酶细胞原生质体固定化
固定化
固定化技术及其应用摘要固定化细胞技术是酶工程的核心技术之一，它将酶工程提高到一个新水平。
该技术简化了工业分离纯化的步骤，并使酶反应的连续生产成为现实。
目前，该技术已经广泛应用于食品、发酵、三废处理等行业，经济效益显著。
首先分析了固定化细胞的优缺点，介绍了近年来在食品、发酵和三废处理行业的应用，最后对其应用进行了展望。
关键词固定化酶；食品；发酵；三废处理；应用引言固定化细胞就是被限制自由移动的细胞，既细胞受到物理化学等因素约束或限制在一定的空间界限内，但细胞仍保留催化活性并具备能被反复或连续使用的活力。
是在酶固定化基础上发展起来的一项技术。
【1】固定化微生物技术使用化学或物理手段，将游离细胞或者酶定位于限定的区域，使其保持活性并可反复利用的方法。
最初主要用于发酵生产，70年代后期，被利用到水处理领域，近年来则成为各国学者研究的热点【2】。
固定化微生物技术克服了生物细胞太小，与水溶液分离较难，易造成二次污染的缺点，保持了效率高、稳定性强、能纯化和保持高效菌种的优点，在废水处理领域有广阔的应用前景。
在实际应用过程中，如何固定、何种载体，才能使固定化微生物能较长时间的保持一定的强度和活度，才能降低固定化成本，延长固定微生物的使用寿命，是该技术在污水处理中得到广泛应用的关键。
固定化技术作为实现动物细胞大规模培养的重要途径, 相对悬浮培养而言具有细胞生长密度高、抗剪切力和抗污染能力强、产物易于收集和分离纯、对贴壁型和非贴壁型细胞【3】都适用的优点, 因此在动物细胞的大规模培养上得到越来越广泛的应用,相继出现了微载体、中空纤维及微囊化等多种固定化培养技术。
本文作者将结合动物细胞的培养特性,介绍目前动物细胞大规模培养中的固定化技术。
酶作为一种蛋白质，其催化活性与空间结构密切相关，在大多数情况下固相酶的催化活性较低，以固定化氨基酰化酶为例，选择比较好的载体材料和固定化方法，其活性一般也仅为游离酶的50％～60％。
酶工程期末复习题
第一章绪论问题：试述木瓜蛋白酶的生产方法？答：木瓜蛋白酶可以采用提取分离法、基因工程菌发酵法、植物细胞培养法等多种方法进行生产。
(1)提取分离法：从木瓜的果皮中获得木瓜乳汁，通过各种分离纯化技术获得木瓜蛋白酶。
(2)发酵法：通过DNA重组技术将木瓜蛋白酶的基因克隆到大肠杆菌等微生物中，获得基因工程菌，在通过基因工程菌发酵获得木瓜蛋白酶。
(3)植物细胞培养法：通过愈伤组织诱导获得木瓜细胞，在通过植物细胞培养获得木瓜蛋白酶。
第二章微生物发酵产酶1、解释酶的发酵生产、酶的诱导、酶的反馈阻遏(产物阻遏)、分解代谢物阻遏。
诱导物的种类？答：酶的发酵生产：利用微生物的生命活动获得所需的酶的技术过程；酶的诱导：加进某些物质，使酶的生物合成开始或加速的现象，称为诱导作用；产物阻遏（反馈阻遏）：指酶催化反应的产物或代谢途径的末端产物使该酶的生物合成受到阻遏的现象。
分解代谢物阻遏（营养源阻遏）：是指某些物质经过分解代谢产生的物质阻遏其他酶合成的现象。
诱导物的种类：诱导物一般是酶催化作用的底物或其底物类似物，有的也是反应产物。
2、微生物产酶模式几种？特点？最理想的合成模式是什么？答：（1）同步合成型特点：a.发酵开始，细胞生长，酶也开始合成，说明不受分解代谢物和终产物阻遏。
b.生长至平衡期后，酶浓度不再增长，说明mRNA很不稳定。
（2）延续合成型特点：a.该类酶一般不受分解代谢产物阻遏和终产物阻遏。
b.该酶对应的mRNA是相当稳定的。
（3）中期合成型特点：a.该类酶的合成受分解代谢物阻遏和终产物阻遏。
b.该酶对应的mRNA不稳定。
（4）滞后合成型特点：a.该类酶受分解代谢物阻遏和终产物阻遏作用的影响，阻遏解除后，酶才大量合成。
b.该酶对应的mRNA稳定性高。
选择：在酶的工业生产中，为了提高酶产率和缩短发酵周期，最理想的合成模式是延续合成型。
3、可以添加什么解除分解代谢物阻遏？表面活性剂的作用？答：（1）一些酶的发酵生产时要控制容易降解物质的量或添加一定量的cAMP，均可减少或解除分解代谢物阻遏作用。
固定化酶和固定化细胞ppt课件
❖（3）溴化氰法 即用溴化氰将含有羟基的载体，如 纤维素、葡聚糖凝胶、琼脂糖凝胶等，活化生成亚 氨基碳酸酯衍生物，然后再与酶分子上的氨基偶联， 制成固定化酶。
❖ 任何具有连位羟基的高聚物都可用溴化氰法来活化。
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❖（4）烷基化和芳基化法 以卤素为功能团的载体 可与酶蛋白分子上的氨基、巯基、酚基等发生烷 基化或芳基化反应而使酶固定化。
❖ （4）其他：半胱氨酸残基的巯基；丝氨酸、苏氨酸和酪 氨酸残基的羟基；组氨酸残基的咪唑基；色氨酸残基的吲 哚基。
❖ 酶共价偶联的载体的功能基团：芳香氨基、羟基、羧 基和羧甲基等。
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载体活化的主要反应 ❖ 重氮法 ❖ 叠氮法 ❖ 溴化氰法 ❖ 芳香烃化法
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❖（1）重氮法 重氮法是将酶蛋白与水不溶性载体 的重氮基团通过共价键相连接而固定化的方法， 是共价键法中使用最多的一种。
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❖ （1）凝胶包埋法 ▪ 将聚合物的单体与酶溶液混合，再借助于聚合 促进剂(包括交联剂)的作用进行聚合，酶被包 埋在聚合物中以达到固定化。 ▪ 凝胶包埋法常用的载体有海藻酸钠凝胶、角叉 菜胶、明胶、琼脂凝胶、卡拉胶等天然凝胶以 及聚丙烯酰胺、聚乙烯醇和光交联树脂等合成 凝胶或树脂。
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❖ （2）微胶囊包埋法 ▪ 微胶囊包埋即将酶包埋在各种高聚物制成的半 透膜微胶囊内的方法。它使酶存在于类似细胞 内的环境中，可以防止酶的脱落，防止微囊外 的环境直接接触，从而增加了酶的稳定性。常 用于制造微胶囊的材料有聚酰胺、火棉胶、醋 酸纤维素等。
❖ 常用的载体有多糖类的芳族氨基衍生物、氨基酸 的共聚体和聚丙烯酰胺衍生物等。
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❖（2）叠氮法 即载体活化生成叠氮化合物，再与 酶分子上的相应基团偶联成固定化酶。
名词解释
点。
（1）差速离心特点：用于分离大小和密度差异较大的颗粒。
（2）密度梯度离心特点：：
区带内的液相介质密度小于样品物质颗粒的密度。
适宜分离密度相近而大小不同的固相物质。
（3）等密度梯度离心特点：
介质的密度梯度范围包括所有待分离物质的密度。
适于分离沉降系数相近，但密度不同的物质。
5、酶的分离纯化过程中常用沉淀法的种类及原理。
第一章 绪论
1、 何谓酶工程，试述其主要内容和任务。 答：酶的生产、改性与应用的技术过程称为酶工程。 酶的生产：微生物发酵产酶、动植物培养产酶、酶的提取和分离纯化 酶的改性：酶分子修饰、酶固定化、酶非水相催化和酶的定向进化 酶的应用：通过酶的催化作用获得人们所需的酶，并通过各种方法使 酶的催化特性得以改进，充分发挥其催化功能。 酶工程的内容：微生物细胞发酵产酶，动植物细胞培养产酶，酶的提 取与分离纯化，酶分子的修饰，酶、细胞、原生质体固定化，酶非水 相催化，酶定向进化，酶反应器和酶的应用等。
第二章 酶的生物合成与发酵生产
1、提高酶的产量的措施。 （一）遗传控制 诱变育种 (1)使诱导型变为组成型——选育组成型突变株 (2)使阻遏型变为去阻遏型
选育营养缺陷型突变株 解除反馈阻遏
选育结构类似物抗性突变株 解除分解代谢物阻遏——选育抗分解代谢阻遏突变株 基因工程育种 改变细胞调节基因，使菌种由诱导型变为组成型。 增加结构基因的拷贝数，增加细胞专一性酶的生产。 （二）条件控制 （1）添加诱导物
缺点：只适合作用于小分子底物和产物的酶。 ④共价结合法：结合牢固，不易脱落，可连续使用较长的时间 载体活化操作复杂，对酶的活性有影响。 ⑤交联法：交联法制备的固定化酶或固定化菌体结合牢固，可以长时 间使用。交联法也用于含酶菌体或菌体碎片的固定化。 2、酶固定化后性质会发生什么变化？原因是什么？酶固定化后稳定性 提高中,包括哪几方面的稳定性？ （1）酶的活性 ：通常低于天然酶（有例外）。 （2）酶的稳定性 酶的耐热性、对变性剂、抑制剂、蛋白酶的抵抗力增加，固定化可以 增强贮存稳定性和操作稳定性。 可能的原因：①固定化增加了酶活性构象的牢固程度，可防止酶分子 伸展变形； ②抑制酶的自身降解。 ③固定化部分阻挡了外界不利因素对酶的侵袭。 包括：（一）酶的最适温度 最适温度与酶稳定性有关。 多数酶固定化后热稳定性上升，最适温度也上升（有例外）。 （二）酶的最适pH 带负电荷载体 ：最适pH 向碱性偏移。 带正电荷载体 ：最适pH 向酸性偏移 （三）酶的动力学特征 固定化酶的表观米氏常数Km随载体的带电性能变化。 固定化载体与底物电荷相反,固定化酶的表观Km值降低。
酶的固定化
固定化技术
一、固定化酶的概念
固定化酶是指固定在一定载体上并在一定 的空间范围内进行催化反应的酶。 水溶性酶 水不溶性载体
固定化技术 水不溶性酶 （ 固相酶）
酶的固定化技术和固定化酶
酶 可溶 间歇 固定化
吸附
包埋
间歇
交联
连续
结合
固定化酶与游离酶相比，具有下列优点：
1.极易将固定化酶与底物、产物分开； 2.可以在较长时间内进行反复分批反应和装柱连续反应； 3.在大多数情况下，能够提高酶的稳定性； 4.酶反应过程能够加以严格控制； 5.产物溶液中没有酶的残留，简化了提纯工艺； 6.较游离酶更适合于多酶反应； 7.可以增加产物的收率，提高产物的质量； 8.酶的使用效率提高，成本降低。
吸附法
常用的固体吸附剂：活性炭、氧化铝、 硅藻土、羟基磷灰石等。 优点：操作简便，条件温和，不引起 酶失活，载体廉价，而且可反复使用。 缺点：结合力弱，易解吸附由于靠物 理吸附作用，结合力较弱，酶与载体 结合不牢固而容易脱落，所以使用受 到一定的限制。
吸附法
（1）常用载体
无机物
活性炭、白陶土、 氧化铝、多孔玻璃、 硅胶、碳酸钙凝胶 有机物 高分子化合物 淀粉麸质、大孔树脂、 DEAE纤维素、 DEAE葡聚糖凝胶
共价键结合法
酶与不溶于水的载体以共价键形式结合制备 固定化酶的方法。即，通过化学共价键，把与酶 蛋白活性无关的氨基酸功能基团连接在不溶于水 的载体上。
（1）酶与载体反应的主要功能基团
游离羟基：肽链C－末端的α –羧基，天门冬酰氨酸 ，谷氨酸的β－γ羧基 游离氨基：肽链N－末端的δ －氨基， 赖氨酸ε －氨基 巯基：半胱氨酸 羟基：丝氨酸，苏氨酸 酚基：酪氨酸 咪唑基：组氨酸
酶的固定化及其应用
吸附法固定化酶举例
载体 活性炭
多孔玻璃
氧化铝 碳酸钙凝胶 纤维素 麸素 硅胶
固定化酶
α －淀粉酶、β －淀粉酶 蔗糖转化酶、葡萄糖淀粉酶 核糖核酸酶、木瓜蛋白酶 脂肪酶、葡萄糖氧化酶 葡萄糖氧化酶 亮氨酸氨肽酶 胰蛋白酶、核糖核酸酶
共价键结合法
（4）优缺点
优点：酶与载体结合较牢固，不易脱落，有利于长
时间使用。
缺点：制备条件复杂；酶蛋白活性中心易破坏
离子键结合法
酶与具有离子交换基团的不溶性载体结合形成固定化酶
（1）所用载体
纤维素的衍生物，离子交换树脂
（2）固定化酶的制备机理
酶蛋白的带电基团和含有离子交换基团的固相载 体之间由于静电相吸而形成络合物，使酶吸附到 离子交换剂上。
（4）酶与载体必须结合牢固，从而使固定化酶能 回收贮藏，利于重复使用。
（5）固定化酶应有最大的稳定性，所选载体不与 废物、产物或反应液发生化学反应。
（6）固定化酶成本要低，以利于工业使用。
四、酶的固定化方法
酶的固定化方法很多，但对任何酶都适用的方 法是没有的。酶的固定化方法通常按照用于结 合的化学反应的类型进行分类，大体可概括为 四种类型：
3.交联法
借助双功能试剂使酶分子间发生交联 作用,制成网状结构的固定化酶的方法 称为交联法。
常用的双功能试剂有：戊二醛、己二 胺等、顺丁烯二酸酐、双偶氮苯等。 其中应用最广泛的是戊二醛。
戊二醛有两个醛基，这两个醛基都可与酶或蛋 白质的游离氨基反应，形成席夫（Schiff）碱， 而使酶或菌体蛋白交联，制成固定化酶或固定 化菌体。
常用载体：硅胶、离子交换树脂。
酶及细胞固定化技术
酶及细胞固定化技术酶及细胞固定化技术是一种常见的生物技术方法，广泛应用于食品工业、医药工业、环境保护等领域。
通过这种技术，酶或细胞被固定在一种固体材料上，从而增强了它们的稳定性和重复使用性，提高了生产效率和产品质量。
本文将介绍酶及细胞固定化技术的原理、优势以及在不同领域的应用情况。
酶及细胞固定化技术的原理主要是通过将酶或细胞固定在一种固定载体上，使其能够稳定地存在于一定的环境中并保持其生物活性。
固定载体一般是多孔性的固体材料，如珠状树脂、活性炭、聚合物材料等。
在固定化过程中，酶或细胞通常会与载体表面发生物理或化学结合，从而实现固定化。
固定化后的酶或细胞能够在一定条件下发挥作用，实现对底物的转化或反应。
二、酶及细胞固定化技术的优势相较于游离态的酶或细胞，在固定化状态下具有以下优势：1.稳定性高：固定化后的酶或细胞能够更好地耐受环境变化，如温度、pH值等变化，从而提高其稳定性和长期使用的能力。
2.重复使用性强：固定化后的酶或细胞能够被多次使用，降低了成本，提高了生产效率。
3.易于分离：固定化后的酶或细胞与反应物之间的分离更加便利，便于后续操作和产品纯化。
4.改善环境适应性：固定化后的酶或细胞对不同环境条件的适应能力更强，可在复杂环境中发挥作用，适用范围更广。
5.抑制酶或细胞的不良反应：在固定化状态下，酶或细胞的不良反应如自身降解被抑制，更加稳定可靠。
酶及细胞固定化技术在食品工业中得到了广泛应用。
一些发酵产品的生产过程中，固定化酶或细胞能够提高发酵效率、缩短发酵周期，并且保证产品的稳定性和质量。
在乳制品工业中，利用固定化乳酸菌进行发酵能够保持产品的风味和质量，并且加速乳酸发酵的速度，提高了生产效率。
固定化酶还可以应用于酶解工艺，如利用固定化酶对淀粉、蛋白质等进行水解，得到高质量的发酵原料。
固定化技术还可以用于改善食品加工过程中的废水处理，通过固定化细胞去除废水中的有机物和重金属离子，净化废水，达到环保的目的。
酶工程
一. 何谓酶工程，试述其主要内容和任务。
酶的生产、改性与应用的技术过程称为酶工程。
酶工程的主要内容包括：微生物细胞发酵产酶，动植物细胞培养产酶，酶的提取与分离纯化，酶分子修饰，酶、细胞、原生质体固定化，酶非水相催化，酶定向进化，酶反应器和酶的应用。
酶工程的主要任务是经过预先设计，通过人工操作获得人们所需的酶，并通过各种方法使酶的催化特性得以改进，充分发挥其催化功能。
二. 蛋白类酶和核酸类酶的分类和命名有何异同？按照分子中起催化作用的主要组分的不同，酶可以分为蛋白类酶和核酸类酶两大类别。
它们的分类和命名总原则是相同的，都是根据酶作用的底物和催化反应的类型进行分类和命名。
两者分类与命名的显著区别是蛋白类酶只能催化其他分子进行反应，而核酸类酶既可以催化酶分子本身也可以催化其他分子进行反应。
三. 蛋白类酶的分类原则如下：1.按照酶催化作用的类型，将蛋白类酶分为六大类：第一大类，氧化还原酶；第二大类，转移酶；第三大类，水解酶；第四大类，裂合酶；第五大类，异构酶；第六大类，合成酶；2.每个大类中，按照酶作用的底物、化学键或基团的不同，分为若干亚类；3.每一亚类中再分为若干小类；4.每一小类中包含若干个具体的酶。
四. 核酸类酶采用以下分类原则：1.根据酶作用的底物是其本身RNA分子还是其他分子，将核酸类酶分为分子内催化R酶（自我剪切酶、自我剪接酶）和分子间R酶（RNA剪切酶、DNA剪切酶、多肽剪切酶、多糖剪切酶、氨基酸酯剪切酶、多功能酶）两大类；2.在每个大类中，根据酶的催化类型不同，将R酶分为若干亚类。
五. 酶活力单位：在特定条件下，每1min催化1μmol的底物转化为产物的酶量定义为1个酶活力单位，单位为UI。
六. 酶活力的测定方法：1.根据酶催化的专一性，选择适宜的底物，并配制一定浓度的底物溶液；2.根据酶的动力学性质，确定酶催化反应的温度、pH、底物浓度、激活剂浓度等反应条件；3.在一定条件下，将一定量的酶液和底物溶液混合均匀，适时记下反应开始的时间；4.反应到一定的时间，取出适量的反应液，运用各种生化检测技术，测定产物的生成量或底物的减少量七. 酶的生物合成有生长偶联型、中期合成型、延续合成型和非生长偶联型4种模式。
酶工程_06-酶的固定化
缺点
酶和细胞的固定化
Enzyme Engineering
酶的固定化
固定化方法
—— 共价结合法
载体活化和偶联反应：(1) 含氨基载体
酶和细胞的固定化
Enzyme Engineering
酶的固定化
固定化方法
—— 共价结合法
氨基、羧基、巯基、羟基
酶和细胞的固定化
Enzyme Engineering
酶的固定化
固定化方法
—— 共价结合法
共价结合过程（对照：酶的大分子修饰）
载体活化：载体上引入活泼基团
偶联：活化后的载体通过活泼基团与酶分子 中的特定基团连接
—— 避免活性中心的基团被偶联
共价结合的优点
共价结合牢固，酶很难脱落，可长时间使用
—— 交联法
酶分子之间的交联 酶与水不溶性载体的交联
酶和细胞的固定化
Enzyme Engineering
酶的固定化
固定化方法
—— 交联法
酶分子间的戊二醛交联：氨基的交联反应
交联时的 pH 值一般与酶的等电点 pI 相同
酶和细胞的固定化
Enzyme Engineering
酶的固定化
天然凝胶
天然多糖及其衍生物
特点：条件温和，操作简便，对酶活影响小，强度较差 合成聚合物材料，如聚丙烯酰胺 特点：强度高，对环境的耐受性好，但要依靠聚合反应进行 包埋，酶活有一定损失 不适用于底物或产物分子很大的酶的固定化
合成凝胶
酶的固定化
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吸附法 包埋法 共价结合法通过载体表面 和酶分子表面间的次级键相 互作用而达到固定目的的方 法. 只需将酶液与具有活泼 表面的吸附剂接触,再经洗 涤除去未吸附的酶便能制得 固定化酶.是最简单的固定 化技术,在经济上也最具有 吸引力.
常用的固体吸附剂有活性炭,氧化铝, 活性炭,氧化铝, 活性炭 硅藻土,多孔陶瓷,多孔玻璃,硅胶, 硅藻土,多孔陶瓷,多孔玻璃,硅胶,羟 基磷灰石等. 基磷灰石 操作简便,条件温和,不会引起酶变性 失活,载体廉价易得,而且可反复使用 由于靠物理吸附作用,结合力较弱 结合力较弱,酶 结合力较弱 与载体结合不牢固而容易脱落,所以使用 受到一定的限制.
离子交换剂的吸附容量一般大于物理吸附剂. 世界第一例获得工业应用的固定化酶是 DEAE-Sephadex A-25吸附的氨 基酰化酶反应用于 DL-AA的光学分析.
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2,包埋法(Entrapment) 包埋法(Entrapment)
包埋法是将游离酶包埋于格子或微胶囊内 包埋法是将游离酶包埋于格子或微胶囊内,格子的结构 格子 可以防止酶渗出到周围的培养基中, 可以防止酶渗出到周围的培养基中,而底物分子仍能渗 入格子内与酶接触. 入格子内与酶接触. 包埋类型可有:网格型,微囊型及脂质体液膜型. 包埋类型可有:网格型,微囊型及脂质体液膜型.
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根据吸附剂的特点又分为两种: 根据吸附剂的特点又分为两种:
物理吸附法是通过氢键,疏水键等作用力将酶吸附于不溶性载
体的方法. 常用的载体有:高岭土,皂土,硅胶,氧化铝,磷酸钙 胶,微空玻璃等无机吸附剂,纤维素,胶原以及火棉胶等 有机吸附剂. 离子结合法是指在适宜的pH和离子强度条件下,利用酶的侧链 解离基团和离子交换基间的相互作用而达到酶固定化的方法 (离子键). 最常用的交换剂有CM-纤维素,DEAE-纤维素,DEAE葡聚糖凝胶等;其他离子交换剂还有各种合成的树脂如 Amberlite XE-97,Dowe X-50等.