原-酶标抗体复合物，经过彻底洗涤后加底物TMB 显色。
TMB 在HRP 酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色。
颜色的深浅和样品中的基质金属蛋白酶-2（MMP-2）呈正相关。
用酶标仪在450nm 波长下测定吸光度（OD 值），通过标准曲线计算样品中人基质金属蛋白酶-2（MMP-2）浓度。
试剂盒组成1 30 倍浓缩洗涤液20ml×1 瓶7 终止液6ml×1 瓶2 酶标试剂6ml×1 瓶8 标准品（960ng/ml）0.5ml×1 瓶3 酶标包被板12 孔×8 条9 标准品稀释液1.5ml×1 瓶4 样品稀释液6ml×1 瓶10 说明书1 份5 显色剂A 液6ml×1 瓶11 封板膜2 张6 显色剂B 液6ml×1/瓶12 密封袋1 个标本要求1．标本采集后尽早进行提取，提取按相关文献进行，提取后应尽快进行实验。
若不能马上进行试验，可将标本放于-20℃保存，但应避免反复冻融2．不能检测含NaN3 的样品，因NaN3 抑制辣根过氧化物酶的（HRP）活性。
操作步骤1. 标准品的稀释：本试剂盒提供原倍标准品一支，用户可按照下列图表在小试管中进行稀释。
480 ng/ml 5 号标准品150μl 的原倍标准品加入150μl 标准品稀释液240 ng/ml 4 号标准品150μl 的5 号标准品加入150μl 标准品稀释液120 ng/ml 3 号标准品150μl 的4 号标准品加入150μl 标准品稀释液60 ng/ml 2 号标准品150μl 的3 号标准品加入150μl 标准品稀释液30 ng/ml 1 号标准品150μl 的2 号标准品加入150μl 标准品稀释液2. 加样：分别设空白孔（空白对照孔不加样品及酶标试剂，其余各步操作相同）、标准孔、待测样品孔。
基质金属蛋白酶3
基质金属蛋白酶3基质金属蛋白酶3（MatrixMetalloproteinase3，简称MMP-3）是一种金属蛋白酶家族中的一员，位于人体内的细胞基质中。
它可以调节细胞增殖、迁移和凋亡，在肿瘤发生、发展、转移和死亡中发挥重要作用。
MMP-3与肿瘤发生有密切联系。
MMP-3可以增加血管内皮细胞的障性能，促进肿瘤侵袭和转移，并且与肿瘤的病理分期、侵袭性和预后有关。
一项有关乳腺癌的研究发现，MMP-3表达水平与肿瘤相关血管生成、侵袭性和转移有关。
此外，研究表明，MMP-3可能在P53缺陷的小鼠肿瘤发生中发挥作用。
MMP-3还参与调节炎症反应，其可能在炎性疾病（如哮喘和偏头痛）的发病和发展过程中发挥作用。
此外，MMP-3还可以影响心血管系统疾病（如动脉粥样硬化）和神经系统疾病（如阿尔茨海默病）的发病机制。
MMP-3的调节通过许多蛋白质，尤其是转录因子和miRNA等因子而实现。
在特定的环境中，转录因子和miRNA可以调节MMP-3的表达水平，从而影响细胞的侵袭、增殖、凋亡和肿瘤发生发展。
进一步的研究显示，许多炎性介质、激素、细胞因子和神经活性物质可以调节MMP-3的表达。
MMP-3的研究正在发展，正在寻找新的方法来防止和治疗肿瘤和其他炎性疾病。
例如，研究人员正在开发抗MMP-3的抗体，以减少肿瘤的侵袭能力和转移，也可用来抑制炎性疾病的发展。
此外，研究人员还在研究MMP-3可能影响的其他信号转导通路，以更好地调节MMP-3。
虽然继续对MMP-3的研究可以增加对炎症反应及其相关疾病的认识，但也具有一定的风险。
需要注意的是，抗炎药物和免疫抑制剂的使用可能会影响MMP-3的表达水平，从而影响肿瘤发展及其他炎性疾病的发展。
此外，MMP-3与炎症反应的调节可能会受到多种环境因子的影响，因此，MMP-3的研究必须仔细考虑这些环境因素。
未来，MMP-3的研究将提供更多有关肿瘤发展及其他炎症性疾病的认识，以期早日为人类提供更加有效的治疗方法。
烤瓷牙基底冠合金影响人牙龈成纤维细胞MMP-13表达的实验
通讯作者：黄克强，Email：hkq9@163．com。
收稿日期：2012－01－22·论著·烤瓷牙基底冠合金影响人牙龈成纤维细胞MMP－13表达的实验研究胡静，黄克强，杜雅，卢琳（辽宁医学院附属口腔医院，辽宁锦州121001）摘要：目的观察不同种类烤瓷牙金属基底冠浸提液对人牙龈成纤维细胞中MMP－2、MMP－13表达水平的影响。
方法制备镍铬、钴铬、纯钛和金合金浸提液，改良组织块法培养人牙龈成纤维细胞，1、6、12、24h 分别收集四种浸提液处理后的细胞上清液，ELISA法测定MMP－13表达水平。
结果镍铬合金、钴铬合金组MMP－13表达水平高于其他实验组和阴性对照组（P＜0．05），差异有统计学意义；纯钛、金合金组MMP－13表达水平与阴性对照组比较（p＞0．05）差异无统计学意义。
结论镍铬合金、钴铬合金上调MMP－13表达水平，对人牙龈成纤维细胞损伤大；纯钛、金合金具有良好的生物相容性。
关键词：人牙龈成纤维细胞；细胞培养；金属浸提液；金属蛋白酶中图分类号：R781．41文献标识码：AThe effect of base metal alloys crown extract on humangingival fibroblast MMP－2，MMP－13expression levelsHU Jing，HUANG Ke－qiang，DU Ya，et al（Liaoning Medical University，Jinzhou，Liaoning121000，P．R．China）Abstract：【Objective】To observe the effects of different types of base metal alloy crown extract on human gin-gival fibroblast MMP－2，MMP－13expression．【Methods】Nickel chrome alloy，cobalt chromium alloy，titanium and gold platinum alloy metal extracts were prepared．Human gingival fibroblasts were cultured by using improved vitro celture method．Supernates were collected1，6，12，24hours after stimulated by four metal extracts respectively．ELISA method was used to exam the MMP－2，MMP－13expression．【Results】The expression of MMP－2，MMP －13in nickel chrome alloy，cobalt chromium alloy group was significantly higher than that of other experiment group and control group（P＜0．05）．No statistical significance was fouynd between the expression of MMP－2，MMP－13 in titanium，gold platinum alloy group and the control group（P＞0．05）．【Conclusion】nickel chrome alloy and co-balt chromium alloy increase human gingival fibroblast MMP－2，MMP－13expression．Titanium and gold platinum alloy have good biocompatibility．Key words：human gingival fibroblasts（HGFs）；cell culture；metalsextract；matrixmetalloproteinasesbase金属烤瓷修复体由于兼有金属的强度和瓷的美观而受到患者和医生的普遍欢迎，为临床广泛应用。
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人基质金属蛋白酶-13（MMP-13）酶联免疫酶联免疫分析分析分析
试剂试剂盒使用说明书盒使用说明书盒使用说明书
本试剂盒仅供研究使用。
检测范围检测范围：： 96T
10µg/L -320µg/L
使用目的使用目的：：
本试剂盒用于测定人血清、血浆及相关液体样本中基质金属蛋白酶-13（MMP-13）含量。
实验原理
本试剂盒应用双抗体夹心法测定标本中人基质金属蛋白酶-13（MMP-13）水平。
用纯化的人基质金属蛋白酶-13（MMP-13）抗体包被微孔板，制成固相抗体，往包被单抗的微孔中依次加入基质金属蛋白酶-13（MMP-13），再与HRP 标记的基质金属蛋白酶-13（MMP-13）抗体结合，形成抗体-抗原-酶标抗体复合物，经过彻底洗涤后加底物TMB 显色。
TMB 在HRP 酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色。
颜色的深浅和样品中的基质金属蛋白酶-13（MMP-13）呈正相关。
用酶标仪在450nm 波长下测定吸光度（OD 值），通过标准曲线计算样品中人基质金属蛋白酶-13（MMP-13）浓度。
试剂盒组成 1 30倍浓缩洗涤液 20ml ×1瓶 7 终止液
6ml ×1瓶 2 酶标试剂 6ml ×1瓶 8 标准品（640µg/L ） 0.5ml ×1瓶 3 酶标包被板 12孔×8条 9 标准品稀释液 1.5ml ×1瓶 4 样品稀释液 6ml ×1瓶 10 说明书 1份 5 显色剂A 液 6ml ×1瓶 11 封板膜 2张 6
显色剂B 液
6ml ×1/瓶
12
密封袋
1个
标本标本要求要求
1．标本采集后尽早进行提取，提取按相关文献进行，提取后应尽快进行实验。
若不能马上进行试验，可将标本放于-20℃保存，但应避免反复冻融
2．不能检测含NaN3的样品，因NaN3抑制辣根过氧化物酶的（HRP ）活性。
操作步骤
1. 标准品的稀释：本试剂盒提供原倍标准品一支，用户可按照下列图表在小试管中进行稀
释。
320µg/L 5号标准品 150µl 的原倍标准品加入150µl 标准品稀释液 160µg/L 4号标准品 150µl 的5号标准品加入150µl 标准品稀释液 80µg/L 3号标准品 150µl 的4号标准品加入150µl 标准品稀释液 40µg/L 2号标准品 150µl 的3号标准品加入150µl 标准品稀释液 20µg/L
1号标准品
150µl 的2号标准品加入150µl 标准品稀释液
2. 加样：分别设空白孔（空白对照孔不加样品及酶标试剂，其余各步操作相同）、标准孔、
待测样品孔。
在酶标包被板上标准品准确加样50µl ，待测样品孔中先加样品稀释液40µl ，然后再加待测样品10µl （样品最终稀释度为5倍）。
加样将样品加于酶标板孔底部，尽量不触及孔壁，轻轻晃动混匀。
3. 温育：用封板膜封板后置37℃温育30分钟。
4. 配液：将30倍浓缩洗涤液用蒸馏水30倍稀释后备用
5. 洗涤：小心揭掉封板膜，弃去液体，甩干，每孔加满洗涤液，静置30秒后弃去，如此
重复5次，拍干。
6. 加酶：每孔加入酶标试剂50µl ，空白孔除外。
7. 温育：操作同3。
8. 洗涤：操作同5。
9. 显色：每孔先加入显色剂A50µl ，再加入显色剂B50µl ，轻轻震荡混匀，37℃避光显色
10分钟.
10. 终止：每孔加终止液50µl ，终止反应（此时蓝色立转黄色）。
11. 测定：以空白空调零，450nm 波长依序测量各孔的吸光度（OD 值）。
测定应在加终止
液后15分钟以内进行。
操作程序总结操作程序总结：：
计算
以标准物的浓度为横坐标，OD 值为纵坐标，在坐标纸上绘出标准曲线，根据样品的OD 值由标准曲线查出相应的浓度；再乘以稀释倍数；或用标准物的浓度与OD 值计算出标
准曲线的直线回归方程式，将样品的OD值代入方程式，计算出样品浓度，再乘以稀释倍数，即为样品的实际浓度。
注意事项
1．试剂盒从冷藏环境中取出应在室温平衡15-30分钟后方可使用，酶标包被板开封后如未用完，板条应装入密封袋中保存。
2．浓洗涤液可能会有结晶析出，稀释时可在水浴中加温助溶，洗涤时不影响结果。
3．各步加样均应使用加样器，并经常校对其准确性，以避免试验误差。
一次加样时间最好控制在5分钟内，如标本数量多，推荐使用排枪加样。
4．请每次测定的同时做标准曲线，最好做复孔。
如标本中待测物质含量过高（样本OD值大于标准品孔第一孔的OD值），请先用样品稀释液稀释一定倍数（n倍）后再测定，计算时请最后乘以总稀释倍数（×n×5）。
5．封板膜只限一次性使用，以避免交叉污染。
6．底物请避光保存。
7．严格按照说明书的操作进行，试验结果判定必须以酶标仪读数为准.
8．所有样品，洗涤液和各种废弃物都应按传染物处理。
9．本试剂不同批号组分不得混用。
保存条件及有效期
1．试剂盒保存：；2-8℃。
2．有效期：6个月。