293t细胞电转染条件
293T逆转录病毒制备最终版
293T逆转录病毒制备（慢病毒包装）1.转染前一天，10%FBS DMEM不含双抗培养基种3*10^6细胞至10cm dish，培养24h（3盘 NC #3 #4）2. a.用OptiMEM 470ul稀释Fugene9 30ul(NC/Sh#3/Sh#4)，充分吹打混匀，RT5minb.Target plasmid：3.75ug (NC/Sh#3/Sh#4)Gag-pol：3.75ugVSVG：2.5ug（8/5ug pCDH 6/3.33ug psPAX2 2/1.67ug PMD）c. 将上述准备的质粒混合液滴加到optimem与Fugene9的混合液中，RT静置20min；转染混合物逐滴加至细胞中3. 转染24h之后，弃上清液，更换新鲜培养基，置37°细胞培养箱中继续培养病毒液的收集1.转染48h 后（此时293T长满），收集上清液于15ml 离心管中，3000rpm离心20min2.将上清液用0.45um滤头过滤,再向10cm dish 加10ml培液3.24h之后，再次收集上清液，0.45um滤头过滤，随后保存于-80°冰箱中。
慢病毒感染目的细胞1.需要提前一天铺板至8个10cm dish中（细胞接种个数是1*10^6），以保证感染时的密度为30-40%；（Control，NC，#3，#4 PLC和7405各四盘）2.贴壁后弃上清液，配置25ml+40ul （10mg/ml）polybrene混匀（24ml）培养基DMEM (10％FBS不含双抗) , 6个dish加3ml混匀液，然后加入3ml病毒2盘Control组只加3ml混匀液+3ml DMEM（10%FBS不含双抗）10cm dish置于细胞培养箱中再培养48h3.48h后，弃上清，更换各自新鲜培养液8ml，并加入puromycin筛选PLC/PRE/5 0.6ug/ml（4.8ul 1mg/ml puromycin）Bel-7405 0.5ug/ml（4ul 1mg/ml puromycin）4.筛选2-3天之后，观察dish中细胞生长的状况，判断筛选是否成功(比较Control和感染组生存情况)5.若筛选成功，继续加入相应浓度抗生素筛选（注意杀菌）6.WB验证。
转染protocol
转染protocol
注意：整个过程要防止293T细胞漂，所以动作一定要轻缓，不要急。
一、细胞准备
转染前12-18小时，铺细胞。
293T 细胞，介于1:2~~1:3传。
二、转染前换液
吸去细胞上层培养基，轻轻地加入PBS（14.5cm皿需要至少5ml培养基），缓慢地晃动培养皿，然后吸去PBS。
轻轻地加入10ml Opti-MEM。
然后放回细胞培养箱。
三、PEI稀释，DNA与PEI混匀
抗体重链与轻链质粒比例按照1：2.5混匀；质粒与PEI按照1：1混匀。
（质量比，PEI 为1ug/ul）；每14.5cm皿可以转染40ug质粒。
每皿我们需要1-2mlPEI&DNA混合液（Opti-MEM稀释）。
首先计算好抗体重链、轻链所需质粒，PEI需要量以及二者混合后最终体积。
然后，取一半体积的opti-MEM于15ml离心管中，加入PEI，Vortex，净置5分钟。
取另一半体积的opti-MEM于15ml离心管中，加入DNA，Vortex。
将PEI稀释液逐滴加入DNA稀释液中，混匀。
静置20分钟。
（尽量避光）
四、轻轻地将PEI&DNA混合液加入细胞培养皿中（1-2ml/皿）。
缓慢晃动培养皿，混匀。
然后放回细胞培养箱。
五、一小时后，吸去Opti-MEM，每皿加入20ml 293freestyle培养基。
（动作轻缓）
六、4天后，收上清。
293t过表达蛋白
293t过表达蛋白293T细胞是一种常用的哺乳动物细胞系，广泛应用于生物学研究和生物技术领域。
它来源于人胚肾组织中的上皮细胞，并经过对T抗原的转染而得名。
293T细胞不仅具有良好的细胞生长特性，还能够高效地表达外源蛋白。
本文将重点介绍293T细胞过表达蛋白的原理、方法及应用。
一、293T细胞的特点293T细胞是一种非肿瘤性细胞系，具有良好的生长特性和较高的转染效率。
相比于其他细胞系，293T细胞的细胞密度可以达到较高水平，细胞生长周期较短，易于培养和扩增。
此外，293T细胞在转染外源DNA时表现出较高的转染效率，是进行蛋白过表达的理想细胞模型。
二、293T细胞过表达蛋白的原理293T细胞过表达蛋白的原理是通过转染外源DNA进入293T细胞，使其在细胞内产生目标蛋白的大量表达。
一般采用质粒转染的方法，将包含目标蛋白编码序列的质粒DNA导入到293T细胞中。
293T细胞具有较高的转染效率，可以较快地将目标蛋白表达到较高水平。
三、293T细胞过表达蛋白的方法1. 质粒转染法：将目标蛋白编码序列插入适当的质粒载体中，通过转染将质粒导入293T细胞中。
转染后，通过培养293T细胞，利用细胞内的转录和翻译系统，使目标蛋白得以表达。
2. 病毒载体转染法：将目标蛋白编码序列插入适当的病毒载体中，然后将病毒载体转染至293T细胞中。
病毒载体转染法可以提高目标蛋白的表达效率，并且可以选择适当的病毒载体来调控蛋白表达的时机和水平。
3. 电穿孔法：通过电脉冲的作用，使293T细胞膜发生临时的孔洞，使质粒DNA能够进入细胞内。
电穿孔法是一种高效的转染方法，适用于293T细胞的质粒转染。
四、293T细胞过表达蛋白的应用1. 功能研究：利用293T细胞过表达蛋白的方法，可以对目标蛋白的功能进行研究。
通过过表达目标蛋白，可以观察其对细胞生长、分化、凋亡等生物学过程的影响，揭示其相关的分子机制。
2. 药物筛选：利用293T细胞过表达蛋白的方法，可以对药物的靶点进行筛选和验证。
293T细胞的培养[1]
![293T细胞的培养[1]](https://img.taocdn.com/s3/m/d6a8872378563c1ec5da50e2524de518964bd36d.png)
293T细胞的培养[1]293T细胞的培养293T细胞是由293细胞派生, 表达SV40大T抗原的人肾上皮细胞系, 被广泛应用于瞬时转染以过表达各种目标蛋白, 或是用以包装病毒。
293T为贴壁细胞, 这种细胞对培养基的营养成分要求并不高。
培养条件为: 完全培养基: 高糖DMEM, 10%胎牛血清; 冻存液: 胎牛血清或完全培养基, 10% DMSO。
传代方法为:1．吸掉293T细胞培养瓶内的培养液;2．吸取适量的无Ca 2+和Mg 2+的PBS, 轻轻把贴壁的细胞洗两遍;3．加少量的0.05%胰蛋白酶-EDTA (一般25 cm2的培养瓶加1 ml, 75 cm 2的培养瓶加2~3 ml), 放到培养箱温育20 s;4．细胞消化完毕, 加适量培养液终止消化, 并吹打细胞, 制成均匀的细胞悬液;5．加足量的培养液, 分装到新的培养瓶中。
值得注意的是, 293T细胞的贴壁性不强, 轻微的干扰就可能使它们脱落。
所以, 在更换新鲜培养液或者用PBS冲洗的时候应该小心地添加新的培液进去, 以液体不冲打到贴壁的细胞为好。
传代的时候, 只需要用0.05%胰蛋白酶-EDTA即可轻松把细胞消化下来, 不需要消化很长时间。
有些同学反映293T细胞容易结团不易被吹打开来。
如果遇到这样的情况可以在加了胰蛋白酶温育一段时间后即拿1 ml移液枪反复轻轻吹打, 直至肉眼看不到大的细胞块为止, 然后加适量的培养液混匀, 这时候在显微镜下观察, 可见大多数细胞都是单个的, 只有少量的2~3个细胞聚在一起。
一般293T细胞可以长在塑料的培养瓶底面上直到90%融合, 再以1∶4~1∶8的比率传代。
合适的传代周期为2~3天。
传代过程中,消化的时间越短越好, 显微镜下观察到80%细胞脱落即可加培养液中止。
完成传代后放入培养箱前,应该把培养瓶或培养皿沿X、Y轴方向水平移动几下, 防止细胞都聚在中间或者四周。
冷冻293T细胞的冻存液可以用95%小牛血清加5%二甲基亚砜, 复苏率很高。
慢病毒(过表达)包装步骤
慢病毒（过表达）包装步骤秦超1.转染复苏293T细胞,传2-3代进行转染，转染推荐使用合元公司的慢病毒转染试剂。
转染步骤：（以10cm培养皿为例）⑴最好在铺细胞后20h左右进行转染，控制转染前细胞密度70%—90%，保证细胞处于良好的状态,转染前一小时把一半培养基（约5ml）换成新的（含血清，因为此转染试剂不需换液）。
⑵加psin 10ug，pspax2 10ug，pmd2.g 5ug于800ul opti—mem，混匀⑶加40ul慢病毒转染试剂于800ul opti—mem，混匀，室温静置5min⑷将⑶所得的转染试剂稀释液滴加到⑵所得到的质粒稀释液中，边加边轻轻混匀，室温放置20min⑸取出细胞培养皿，将⑷得到的质粒转染试剂复合体加入到细胞培养基中，前后轻轻推摇使混合均匀，放回培养箱。
2.收毒(36—48h)收毒前如果质粒带有荧光标签可先看一下转染效率，一般达到60%即可.⑴将培养皿中的病毒上清液吸出到15cm离心管中，然后2000rpm离心10min,以沉淀细胞碎片。
⑵取上清用0.22um滤清过滤到浓缩管(用蛋白质浓缩管即可）中。
4000rpm离心至所需体积。
⑶浓缩完毕后，吸出浓缩后的病毒液,按每次的接毒量分装，-80℃冻存。
由于反复冻融会降低慢病毒滴度，因此避免反复冻融。
3.接毒接毒前12-20h铺细胞，使接毒时细胞密度约为40％—50%，务必使用生长状态良好的细胞。
将分装好的慢病毒滴加到细胞中，加polybrene使其终浓度为8ug/ml细胞密度60%—70%时可以再接毒一次。
4.检测及培养细胞系（48h)如果带有荧光标签可直接显微镜看一下感染效率，如需用药杀用puromycin杀三天（对照组完全杀死），剩下的即为基因整合进去的细胞。
如需培养成细胞系,可继续培养。
如果剩下的细胞较少可用高浓度血清，待细胞聚团时用胰酶消化一下，使细胞铺匀。
293T说明与培养方法
293T (A TCC® CRL-3216™) DerivationThe 293T cell line, originally referred as 293tsA1609neo, is a highly transfectable derivative of human embryonic kidney 293 cells, and contains the SV40 T-antigen. CommentsThis cell line is competent to replicate vectors carrying the SV40 region of replication. It gives high titers when used to produce retroviruses. It has been widely used for retroviral production, gene expression and protein production. Culture MethodComplete Growth MediumThe base medium for this cell line is Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium (DMEM) (A TCC 30-2002). To make the complete growth medium, add the following components to the base medium: 10% Fetal Bovine Serum (heat inactivated) (A TCC 30-2020), 2mM L-glutamine (ATCC 30-2214), 1% Penicillin/Streptomycin. SubculturingV olumes used in this protocol are for 75 cm 2 flasks; proportionally reduce or increase amount of dissociation medium for culture vessels of other sizes. 1. Remove and discard culture medium. 2. Briefly rinse the cell layer with Ca++/Mg++ free Dulbecco's phosphate-buffered saline (D-PBS) or 0.05% (w/v) Trypsin - 0.53 mM EDTA solution to remove all traces of serum which contains trypsin inhibitor. 3. Add 1.0 to 2.0 mL of Trypsin-EDTA solution to flask and observe cells under an inverted microscope until cell layer is dispersed (usually within 5 to 15 minutes). Note: To avoid clumping do not agitate the cells by hitting or shaking the flask while waiting for the cells to detach. Cells that are difficult to detach may be placed at 37°C to facilitate dispersal. 4. Add 6.0 to 8.0 mL of complete growth medium and aspirate cells by gently pipetting. 5. Add appropriate aliquots of the cell suspension to new culture vessels. Incubate cultures at 37°C. Subcultivation ratio: A subcultivation ratio of 1:3 to 1:8 is recommended. Every 2 to 3 days Medium renewal: E very 2 to 3 days Cryopreservation complete growth medium supplemented with 5% (v/v) Freeze medium: complete growth medium supplemented with 5% (v/v) DMSO Storage temperature: liquid nitrogen vapor phase Temperature: 37°C Atmosphere:air, 95%; carbon dioxide (CO2) 293T (A TCC® CRL-3216™) 来源293T细胞系，最初引于293tsA1609neo，是一种可高度转染的衍生于抗原。
293 细胞转染套装
一、产品介绍用于293系列细胞的悬浮培养和瞬时转染。
SMM 293 TIS 培养基是一种化学成分确定，无血清的液体培养基。
此培养基专门为支持悬浮类型培养条件下，293EBNA 及相关的细胞（如293-F ，293H 等）的长期生长和瞬时转染而开发的。
此培养基不含L-谷氨酰胺，使用时需加入4mM 的L-谷氨酰胺。
转染时不需更换培养基，操作方便快捷。
Sinofection-293转染试剂是在Sinofection 转染试剂基础上，经过改良，专门用于293EBNA 及相关的细胞（如293-F ，293H 等）悬浮条件下的瞬时转染。
毒性更低，转染效率更高，蛋白和抗体的产量也更高。
SMS 293-SUPI 是一种无蛋白，无血清的液体加料液。
二、产品组分三、储存条件SMM 293 TIS 培养基2-8℃避光储存12个月；Sinofection-293转染试剂建议在-20℃长期存放；SMS 293-SUPI 2-8℃避光储存12个月。
四、产品特点• 高的蛋白或抗体产量• 操作简易，节省时间• 易于实现放大规模瞬时转染五、操作流程以100 mL 培养瓶（溶液体积占瓶体积的1/5）操作体系举例如下：用于瞬时转染的细胞要在复苏后至少3代后，且处于对数生长期，活率在90%以上。
1.转染当天，取样计数细胞密度和活率。
用37℃水浴锅里预热好的新鲜SMM 293 TIS 培养基稀释处理细胞，密度到1×106 cells/mL ，每瓶细胞液体积为20 mL ，然后旋紧瓶口放入摇床继续培养，2~4小时后进行转染。
2. 转染液的配制：（1）用150 mM 的NaCl 稀释10µg DNA ，混匀后放置5 min ；（2）往DNA 稀释液中加入50 μL 的Sinofection ，最终转染液的总体积为1 mL ，混匀后放置10 min 。
3. 将转染液逐滴加入到细胞培养液中，摇匀后旋紧瓶口放回摇床，36.5℃ ，5%CO 2，110-175 rpm 继续培养。
293T细胞冻存、f复苏、传代及病毒包装
一、293T细胞的冻存1.随着传代的次数增加，293T细胞会出现生长状态下降，出现突变等。
所以要在细胞购进时就进行大量冻存，以保证实验的稳定性和持续性。
2.在细胞对数生长期进行冻存，增加细胞复苏成活率。
3. 倒去细胞上清液，加入D-Hank's液洗去残留的培养基。
4.加入0.25%的胰酶，消化10-20s后倒去。
5. 镜下观察细胞变圆，细胞间间隙加大时，加入新鲜培养基吹打混匀。
6.细胞计数。
7. 将细胞离心，1000rpm，2min。
8.根据计数结果加入细胞冻存液（70%完全培养基+ 20% FBS+ 10% DMSO）重悬细胞，密度为3×106个/ml。
9.分装进细胞冻存管，放入泡沫盒中，放入-80℃超低温冰箱。
10. 第二天将细胞放入液氮灌，并记录。
11.复苏检测细胞存活率，细胞状态等，并记录。
二.293T细胞的传代1. 当细胞生长至汇合率达到80~90%需要对细胞进行传代操作，以扩大细胞数量，维持细胞良好的生长状态。
2.消化细胞，方法同上。
3. 细胞离心结束后，加入完全培养基重悬。
密度为3×105个/ml。
4.分到10cm培养皿中，10ml/皿。
5.放回37℃、3%CO2和95%相对湿度的培养箱中培养。
三. 293T细胞的复苏1.当细胞传代次数过多（超过50代），细胞状态变差时或细胞出现污染事故时，需要丢弃并对开始冻存的细胞进行复苏2. 打开水浴锅，设置温度为40℃。
3.查看细胞库记录，根据记录从液氮灌中取出冻存的细胞（需戴上棉手套，防止被冻伤），迅速丢入水浴锅中并快速晃动，在1~2min内使细胞溶液完全溶解。
4. 将1ml细胞溶液加入9 ml完全培养基中并混匀后转入10cm培养皿。
5.放回37℃、3%CO2和95%相对湿度的培养箱中培养。
6.第二天观察细胞存活率。
倒掉旧的培养基，加入10ml新鲜培养基。
用于包装的293T细胞(ATCC No.CRL-11268)必需选择处于生长旺盛期，细胞状态较佳，存活率90%以上，细胞边缘清晰，传代次数较低。
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293t细胞电转染条件
293T 细胞电转染条件的成功率和效率往往受到多种因素的影响，包括转染试剂、细胞状态、电场强度、电脉冲时间、转染时间、转染浓度等等。
因此，不同的实验室可能会有不同的电转染条件，需要根据实际情况进行摸索和优化。
其中，细胞状态是影响电转染成功率的关键因素之一。
如果细胞状态不佳，例如饥饿、衰老或感染等情况，可能会影响转染效率和品质。
因此，在进行电转染之前，需要对细胞状态进行评估，并进行相应的处理，以提高转染成功率和效率。
此外，电场强度、电脉冲时间、转染时间等因素也会影响电转染的成功率和效率。
一般来说，较高的电场强度和较短的电脉冲时间可以提高转染效率，但过长的电脉冲时间可能会影响细胞状态和寿命。
同时，转染时间也需要根据具体的转染试剂和目标基因进行优化，以提高转染效率和品质。
总结起来，293T 细胞电转染条件需要进行充分的实验和摸索，
并结合具体情况进行优化和调整。
同时，需要注意保持实验的标准化和规范化，以确保实验结果的可靠性和可重复性。