大肠杆菌高密度发醇研究

动物科学与动物医学　２００１年１月第ｌ８卷第１期（总第７３期）　２７　个体很大，仍有部分难产现象。产羔６１只，其中活羔　５９只，产羔率９６．８２　，活羔占９６．７２　羔羊平均出　生重４．３６　ｋｇ。　

寰２超蠡摊卵检胚莓果统计寰　供悻羊编号　Ａ　Ｂ　Ｃ　束受精　合计　

３讨论与分析　本次研究超排供体波尔山羊获卵枚数，胚胎可用　率及其移植成功率，均达到目前国内较好水平，具有　很大推广应用价值　每只受体母羊移植一枚胚胎，是出于准备受体羊　较多和考虑到以后若因事故流产只损失一枚胚胎。在　以后推广应用过程中应根据羊的繁殖生理性能适当　增加移植胚胎枚数。　供体波尔山羊在冲胚后经使用ＰＧ催情，均陆续　发情配种，未影响其正常繁殖　为了使波尔山羊迅速　繁殖扩群，可考虑每年２扶超排移植。　在受体羊选择过程中，虽经挑选，但由于羔羊出　生重过大，难产现象很多。建议各地在开展胚胎移植　和杂交改良过程中对受体或母本品种和个体应慎重　考虑。　（收稿日期：２０００—１１—３０）　

大肠杆菌高密度发酵研究　刘文波，柴同杰　（山东农业大学动物科技学院，山东泰安２７１０１８）　

摘要：高密度发酵走现代发酵工程的一项新技术，拒显著提高太脯杆茵茵俸和基因工程产品的产量。　我们就影响大脑杆茵高密度发酵的玛素置其拉制、发酵方式的选择和发酵蚌点判断置异常发酵趾理进　行７蔫要计话，井时太脯杆茸的高密度发酵进行了展望　美■词：太两杆茸ｆ高密度发酵ｆ溶氧采度　中圈分羹号；ＴＱ９２０．１　文■标识码：Ｂ　文章编号：１　００８　９３８１（２００１）０１　００２７－－０３　致病性大肠杆菌是畜禽最常见的病原菌之一，可　１　高密度发酵的影响因素和控制　引起畜禽的严重腹酱、家禽的败血症及卵黄性腹膜炎　１．１　培养基　等一系列疾病，是影响畜禽业的一个重要因素　对该　高密度发酵的生物量达１５０～２００　ｇ／Ｌ，为满足　病多以疫苗预防为主，效果也较好。但目前大肠杆菌　细菌快速生长及大量表达基因产物的需要，常需投人　的生产多用普通琼脂或营养内汤进行培养，抗原产量　２～５倍于生物量的基质，加上利用率，实际量远高于　低且生产成本高，难以大批量生产　而用一般发酵工　此值。大肠杆菌高密度发酵使用的培养基多为半合成　艺生产，发酵液中的菌体浓度仍较低。难以获得理想　培养基，其各组分的浓度和比例对发酵影响很大。如　效果。近几年，人们又对高密度发酵进行了研究并取　硪源和氮源比例偏小，会导致菌体生长旺盛，造成菌　得了较大进展。实现高密度、高产率和高浓度培养是　体提前衰老白溶；而其比例偏大．则菌体繁殖数量少，　当前发酵工业的目标和方向　对于大肠杆菌，尤其　细菌代谢不平衡，不利于产物积累　由于优化碳源是　是重组大肠杆菌，实现高密度发酵不仅可相应减少反　太肠杆菌发酵的关键因素，人们就碳源对高密度发酵　应物体积，降低生物量的分离费用，还可缩短生产周　的影响傲了大量研究。葡萄糖是目前最常用的碳源物　期、减少设备投资，从而达到降低成本，提高生产效率　质。通过对重组大肠杆菌生产谷胱甘肽（ＧＳＨ）发酵　的目的。　条件的研究表明；初糖浓度为１０　ｇ／Ｌ时，重组大肠杆　

ｎ　０如　¨ｎ　ｍ　ｎ　１　１　２　１　１　１　３　５　５　２　５　７　２　７　５　３　ｎ　１　４　８　５　１　６　４　５　３蚰２　７　。。。　。　。如ｎ　¨Ｈ耕　维普资讯 http://www.cqvip.com Ａｎｉｍａｌ　Ｓｃｉｅｎｃｅ＆Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ　Ｍｅｄｉｃｉｎｅ　ＶｏＩ　１８　Ｎｏ．１（Ｔｏｔａｌ　Ｎｏ．７３）　菌ＷＳＨ—ＫＥ发酵２４　ｈ，细胞干重达最大，细胞内　ＧＳＨ含量也高于其它糖浓度　。对高密度发酵大肠　杆菌生产重组人骨形成蛋白一２Ａ的研究也表明；基质　中初糖浓度为１０　ｇ／Ｌ时细胞浓度和产物表达量均获　得了较好的效果　。上述研究表明：当培养基中糖初　始浓度为１０　ｇ／Ｌ时，可获得理想的发酵效果。如果培　养基中糖浓度过高，超过菌体生长需要量，则会导致　乙酸生成。糖浓度超过５０　ｇ／ｌ　时大肠杆菌的生长将　受到抑制　］　以甘油代替葡萄糖作为碳源则可减少代　谢剐产物——乙酸的积累，而且更易达到重组菌的高　密度和外源蛋白的表达　］。　除碳源外，培养基中的氮源、微量元素和各种无　机盐含量对大肠杆菌发酵也有较大影响。一般而言．　大肠杆菌培养时营养的抑制浓度为：葡萄糖（５０　ｇ／　Ｌ）、氮（３　ｇ／Ｌ）、Ｆｅ“（１．１５　ｇ／Ｌ）、Ｍｇ　（８．７　ｇ／Ｌ）、　ＰＯ　”。（１０　ｇ／Ｌ）、Ｚｎ”（Ｏ．０３８　ｇ／Ｌ）　－。此外．致病性大　肠杆菌和基因工程大肠杆菌发酵所需营养条件也不　完全一样。　１．２接种量　接种量是指移人的种子液和培养液体积的比例。　它的大小决定了菌种在发酵罐中的生长速度。采用大　接种量，由于种子液中含有大量体外水解酶类，有利　于对基质的利用，缩短生长延迟期，并使生产菌迅速　占领整个培养环境。但过高的接种量也会使菌体生长　过快，消耗大量营养物质，反而影响后期的生长。在一　定范围内增加接种量有利于菌体的生长（１　、２　、　５　接种量分别为１Ｏ　的９５．４　、９６．６　和９８　）【６一。　因此，接种时应根据实际情况确定接种量。一般多采　用４　～５　。　１．３生长押制性物质　大肠杆菌在发酵过程中，会产生一些有害代谢产　物。如有机酸、ＣＯ　等。这些物质的积累可抑制细菌生　长的外源蛋白的表达。此外，由于供氧不足，比生长率　过大或碳源供给量高于大肠杆菌所能同化速度，也会　产生乙酸等代谢产物，对菌体生长产生抑制。再就是　ＣＯ。的影响也不容忽视。若发酵液中的ＣＯ　超过一　定浓度，也能抑制菌体生长，而且还会降低发酵液的　ｐＨ值。　为降低培养过程中代谢剐产物浓度，可通过调整　培养基组成，特别是碳源含量来防止乙酸产生。另外，　在维持高溶氧的同时，采用流加措施。以初糖浓度１０　ｇ／Ｌ、１２　ｈ补加１０　ｇ／Ｌ的补糖方式，使得ＧＳＨ的总　量比不补糖提高了５倍　。在培养基中加人某些氨基　酸（甘氨酸、甲硫氨酸），减轻了乙酸的抑制作用，提高　了菌体的生长速度和重组蛋白的产率　］　１．４溶氧浓度　溶氧浓度是影响高密度发酵的一个重要参数。大　肠杆菌菌群在扩增过程中，需大量氧气参与代谢．因　而，饱和氧的供给很重要。溶氧浓度过高或过低，都会　影响菌体的生长和产物的生成。特别是在发酵后期，　由于菌体密度的急副扩增，耗氧量极大，发酵罐的各　项物理参数均不能满足对氧的供给，使菌体生长变得　极为缓慢，外源蛋白表达水平也很差。所以维持较高　水平的溶氧浓度，不但有利于菌体生长，还有利于外　源蛋白产物的生成。　要使发酵过程中保持适宜溶氧浓度．必需确定发　酵罐的通气量和搅拌速度。在一定范围内，通气量越　大，溶氧浓度越高。但不能单纯依靠提高通气量来获　得充足氧气。如果气流速度过大，再提高通气量，会使　发酵液产生大量气泡，使罐的有效利用率降低。最近　已开发了多种提高供氧的方法，如通过提高发酵罐的　压力来提高氧分压，ＩＣＩ公司的压力循环罐已实验成　功　］。另外，在发酵液中添加Ｈ。Ｏ。，在细胞过氧化酶　的作用下．也可释放出氧气，供茵体利用。　１．５温度　培养温度对细菌的生长发育具有很大影响。若培　养温度适宜，则会明显促进细菌生长。随着温度的升　高，细菌代谢加快．但其生长过程中的代谢副产物也　会随着增加，它们会对菌体生长产生一定抑制作用　此外，温度还通过改变发酵液的物理性质间接影响细　菌的生长。　对于一般细菌的发酵温度，在其最适培养温度范　围内是比较合适的　而对于基因工程菌，在不同发酵　阶段，其最适温度要综台考虑。在发酵初期，当其目的　产物还未表达时，就应优先促进菌体生长。到了目的　产物表达分泌期，菌体也已长到一定浓度，此时，就应　将目的产物表达的最适温度放在首位　１．６　ｐＨ值　细菌的生长发育及各种能量代谢都要受其环境　ｐＨ值影响。特别是在发酵过程中，ｐＨ值的改变会直　接影响菌体的产量和目的产物的表达　因此，一定要　充分考虑细菌的最适ｐＨ值范围，并在发酵过程中保　持一定的ｐＨ值。但在发酵过程中，由于大肠杆菌可　利用葡萄糖产酸产气，特别是产生大量乙酸和ｃＯ　，　从而使ｐＨ降低。因此，在产生发酵过程中，必须及时　调节ｐＨ值，以避免ｐＨ值激烈变化对细菌生长代谢　

维普资讯 http://www.cqvip.com 动物科学与动物医学　２００１年１月第１８卷第１期（总第７３期）　２９　和目的产物表达的不利影响。　１．７其它因素　对于重组大肠杆菌，要达到重组产物的最大产　率，还要考虑合适的诱导时间和诱导强度　一般在对　数生长中期进行升温诱导表达　在利用温度诱导型的　重组质粒生成ＢＭＰ一２Ａ时，细菌对教中期诱导比后　期诱导产率提高３２　ｎ］。另外，在生产中，由于发酵　液中含大量蛋白质、多糖等物质　因此，搅拌时会产生　大量气泡。如果泡沫持续过久，除了会降低发酵罐的　有效容积外，还会防碍菌体呼吸，造成代谢异常而使　菌体早期白溶。对此，在生产中，要适当减轻搅拌剧烈　程度，同时少加或缓加一些易起泡原料；要用天然油　脂和台成消沫剂等消除已生成的泡沫。　２发酵方式选择　补料分批发酵是近几年兴起的一项新技术，已被　广泛地应用于各种微生物的高密度发酵。它是指在微　生物分批发酵中以某种方式连续补加一定物料的培　养技术，主要包括非反馈补料和反馈补料两种类型。　前者包括恒速补料、变速补料和指数补料三种方法；　后者包括恒ｐＨ值法、恒溶氧法　菌体浓度反馈法、　ＣＥＲ法和ＤＯ　ｓｔａｔ法　由于流加方式的不同，它们对　菌体生长及外源蛋白表达的影响也不同。因指数流加　法比较简单，不需复杂设备，采用这一方法培养大肠　杆菌可将细胞比生长率控翩在不产生副产物（如乙　酸）范围之内，所以颇受重视。该技术已广泛用于重组　大肠杆菌高密度培养生产外源蛋白　另外，它还可作　为独特动力学研究手段代替连续培养来考查培养过　程中的重要动力学参数特性。研究发现指数流加不仅　在提高菌体密度、生产强度和产物表达总量方面有显　著的优势，而且实际过程的比生产速率平均值与设定　值非常接近口］。　３发酵终点判断爰异常发酵处理　３．１发酵终点判断　发酵终点的判断对提高菌体和外源蛋白的产量　及质量，以及缩短生产周期是很重要的　发酵初期，菌　体数量增加较快。但到了后期，大部分细菌已停止生　长，甚至死亡　此时，若继续发酵，则既浪费时间和财　力，又影响产物质量。溶氧规律性变化反映了大肠杆　菌生长的规律，因此将溶氧作为终止发酵的信号。在　发酵初期，由于菌体密度急剧增加，耗氧量较大，溶氧　曲线迅速下降，在对数生长期降到最低；随后进入细　菌生长的稳定期，曲线趋于平稳；到达衰老期后，细菌　生长基本停止，氧气捎耗量又下降，表现为溶氧曲线　略有上升趋于平稳，这时可终止发酵　。　３．２异常发酵处理　３．２．１发酵液转稀发酵尚未进入放罐阶段发酵液　异常地变稀。其产生原因，除了噬苗体侵袭以外，往往　还由其它一些未知因素造成。首先表现在粘度降低，　继而泡沫上升，消沫油的效果减弱　通常在刷开始变　稀时，及时补充适当的氨源可促使新菌体繁殖，使发　酵恢复正常。有些品种，补入碳源也可以防止变稀。由　于氮源或碳源可改变发酵液的表面张力，泡沫上升的　情况也有所改善。　３．２．２发酵液过浓　发酵液过浓是发酵液中氨源过　多，造成菌体浓度大大增加，降低了发酵液中的溶氧　浓度，影响发酵的正常进行。对此，可补人大量的水，　除了使菌体浓度稍加稀释外，还可降低发酵液粘度，　从而改善发酵条件。补水量不少于发酵液体积的　５　，才能显示效果，一般控制在１０　左右　３．２．３糖耗缓慢糖耗缓慢的原因很多，如种子质　量不好、培养基中磷酸盐浓度下降等。对此，可以补充　适量合适氮源或部分磷酸盐。一般发酵液的培养龄愈　长，对磷酸盐愈不敏感。此外，还可用提高发酵温度的　办法来促进糖耗加快。