第二章 酶学基础1
2酶工程酶学基础
第 6 大类，合成酶(Synthetases) 或称连接酶(Ligases)
合成酶 是伴随着ATP等核苷三磷酸的水解，催化两个分子进行连 接反应的酶。其反应通式为： A + B + ATP ＝ AB + ADP + Pi （或 A + B + ATP ＝ AB +AMP +PPi） 该大类酶的系统命名是在两个底物的名称后面加上“连接酶”。 如 谷氨酸：氨连接酶，其催化反应式为： L-谷氨酸 + 氨 + ATP == L-谷氨酰胺 + ADP +Pi。 推荐名则是在合成产物名称之后加上“合成酶”。如，天门冬酰 胺合成酶，其催化反应式为： L-天门冬氨酸 + 氨 +ATP == L-天门冬酰胺 + AMP +PPi。
2）相对专一性
1）绝对专一性
一种酶只能催化一种底物进行一种反应，这种高度的专一性称为绝对专一性。当酶作用的底 物含有不对称碳原子时，酶只能作用于异构体的一种。这种绝对专一性称为立体异构专一性。 例如，乳酸脱氢酶 [ EC 1.1.1.27 ] 催化L－乳酸脱氢反应生成丙酮酸： CH3 CH3 | 乳酸脱氢酶 | C＝O =============== H－C－OH | | COOH NADH NAD COOH 丙酮酸 L－乳酸
第一章
酶学基础
第一节 酶的结构和性质
一、 酶的命名和分类
1. 习惯命名 1) 依据底物来命名：蛋白酶、淀粉酶
有时加上酶的来源，如 胃蛋白酶，胰蛋白酶。
2) 依据催化反应的性质命名： 水解酶、转氨酶、氧化酶、脱羧酶
3) 结合上述两个原则命名：丙酮酸脱羧酶
2. 国际系统命名
第二章基因工程酶学
I 型限制性内切酶 II 型限制性内切酶
III型限制性内切酶
6/98
1. I型限制性内切酶
首先由M. Meselson和W. Arber在1968年 从大肠杆菌 K株和 B株分离的。
如 EcoK和 EcoB。 （1）识别位点序列
未甲基化修饰的特异序列。
EcoB： TGA(N)8TGCT EcoK：AAC(N)6GTGC
Xma I Sma I
5’-CCCGGG -3’ 3’-GGGCCC-5’ 5’-CCCGGG-3’ 3’-GGGCCC-5’
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（6）同尾酶(Isocaudamers）
即能切割产生相同末端（一般指粘性末端）的 限制性内切酶。如：
BamH I 5’-GGATCC-3’ 3’-CCTAGG-5’
指来源于不同物种但能识别相同DNA序 列的限制性内切酶。
① 完全同裂酶：
识别位点和切点完全相同。 如Hind Ⅲ 和Hsu I。 Hind Ⅲ Hsu I
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5’-AAGCTT-3’ 3’-TTCGAA-5’ 5’-AAGCTT-3’ 3’-TTCGAA-5’
② 不完全同裂酶：
识别位点相同，但切点不同。 如Xma I 和 Sma I。
（8）Ⅱs型限制性内切酶 移动切割（shifted cleavage):
在离它的不对称识别位点一侧的特定 距离处（<20 bp）切割DNA双链。 Hga I
5’ GACGCNNNNN 3’ CTGCGNNNNNNNNNN
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3. III类限制性内切酶
在完全肯定的位点(距寄主特异性识别位点 3‘端24~26bp处)切割DNA；反应需要ATP、 Mg2+和SAM（S-腺苷蛋氨酸）。
Chapter 2 酶 section1
3.酶与底物结合形成中间络 合物的方式（理论）
(1)锁钥假说(lock and key hypothesis)： 认为整个酶分子的天然构象 是具有刚性结构的，酶表面 具有特定的形状。酶与底物 的结合如同一把钥匙对一把 锁一样
(2)诱导契合假说（induced–fit hypothesis): 该学说认为酶表面并没有一 种与底物互补的固定形状， 而只是由于底物的诱导才形 成了互补形状.
OH
CH2 CH2 NH2 OH
亲核性基团
酸碱性基团
(3)酶原和酶原的激活： （P421） 酶原：没有活性的酶的前体。 酶原的激活：酶原在一定条件下经适当的物质作用可转变 成有活性的酶。酶原转变成酶的过程称为酶原的激活。 本质：酶原的激活实质上是酶活性部位形成或暴露的不可 逆过程。 如：胰凝乳蛋白酶原的激活 P421－422
mRNA
–
多肽 亚基
点样线
M4 M3H M2H2
MH3
四聚体 H4
+
三、酶的命名及分类
1. 酶的命名 (1)习惯命名法: 1. 根据其催化底物来命名：如淀粉酶； 2. 根据所催化反应的性质来命名：如水解酶； 3. 结合上述两个原则来命名：如琥珀酸脱氢酶； 4. 有时在这些命名基础上加上酶的来源或其它 特点：如胃蛋白酶。
(2)必须基团( 表10－1)：酶表现催化活性不可缺少的基团。 原因：①底物主要靠氢键、盐键、范德华力、疏水作用与E作用；②反应涉 及电子或/和质子的转移；③以AA的R基或辅酶为媒介。
亲核性基团：丝氨酸的羟基，半胱氨酸的巯基和组氨酸的咪唑基。 酸碱性基团：天冬氨酸和谷氨酸的羧基，赖氨酸的氨基，酪氨酸的酚羟 基，组氨酸的咪唑基和半胱氨酸的巯基等。
(整理)第二章酶
第二章酶第一节酶的一般概念一. 酶的概念：酶是由生物活细胞产生的，具有高度专一性和极高催化效率的生物催化剂。
◆在生物体内，存在着很多酶：如胃蛋白酶、丙酮酸脱氢酶、己糖激酶等等。
◆对整个新陈代谢的协调、调节，都是通过酶的调节进行的，一旦酶的调控失调，代谢就会紊乱，引起疾病或死亡。
如：有机磷农药的中毒、KCN、CO等的中毒。
二. 酶的化学本质1926年, Sumner从刀豆分离到脲酶结晶,并证明酶是蛋白质,证据：1．由氨基酸通过肽键连接而成2．具有一、二、三、四级结构3．有两性电解质的性质：阴、两性、阳离子形式4．受物理、化学等因素影响而变性失活5．水溶液具有胶体性质6．能被蛋白酶水解，氨基酸顺序已搞清楚，可人工合成•酶非蛋白质证据80年代,Cech和Altman发现L19RNA具有多种酶的催化功能，这说明有催化作用的生物催化剂不一定是蛋白质。
将这类具有催化作用的RNA称为ribozyme（核酶）三.酶的催化特性（一）酶具有很高的催化效率•比一般化学催化剂高107～1013倍,比非催化反应高108～1020倍。
(二)酶具有高度的专一性(specificity)专一性(specificity)——酶只作用于一类化合物或一定的化学键，催化一定类型的化学反应，并生成一定的产物。
底物(S)——通常把酶作用的反应物称为底物（substrat）。
1．绝对专一性(absolute ～)：只能催化一种底物发生一定类型的反应。
如脲酶2．相对专一性(relative ～)：酶能作用于一类底物或一种化学键, 又分键专一(作用于共价键)和基团专一(对基团有选择)。
1）如脂肪酶（键专一）：2）蛋白酶（基团专一）：3．立体专一性立体专一性（stereochemical ～）——作用于底物立体异构体中的一种。
（三）反应条件温和常温（体温）、常压（1个大气压）、pH值近中性。
（四）酶易变性失活高温、强酸碱等条件下容易变性失活（五）体内的酶活性是受调控通过激素、激活剂和抑制剂对酶活性进行调节。
酶 第二章
（4）滞后合成型（非生长偶联型）
特点 酶在细胞生长一段时间或者进入平衡期以后 才开始其生物合成并大量积累。
种类 许多水解酶 受到培养基中存在的阻遏物的阻遏作用mRNA稳定性好 该酶的合成可以转为延续合成型。
（4）滞后合成型（非生长偶联型）
举例
密码(codon)与反密码(anticodon)的碱基配对
（4）核糖体，ribosome
• 核糖体（或称核糖核蛋白体）由蛋白质和 rRNA组成。是存在于细胞质内的微小颗粒。
Ribosome composition of Prokaryotic and eukaryotic cell
3、蛋白质的合成(翻译) -Translation
Replication 复制：亲代DNA或RNA在一系列酶的
作用下，生成与亲代相同的子代DNA或RNA的过程。
Transcription 转录：以DNA为模板，按照碱基配
对原则将其所含的遗传信息传给RNA，形成一条与DN A链互补的RNA的过程。
Translation 翻译：亦叫转译，以mRNA为模板，
（1）mRNA(模板，template)
• mRNA是带有DNA遗传信息指导蛋白质合成 的直接模板。 • 以mRNA为模板,合成一定结构的多肽链的过 程(翻译)，就是将mRNA分子中的核苷酸排列 顺序转变成蛋白质分子中的氨基酸排列顺序。
（2）遗传密码 nucleotide triplet cod on
2、RNA的生物合成(转录) - Transcriptio n
转录过程的特点
（1）转录的不对称性 ——在RNA的合成中，DNA的二条 链中仅有一条链可作为转录的模板，称为 转录的不对称性。 （2）转录所需酶 ——依赖DNA的RNA聚合酶
酶学原理笔记
第一章绪论酶是生物细胞产生的、具有催化能力的生物催化剂。
定义：酶是生物体内进行新陈代谢不可缺少的受多种因素调节控制的具有催化能力的生物催化剂。
酶的重要两大类：主要由蛋白质组成——蛋白类酶（P酶）主要由核糖核酸组成——核酸类酶（R酶）酶与其他化学催化剂的区别、特点：（1）酶的催化高效性通常要高出非生物催化剂催化活性的106~1013倍（2）高度专一性（3）温和的作用条件常温常压和温和的酸碱度条件（4）容易控制酶的反应（5）酶的来源广泛第二章酶学基础酶的活性中心：是它结合底物和将底物转化为产物的区域，通常是整个酶分子相当小的部分，它是由在线性多肽中可能相隔很远的氨基酸残基形成的三维实体。
必需基团：活性中心的一些化学基团为酶发挥作用所必需活性中心外的必需基团－－结构残基；非贡献残基（非必需残基）：是除了酶的必须基团之外，酶蛋白的其余部分中的氨基酸残基。
8种频率最高的氨基酸残基：丝氨酸、组氨酸、胱氨酸、酪氨酸、色氨酸、天冬氨酸、谷氨酸和赖氨酸。
酶的结构;1、酶的一级结构：是催化基础，是把蛋白质肽链中氨基酸的排列顺序。
二硫键的断裂将使酶变性而丧失其催化能力。
2、酶的二级结构：是肽链主链不同肽段通过自身的相互作用，形成氢键，延一条主轴盘旋折叠而形成的局部空间结构。
3、酶的三级结构：是多肽在二级结构基础上，通过侧链基团的相互作用进一步卷曲折叠，形成的特定构象。
4、酶的四级结构：是指由不同或相同的亚基按照一定排布方式聚合而成的蛋白质结构。
具有四级结构的酶按其功能分，一类与催化作用有关，另一类与代谢调节关系密切。
（亚基虽然具有三级结构，但单独存在时通常没有生物学活性或活性低，只有缔合形成特定的四级结构时才具有生理功能。
）活性中心空间构象的维持则依赖于酶蛋白的二、三级结构的完整性。
酶分子的结构域：是指蛋白质肽链中一段独立的具有完整、致密的立体结构区域，一般由40—400个氨基酸残基组成。
酶的催化原理：（中间产物理论）在酶浓度固定的条件下，要达到最大初速率必须增加底物浓度，这是大多数酶的特征。
第2章酶反应的基本原理
用量少，催化效率高 不改变反应平衡点 可降低反应活化能
（2）酶的特性
高效性：以酶的转换数Kcat表示，mol底 物/mol酶.min 酶的Kcat为103-107 mol底物/mol酶.min， 比非酶催化效率高107-1013 倍。
专一性：结构专一性（相对专一性/绝对专一 性）
立体异构专一性(几何异构/旋光异构)
中间产物存在的证据：
(1) 同位素32P标记底物法（磷酸化酶与葡萄糖结合）；
(2) 吸收光谱法（过氧化物酶与过氧化氢结合）。
2、诱导契合假说（induced-fit hypothesis）
S
E-S复合物
S
ab E
c
a E
b
c
酶与底物相互接近时，其结构相互诱导、相互变形和相互适 应，进而相互结合。
3、趋近效应与定向作用（ proximity effect & orientation
酶活性中心
结合部位:决定酶的专一性 催化部位:决定酶所催化反应 的性质。
酶活性中心示意图
部分酶活性中心的氨基酸残基
酶
牛胰核糖核酸酶
溶菌酶 牛胰凝乳蛋白酶 牛胰蛋白酶 木瓜蛋白酶 弹性蛋白酶 枯草杆菌蛋白酶 碳酸酐酶
残基总数
活性中心残基
124
129 245 238 212 240 275 258
His12, His119, Lys41
酶 （简单蛋白质）
酶蛋白
酶等。
双成份酶 （apoenzyme）
（结合蛋白质） 辅因子
辅酶 （coenzyme)
（cofacter) 辅基(prosthetic group)
4、酶的结构层次
一级结构 二级结构
第二章酶催化的基础知识
4.氨基酸的空间分布
表面氨基酸—多为亲水性氨基酸； 活性中心——多为疏水性氨基酸
活性部位位于凹陷处
5.酶分子的柔顺性
构象1 构象2 构象1
二、酶的组成
仅由氨基酸组成，没有辅助因子
单成份酶：脲酶、蛋白酶、淀粉酶、核糖核酸酶等。 （简单蛋白质） 除了在其组成中含有由氨基酸组成 酶 酶蛋白 （apoenzyme） 双成份酶 辅酶（coenzyme) （结合蛋白质） 辅因子 （cofacter) 辅基(prosthetic group) 小分子有机物
2. 诱导契合学说
酶与底物结合时相互诱导发生构象改变
诱导契合学说
• 该学说认为酶表面并没有一种与底物互 补的固定形状，而只是由于底物的诱导 才形成了互补形状.
Arg145胍基 Tyr248-OH Glu270- COO-
底物
羧 肽 酶 的 诱 导 契 合 模 式
第四节 酶活力测定
• 酶的活性 是指酶催化化学反应的能力， 其衡量标准是酶促反应速度的大小。
催化效率高的本质： 活化能大大降低
E1
能 量 水 平
ES
E2
E+S
G
E-酶 S-底物 P-产物 ES-酶与底物的复合物
P+ E
反应过程
能 量 结合能 非催化反应活化能
一般催化剂催 化反应的活化能 酶促反应 活化能
底物
反应总能量改变
产物 反 应 过 程
酶促反应活化能的改变
ES
中间产物学说
S P
国际命名的特点 （1）表达准确，科学 而严谨。 （2）太繁，使用起来 不太方便。
三 核酸酶的命名
• 核酸酶是唯一的非蛋白酶。它是一类特 殊的RNA，能够催化RNA分子中的磷酸酯 键的水解及其逆反应。
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1）含Ⅰ型IVS的R酶
与四膜虫rRNA前体的间隔序列IVS结构类似，在 催化rRNA前体的自我剪接时，需要鸟苷（5'-鸟 苷酸）和Mg2+。
2）含Ⅱ型IVS的R酶
与细胞核mRNA前体的IVS相似，在催化mRNA 前体的自我剪接时，需要Mg2+，不需要鸟苷、5'鸟苷酸。
2、考虑动力学因素的影响
pH、温度、离子强度、效应物浓度、E浓度、底物浓度 （1） 确定最适反应条件，温度，pH值； （2）在一定条件下，将一定量的酶液与底物溶液混合均匀，
记下反应开始时间； （3）反应到一定的时间，取出适量的反应液运用各种生化
检测技术，测定产物的生产量或底物的减少量。
具体方法：
A．终点法 是使酶促反应进行一定时间后，终止其反应， 再用化学或物理方法测定产物或底物变化的量。
通常测定在一定时间内最适于酶的条件下酶 促反应产物的生成量。如蛋白酶的活力，可据酶 催化酪蛋白水解生成的酪氨酸与酚试剂作用的蓝 色反应，再用比色法测定之。
2. 测定完成一定量反应所需的时间
测定酶所催化的一定量底物的减少或一定量 产物的生成所需的时间，酶活力与之成反比。
测定步骤：
1、根据酶催化的专一性 根据酶的专一性，选择适宜的底物，并配制成一 定浓度的底物溶液
E 去磷酸作用 CpCpCpCpCpCp === CpCpCpCpCpC + Pi
2 作用于DNA的R－酶 3 作用于多糖的R－酶 4 作用于氨基酸酯的R－酶
第二节 酶活力的测定方法
一、酶活力测定一般原则 酶活力 反应速度
二、初速度 initial velocity
三、测定物质的选择
1. 测定一定时间内的化学反应的量
四、酶活力单位
（一）酶活力单位定义 一个酶活力单位(Active Unit) 定义：在特定条 件下，一分钟内催化1 mol底物反应所需的 酶量。
（二）比活力 Specific activity 比活力定义：每毫克酶蛋白所含酶活力单位数
五、转换数 Turnover number，T.N.值
与催化周期
B．动力学法 是连续测定酶反应过程中底物、产物或辅酶的 变化量，可以直接测定酶促反应的初速度。
终止反应的方法：
A 沸水浴 B 加入适宜的酶变性剂，如：三氯乙酸 C 迅速远离反应最适 pH 值 D 冰浴
测定反应液中物质的变化量：
可采用光学检测法（分光光度法），化学检测法（化 学滴定法）,华勃氏呼吸仪等生化检测技术。
亚类. 每一大类根据底物中被作用的基团或键的特 点分为若干亚类，依次序1、2、3……编号
次亚类.每一亚类根据被作用的键的特点分为若干 次亚类，依次序1、2、3…编号
具体种酶. 在同一次亚类中，不同的具体种的酶也 用1、2、3…编号，把它们区分开，表示酶在该次 亚类中的排号
分类编号：四个数字, 用‘ ’隔开, 冠以EC (Enzyme Commission)
A 具有RNA剪接作用 2CpCpCpCpC === CpCpCpCpCpCp + CpCpCpC
B 具有末端剪切作用 CpCpCpCpC === CpCpCpC + Cp
C 限制性内切酶作用 --CpUpCpUpGpN === --CpUpCpUp + GpN
D 转磷酸作用 CpCpCpCpCpCp + UpCpU === CpCpCpCpCpC + UpCpUp
（二）分子间催化的R-酶
1、作用于其它RNA分子的R-酶 1） RNA剪切酶：催化于其它RNA分子进行剪切反
应的R-酶。 1983年S. Altman发现： 核糖核酸酶P（RNAase P）的M1RNA组分具有该酶 的催化特性： 催化tRNA前体剪切除去RNA片断，形成成熟的 tRNA。该酶的蛋白质部分无催化活性。
酶分子上的 氨基酸残基
结合基团
非必需基团（非贡献残基） 接触残基
活性中心
分子活力、克分子活力 转换数(Kcat) 定义：1个酶分子在最适条件下，1分钟转化底物
的分子数，即指每mol酶每分钟催化S转 变为P的mol。 催化周期 转换数的倒数，指酶进行一次催化所需的时间， 单位为（ms）T＝1/ Kcat
第三节 酶的结构与功能
一、活性部位
活性中心（active site） 指酶分子中直接和底物结合，并和酶 催化作用直接有关的部位。
如: EC 3.1.3.1代表
第三大类酶----水解酶类 第三大类中的第一亚类
作用于酯键的酶 该亚类中的第三亚类
磷酸单酯 该次亚类中的第一号酶
即:碱性磷酸酶
二、核酸类酶的分类
根据催化反应的类别分为三类： 1、剪切酶 2、剪接酶 3、多功能酶 根据催化反应的底物分为两类： 1、自我催化，即分子内催化 2、分子间催化
2）多功能的R－酶
指能够催化其他RNA分子多种反应的核酸类酶。
四膜虫（Tetrahynena）细胞26S rRNA前体的 IVS（间隔序列，414个核苷酸） 两次环化得 到较小的环状分子，开环得到5'-末端失去19个核 苷酸的线状IVS，即L-19IVS（395nt） 具有多种催化功能，可催化其它RNA分子间发生 多种反应。 功能多样化：第二 Nhomakorabea 酶学基础
第一节 酶的分类
按照酶的化学组成，酶有两大类别： 蛋白类酶（P酶）：主要由蛋白质组成 核酸类酶（R酶）：主要由核糖核酸组成
一、蛋白类酶的分类
六大类酶： 按酶促反应性质将生物体所有的酶分为六大类，分别用
1、2、3、4、5、6 编号 1. 氧化还原酶类:Oxido-reductases 2. 转移酶类:Transferases 3. 水解酶类:Hydrolases 4. 裂合酶类:Lyases 5. 异构酶类:Isomerases 6. 合成酶类:Ligases
（一）分子内催化的R-酶
指催化本身RNA分子进行反应的一类核酸类酶，均为
RNA前体。
根据催化反应类型分为：
1.自我剪切酶：指催化本身RNA进行剪切反应的R-酶。
RNA前体
成熟RNA分子 ＋ 另一个RNA片断
如：T4噬菌体RNA前体（215 nt） （139 nt）＋ 76 nt片断
成熟RNA
2. 自我剪接酶