犬细小病毒VP2蛋白在真核细胞中的分泌表达及特性_王微[1].
犬细小病毒病的研究进展
犬细小病毒病的研究进展作者：余洪涛来源：《农家致富顾问·下半月》2016年第11期摘要犬细小病毒病是一种由犬细小病毒对犬进行感染引发的一种传播性极强的病毒性疾病。
最主要的临床症状有白细胞显著减少、出血性肠炎以及剧烈呕吐。
如果属于心肌炎类型，往往都会出现突然死亡，虽然临床症状有所不同，但有一个共同的特征就是发病率高，传播性强、致死率高，严重制约着养犬业的发展，甚至还会对猪养殖业以及养鸡业造成影响。
本文主要就从这种疾病的流行特点以及具体的防治措施进行分析。
关键词犬细小病毒病；研究进展犬细小病毒病（canineparvovirus，简称CPV）是由犬细小病毒诱发的一种急性传染病，这种疾病通过间接或者直接的途径都可以进行传播，临床症状有腹泻、白细胞突然减少以及呕吐等为主要特点，还有可能导致犬出现急性心肌炎。
这种疾病具有传播性强、发病率高、致死率高的特点，不仅会对犬养殖业造成严重的影响，同时还会对猪养殖业以及养鸡业的发展造成严重的影响，这种疾病在感染猪以后，通常会引发病源性母猪繁殖障碍，在鸡群中感染这种疾病，往往会出现吸收障碍以及发育迟缓等问题，严重影响鸡群的质量，下面就具体对这一病毒目前的研究进展进行分析。
1流行病学特点就目前的研究现状而言，犬细小病毒病只有一个抗原型，但是不同的毒株其抗原性也有所不同，当前这种疾病主要有CPV-2c、CPV-2a、CPV-2b几种亚型，就我国内地而言，主要是CPV-2a亚型、CPV-2c亚型。
这种病毒容易感染的动物就是犬类，发病没有明显的时间界限，在春、冬季节发病率尤其高，传播性极强，尤其是幼犬以及纯种犬的感染率更高，养殖环境的改变以及严寒、拥挤和长途运输等容易诱发此病。
这种疾病的传染源就是病犬，传播途径主要有唾液、粪便。
此外，通过口鼻接触污染物也有可能导致感染。
2临床症状以及治疗方式2.1犬细小病毒病的临床症状在健康感染犬细小病毒以后，往往会出现心肌炎症、肠炎症状，发生心肌炎的往往都属于急性心肌炎，并且都会出现猝死的现象，临床症状相对比较少，心肌炎的发生主要发生在幼犬中。
犬细小病毒VP2基因编码主要抗原表位区的核酸免疫及其免疫原性研究
第 ３ ７卷 第 ６期
行 分 析 ，确 定 了主 要 抗 原表 位 区域 （ ｖ Ｐ ２ ． ２ ２ ８ ） ，通过 Ｐ Ｃ Ｒ扩 增 相应 的表 位 编 码 区域 基 因片段 （ ７ ０ ０ ｂ ｐ ） ，将 其 克 隆 于 真核表达载体 ｐ Ｖ Ａ Ｘ１ 中构 建 重 组 真核 表 达 质 粒 ｐ Ｖ Ａ Ｘ１ ． Ｖ Ｐ ２ ． ２ ２ ８ 。Ｗｅ ｓ ｔ ｅ ｍ ｂ ｌ ｏ ｔ 结果 显 示 Ｖ Ｐ ２ — ２ ２ ８能 够在 Ｃ Ｏ Ｓ 一 ７细
胞 中正 确 表 达 。将 该 重 组 质 粒 免 疫 小 鼠 ，利 用血 凝 抑 制 试 验检 测 不 同 时期 的 抗 体 水 平 ，以 ＭＴ Ｔ 法检 测 免 疫 ３ 。 结果 表 明 ｐ Ｖ Ａ Ｘ１ ． ｖ Ｐ ２ ． ２ ２ ８能够 诱 导 小 鼠产 生较 高 的抗 体 水 平 ；淋 巴 细胞 增 殖 试 验 表 明
２ ． Ｃ ｏ ｌ ｌ ｅ ｇ ｅ ｏ ｆ Ｖｅ ｔ ｅ ｒ ｉ ｎ ａ ｒ ｙ Ｍｅ ｄ ｉ ｃ ｉ ｎ ｅ ， Ｎａ ｎ ｊ ｉ ｎ ｇ Ａ ｇ ｒ ｉ ｃ ｕ ｌ ｔ ｕ ｒ ａ ｌ Ｕｎ ｉ ｖ ｅ ｒ ｓ ｉ ｔ ｙ ， Ｎａ ｎ ｊ ｉ ｎ ｇ ２ １ ０ ０ ９ ５ ， Ｃ ｈ ｉ ｎ ａ ）
Ｉ ｍ ｍｕ ｎ ｏ ｇ ｅ ｎ ｉ ｃ ｉ ｔ ｙ ｗｉ ｔ ｈ ｇ ｅ ｎ ｅ ｅ ｎ ｃ ｏ ｄ ｉ ｎ ｇ ｔ ｈ ｅ ｍａ ｉ ｎ ａ ｎ ｔ ｉ ｇ ｅ ｎ ｄ ｏ ｍａ ｉ ｎ ｏ ｆ ｃ ａ ｎ ｉ ｎ ｅ ｐ ａ ｒ ｖ ｏ ｖ ｉ ｒ ｕ ｓ ＶＰ２
犬细小病毒研究进展
犬细小病毒病研究进展犬细小病毒病是由犬细小病毒（Canine parvovirus,CPV）引起的犬的一种急性传染病。
本病以犬的剧烈的呕吐、出血性肠炎和白细胞显著减少以及心肌炎为主要特征。
不同品种和年龄的犬都易感染，发病率高，传染性强，死亡率高，是危害我国养犬业最为严重的疾病之一，可造成严重的损失。
1977年美国Eugster从患出血性肠炎病犬粪便中发现了犬细小病毒，1982年，我国梁士哲等最早报道了类似CPV所致的犬出血性肠炎；1983年，徐汉坤等正式确认本病的流行。
犬细小病毒的发现虽然只有30年的时间，但该病对犬的危害严重。
本文就病毒生物学特性及其基因组结构、流行病学、发病机理及病理变化、临床症状、疫苗研发以及病原的检测方法等方面的研究进展进行概述。
目前尚无CPV感染的有效治疗药物，对于发病动物，可以对症治疗配合高免血清或单克隆抗体治疗。
预防该病的有效措施是加强饲养管理和准确诊断基础上的有效疫苗接种。
1.1 犬细小病毒病的流行病学特征CPV主要感染犬，特别是断奶前后的幼犬。
其他犬科动物，如貂、狐、狼等也易感。
病犬是本病的主要传染源，病毒随呕吐物、唾液、粪便等排出体外，污染饲料、垫料、饮水以及周围环境、康复犬仍可通过粪便长期向外排毒。
健康易感犬直接接触病犬或带毒犬、或摄入污染的食物和饮水通过消化道而遭受感染。
此外，人工注射、肌肉或静脉接种也能引起本病的发生。
犬感染细小病毒后发病急，死亡率高，不同年龄、性别、品种的犬均可感染。
乳幼犬由于可能从母体获得抗体，所以较少发病；断奶后的幼龄犬最为易感，往往以同窝暴发为特征；成年犬一般只出现感染后的免疫反应，很少出现明显的临床症状，但近年也常发生成年犬因出血性肠炎而致死的严重病例[22]。
4~6周龄犬感染后呈致死性心肌炎的为多；8~10周龄的犬则以肠炎为主。
小于4周龄的仔犬和大于5周龄的老犬发病率较低，一般分别为2%和16%。
根据临床发病犬的种类来看，纯种犬和外来犬的发病率高于土种犬。
犬CTLA-4胞外区的分子克隆、表达和对犬细小病毒VP2的免疫佐剂作用
犬CTLA-4胞外区的分子克隆、表达和对犬细小病毒VP2的免疫佐剂作用吴植;孙怀昌;张鑫宇【期刊名称】《微生物学报》【年(卷),期】2008(48)3【摘要】[目的]探索犬细胞毒性T细胞相关抗原-4(cytotoxic T lymphocyte-associated antigen-4,CTLA-4)胞外区作为免疫佐剂的可行性.[方法]根据已发表序列设计引物,用RT-PCR扩增CTLA-4胞外区编码序列,用PCR扩增犬细小病毒(canine parvovirus,CPV)VP2蛋白主要抗原表位基因片段VP2S,将VP2S克隆入含和不含CTLA-4胞外区基因片段的原核表达质粒pQE-31;用获得的重组质粒pQE-CTLA-4-VP2S和pQE-VP2S转化大肠杆菌,并进行诱导表达;用相同剂量的重组蛋白VP2S和CTLA-4-VP2S免疫小鼠.用间接ELISA和血凝抑制试验比较两个免疫组的抗体水平.[结果]经过30次循环PCR扩增后,琼脂糖凝胶电泳显示预期大小的扩增产物;序列测定结果显示,克隆的毕格犬CTLA-4胞外区与已发表序列的核苷酸同源性为99.2%,氨基酸序列同源性为98.4%,结合B7分子的六肽基序(MYPPPY)无变化:VP2S与已发表CPV VP2的核苷酸序列同源性为99%,氨基酸序列同源性为98.6%:经IPTG诱导后,两种重组大肠杆菌表达预期的29kDa VP2S和42kDaCTLA-4-VP2S重组蛋白,两者均能被CPV抗血清识别;间接ELISA和血凝抑制试验结果显示,CTLA-4-VP2S免疫组的抗体产生时间为初免后第2周,抗体高峰期为初免后第4周,而VP2S免疫组的抗体产生时间为初免后第4周,抗体高峰期为初免后第5周,两个试验组高峰期ELISA抗体效价和血凝抑制抗体效价分别相差100倍和10倍.[结论]犬CTLA-4胞外区可作为分子佐剂促进CPV VP2蛋白抗体的产生.【总页数】6页(P369-374)【作者】吴植;孙怀昌;张鑫宇【作者单位】扬州大学兽医学院,扬州,225009;扬州大学兽医学院,扬州,225009;扬州大学兽医学院,扬州,225009【正文语种】中文【中图分类】R392【相关文献】1.犬细小病毒VP2主要抗原表位区的原核表达载体构建及诱导表达 [J], 马辉;赵绪永2.绵羊CTLA-4胞外区对细粒棘球蚴EG95抗原的免疫佐剂作用 [J], 张雯;袁维峰;朱鸿飞;张鑫宇;夏晓莉;孙怀昌3.人CTLA-4胞外区cDNA毕赤酵母表达载体的构建及高拷贝稳定整合菌株的筛选 [J], 易绍萱;吴军;贺伟峰;罗高兴;陈希炜;朱谨;代飞4.人CTLA-4胞外区cDNA的克隆及Ig融合蛋白表达载体的构建 [J], 易绍萱;吴军;姜庆;王锡华;李彦;刘志刚;张宁;肖光夏5.表达犬细小病毒VP2蛋白重组犬2型腺病毒的构建及鉴定 [J], 谢之景;夏咸柱;扈荣良;杨松涛;邹啸环;黄耕因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
犬细小病毒南京株VP2蛋白免疫原性片段的克隆表达
犬细小病毒南京株VP2蛋白免疫原性片段的克隆表达李希阳;缪勤;张爱华;张洪英;张汇东;张海彬【期刊名称】《畜牧与兽医》【年(卷),期】2008(40)12【摘要】以Protean软件对犬细小病毒南京株(CPV-GN)VP2蛋白的分子结构进行分析,从中筛选出具有良好免疫原性潜能的部分片段(VP2′片段),利用PrimerPremier5.0软件设计一对引物,用以该片段的扩增。
将PCR扩增产物克隆入pMD18-T载体,构建了pMD-VP2′重组质粒。
双酶切回收目的条带,将之亚克隆入表达载体pET32a(+),构建了重组表达质粒pET32-VP2′。
转化宿主菌BL21,经IPTG诱导后成功表达了分子量约为34ku的融合蛋白。
免疫转印显示,目的蛋白可被CPV-2b抗血清所识别,证明其具有与特异性抗体结合的抗原性,为CPV亚单位疫苗和免疫学诊断方法的研究打下基础。
【总页数】4页(P15-18)【关键词】犬细小病毒南京株;VP2基因片段;克隆;表达【作者】李希阳;缪勤;张爱华;张洪英;张汇东;张海彬【作者单位】南京农业大学动物医学院,江苏南京210095;公安部南京警犬研究所,江苏南京210012;南京市疾病预防控制中心,江苏南京210003【正文语种】中文【中图分类】S858.292【相关文献】1.犬细小病毒NY株VP2蛋白的原核表达及反应原性鉴定 [J], 毛倩倩;卜宾;唐青海;阚云超;姚伦广;唐存多;焦铸锦;杨建伟2.犬细小病毒SH14株VP2基因原核表达及免疫原性分析 [J], 唐井玉;李传峰;宫晓华;李琦;丁明洋;陈宗艳;王桂军;刘光清3.犬细小病毒NY株VP2蛋白多克隆抗体的制备与鉴定 [J], 毛倩倩;崔尚金;周灵;唐青海;卜宾;唐存多;焦铸锦;姚伦广;阚云超;杨建伟4.犬细小病毒南京株(CPV-GN)衣壳蛋白vp2基因的克隆与序列分析 [J], 李希阳;缪勤;张汇东;张洪英;张海彬5.表达犬细小病毒VP2蛋白重组犬2型腺病毒的构建及鉴定 [J], 谢之景;夏咸柱;扈荣良;杨松涛;邹啸环;黄耕因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
犬细小病毒病的病原学、临床症状与综合防治
２０２０年第５期（总第３７２期）畜禽业疫病防治犬细小病毒病的病原学、临床症状与综合防治贺国连（昌吉市动物疾病预防控制中心，新疆昌吉８３１１００）摘 要：犬细小病毒病是由犬细小病毒引起的一种犬类的传染病，以幼犬的发病率最高，患病的犬通常表现为肠炎型和心肌炎型，该病的发病率和死亡率均很高，已经严重危害了养犬业的正常发展。
介绍了犬细小病毒病的病原学、流行病学、临床症状、诊断方法以及综合防治，希望能够降低该病的发病率。
关键词：犬细小病毒病；病原学；临床症状；综合防治ＤＯＩ：１０．１９５６７／ｊ．ｃｎｋｉ．１００８－０４１４．２０２０．０５．０８４ 引言犬细小病毒是１９７７年美国的科学家在犬的粪便中分离出来的，１９８２年我国首次报道了该疾病，目前法国、澳大利亚、日本、意大利等诸多国家均有此病的发生。
该病发病率较高，传染速度快，死亡率较高，已经严重威胁了我国养犬行业的正常发展，造成了养犬场的经济损失。
病原学犬细小病毒病的病原为犬细小病毒，该病毒为细小病毒科、细小病毒属的成员之一，病毒粒子呈二十面体对称结构，直径在２１～２４ｎｍ，核酸为单股ＤＮＡ，没有囊膜结构，该病毒通过其转铁蛋白受体进入细胞体内，且病毒的复制只能在活跃的增殖细胞中进行［１］。
犬细小病毒能够凝集猪、仓鼠、恒河猴、猫以及马的红细胞，即便病毒已经用福尔马林进行灭活，也仍能保持其血凝型。
犬细小病毒目前仅发现一个抗原型，为ＣＰＶ－２型，但有３种亚型，分为为ａ亚型、ｂ亚型和ｃ亚型。
该病毒对环境的抵抗能力较强，低温条件下能够保持感染性，６５℃下３０ｍｉｎ仍具有感染性，在室温条件下可以存活３个月，在粪便中可以存活数年，酒精、乙醚、氯仿等常规消毒剂不能使其失活，有效杀灭该病毒的方法是紫外线照射，此外，次氯酸钠、β－丙内脂可以将其杀灭。
流行病学该病对不同品种、不同年龄、不同性别的犬均有一定的感染能力，相较于成年犬来讲，幼犬更易发病，本病没有明显的季节性，一年四季均可发病。
犬细小病毒北京分离株VP2基因的表达与抗原性分析
犬细小病毒北京分离株VP2基因的表达与抗原性分析曾妮;李刚;朱鸿飞;侯绍华;史利军【期刊名称】《中国畜牧兽医》【年(卷),期】2010(037)004【摘要】本研究基于犬细小病毒(canine parvovirus,CPV)VP2基因序列设计引物,利用PCR技术扩增该基因.扩增的VP2基因连入表达载体pET-32a(+),经PCR及双酶切鉴定基因连入正确.重组表达载体转入大肠杆菌后,经IPTG诱导,SDS-PAGE 及Western blotting分析表明有特异蛋白的表达,分子质量大小为87 ku.将表达的蛋白包被酶标板后用抗犬细小病毒单抗与其反应,表明表达的VP2蛋白可以与相应抗体特异结合.【总页数】4页(P185-188)【作者】曾妮;李刚;朱鸿飞;侯绍华;史利军【作者单位】中国农业科学院北京畜牧兽医研究所,北京,100193;中国农业科学院北京畜牧兽医研究所,北京,100193;中国农业科学院北京畜牧兽医研究所,北京,100193;中国农业科学院北京畜牧兽医研究所,北京,100193;中国农业科学院北京畜牧兽医研究所,北京,100193【正文语种】中文【中图分类】S852.65+9.2【相关文献】1.犬细小病毒HL-01株的分离鉴定及VP2基因真核表达质粒的构建 [J], 王玉玲;范京惠;边亚娟;张炳丽;唐丽杰;李一经2.犬细小病毒昆明流行株的分离鉴定与VP2基因序列分析 [J], 赵屹钦;曾梦颖;郭娟;张迪;高洪;严玉霖3.犬细小病毒临床分离株VP2基因进化分析 [J], 温峰琴;项海涛;郝宝成;邢小勇;包世俊;胡永浩4.犬细小病毒VP2基因序列分析及BJ-1株的分离鉴定 [J], 周宏专;苏霞;林路路;齐颀;张进;徐福洲;杨兵5.三株犬细小病毒的分离鉴定及VP2基因序列分析 [J], 陈延宗;钱晶;王晶宇;赵航;毕振威;夏兴霞;诸玉梅;芮荣;王永山因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
吉林省犬细小病毒流行毒株的分离及VP2基因序列分析
核苷酸 同源性为 ９ ８ ． ９ ％～ ９ ９ ． ９ ％， 与国外分离株核苷酸 同源性为 ９ ８ ． ３ ％一 ９ ９ ． ７ ％。遗传进化树 结
果表明， ６株分 离株 分 属 ４个分 枝 ： 儿 一Ｃ Ｃ １ 、 儿 一Ｌ Ｙ、 Ｊ Ｌ—Ｓ Ｙ 与 山东 、 辽 宁分 离株 同属 １个 分 枝 ， Ｊ Ｌ— Ｃ Ｃ ２ 与 黑龙江分 离株 同属 １个 分枝 ， 儿 一Ｊ Ｔ与 吉林分 离株 同属 １个 分 枝 ， 儿 一儿 与 ２ ０ １ ３年 吉
ＺＨＡＮＧ Ｓ ｈ ｕ ａ ｎ ｇ ， ＹＩ Ｓ ｈ ｕ—ｓ ｈ ｕ ａ ｉ ， Ｗ ＡＮＧ Ｙｉ—ｍｉ ｎ ｇ ， ＧＵＯ Ｍｅ ｎｇ—ｒ ｕ ， Ｌ Ｉ Ｘｉ ａ ｎ ｇ ， ＨＵ Ｇｕｉ —ｘ ｕ ｅ
（ １ ． Ｃ ｏ ｌ ｌ ｅ ｇ ｅ ｏ ｆＡ ｎ ｉ ｍａ ｌ Ｓ ｃ ｉ ｅ ｎ ｃ ｅ ａ ｎ ｄ Ｔ ｅ ｃ ｈ ｎ ｏ ｌ ｏ ｇ ｙ ， Ｊ ｉ ｌ ｉ ｎＡ ｇ ｒ ｉ ｃ ｕ ｌ ｔ ｕ ｒ ａ ｌ Ｕ ｎ ｉ ｖ ｅ ｒ ｓ ｉ ｔ ｙ， Ｃ ｈ ａ ｎ ｇ ｃ ｈ ｕ ｎ ，１ ３ ０ １ １ ８ ，Ｃ ｈ ｉ ｎ ａ ； ２ ． Ｓ ｏ ｎ ｇ ｙ ｕ ａ ｎ Ｅ ｎ ｔ ｒ ｙ—Ｅ ｘ ｉ ｔ Ｉ ｎ ｓ ｐ ｅ ｃ ｔ ｉ ｏ ｎ ａ ｎ ｄ Ｑ ｕ ａ ｒ ａ ｎ ｔ ｉ ｎ ｅ Ｂ ｕ ｒ ｅ ａ ｕ ， Ｓ ｏ ｎ ｇ ｙ ｕ ａ ｎ ， Ｃ ｈ ａ ｎ ｇ ｃ ｈ ｕ ｎ ， １ ３ ８ ０ ０ ０， Ｃ ｈ ｉ ｎ ａ ）
林、 辽源 、 松原 、 九 台地 区采集就 诊 犬肛 门拭子 ７ ３份 ， 采 用胶 体 金 快速检 测 试 剂盒 检 测 后 ， 阳性样 品 １ ５份。选 取具 有代表 性 的 ６份 病料使 用 Ｆ ８ １细胞 进行 病毒 的分 离 ， 成 功分 离到 ６株病 毒 （ 暂命 名 为 Ｊ Ｌ— Ｃ Ｃ １ 、 Ｊ Ｌ—Ｃ Ｃ ２ 、 Ｊ Ｌ一儿 、 儿 一Ｓ Ｙ、 Ｊ Ｌ—Ｊ Ｔ 、 儿 一Ｌ Ｙ） ， 经 通 用 引物 鉴定 均 为 犬 细 小病 毒 。Ｖ Ｐ ２基 因 序列分 析结 果 显示 ， ６株 Ｃ Ｐ Ｖ分 离株 之 间的核 苷 酸 同源 性 为 ９ ９ ． ３ ％ ～１ ０ ０ ％， 与近 年 来 国 内分 离株
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Re search Paper研究报告微生物学报Acta Microbiologica Sinica 49(5 :648-652; 4May 2009ISS N 0001-6209; C N 11-1995ΠQ http :ΠΠjournals. im. ac. cn Πactamicrocn基金项目:国家自然科学基金(30771586 ; 河北省自然科学基金(C2008000244 ; 河北省人事厅留学人员科技活动择优资助项目(200808083通信作者。
T el :+86231227528473; E 2mail :feizhong2000@yahoo. com作者简介:王微(1983- , 女, 河北省秦皇岛人, 硕士研究生, 主要从事基因工程药物方面的研究。
E 2mail :airenwu@1261com 收稿日期:2008211219; 修回日期:2009202225Δ引用自该课件犬细小病毒VP2王微1, 李秀锦2, 131, 111, 李巍1(1 (2, 秦皇岛066004摘要:【目的】利用真核细胞分泌表达犬细小病毒VP2蛋白和研究其特性。
【方法】为构建犬细小病毒(Canine parv ovirus , CPV VP2基因的真核分泌型表达载体, 首先通过酶切从含有人C D5信号肽序列的质粒中将C D5信号肽基因片段切出, 将其连接到真核表达载体pcDNA311A 的多克隆位点上, 构建成pcDNA3112C D5sp质粒。
然后再通过PCR 方法从含有犬细小病毒VP2基因的质粒中扩增VP2基因, 并将其插入到pcDNA3112C D5sp 载体中C D5信号肽的下游, 构建成VP2基因的真核分泌型表达载体pcDNA 2C D5sp 2VP2。
经磷酸钙介导转染293T 细胞, 使其在真核细胞中进行分泌表达, 并通过E LIS A 检测表达的VP2蛋白与犬转铁蛋白受体(T fR 结合的活性。
【结果】序列分析结果表明, 本实验构建的犬细小病毒VP2基因真核分泌型表达载体结构正确, 将该表达载体转染的293T 细胞, 在培养基中通过Western 2blot 检测到有VP2重组蛋白的存在。
经E LIS A 检测表明表达的重组VP2蛋白具有与犬转铁蛋白受体结合的活性。
【结论】利用人的C D5信号肽实现了犬细小病毒VP2蛋白在真核细胞中的分泌表达, 表达的VP2蛋白具有与犬转铁蛋白受体结合的活性。
关键词:犬细小病毒;VP2蛋白;293T 细胞; 分泌性表达;T fR 中图分类号:S852165,Q786文献标识码:A文章编号:000126209(2009 0520648205犬细小病毒病是由犬细小病毒(Canine parv ovirus , CPV 引起的一种急性传染病。
此病主要表现急性出血性胃肠炎和急性心肌炎。
传染性强, 发病率和死亡率高, 对我国养犬业和经济动物养殖业造成极大的危害[1-2]。
CPV 是一类结构简单的单链线状DNA 病毒, 病毒颗粒直径约为25nm , 无囊膜, 成二十面体。
病毒基因组全长为5323nt , 含有2个ORF ,5′端主要编码早期转录的调节蛋白(NS1和NS2 ,3′端编码晚期转录的结构蛋白, 即病毒衣壳蛋白(VP1和VP2 ,VP2是衣壳蛋白的主要成分。
VP2不仅具有较强的免疫原性, 可用于制备亚单位疫苗或DNA 疫苗[3], 同时VP2可以与宿主细胞膜上的转铁蛋白受体(T fR 结合介导细小病毒的感染[4-6]。
基于VP2与T fR 这种特异结合的特性, 研究利用T fR 蛋白(细胞外结构域阻断细小病毒的感染有一定的理论和应用价值。
为此本室通过基因工程方法已制备了犬T fR 细胞外结构域蛋白。
本研究将利用真核表达系统通过分泌性表达方式制备具有生物活性的VP2蛋白, 为研究VP2与T fR 的相互作用及阻断细小病毒的感染机制创造条件。
犬细小病毒属无囊膜病毒,VP2结构蛋白基因不含有信号肽序列。
人们曾采用大肠杆菌表达VP2蛋白, 制备亚单位疫苗[7-8]。
但要研究VP2蛋白与T fR 的相互作用, 表达的重组VP2蛋白必须具有天然的分子构象。
用大肠杆菌表达动物蛋白和病毒蛋白由于缺少翻译后的加工过程, 表达的重组蛋白往往不能形成原有的分子构象, 从而影响重组蛋白的生物活性。
为此本实验将采用真核表达系统表达VP2蛋白。
通过构建分泌型表达载体, 使VP2蛋白在真核细胞进行分泌表达, 这样利于表达产物的分离纯化。
的信号肽较多, 如人C D5肽, 的信号肽序列C D5信号肽的VP2分泌型表达载体, 实现了VP2在293T 细胞中的分泌性表达, 同时表达的VP2蛋白具有与犬转铁蛋白受体结合的活性, 这为进一步研究VP2与T fR 的相互作用机制奠定了基础。
1材料和方法111材料11111载体、菌种、细胞株及T fR 重组蛋白:真核表达载体pcDNA311A 购自美国Invitrogen 公司; 含有人C D5信号肽序列的pC oVS 载体由美国哈佛大学Michael Farzan 教授赠送; 大肠杆菌(E scherichia coliDH5α为本实验室保存菌种; 人胚胎肾细胞293T 由中科院微生物所惠赠。
含犬细小病毒VP2基因(G enBank AB120727 的质粒由中国农业大学贺英博士惠赠。
T fR 重组蛋白由本实验室制备。
11112主要试剂:P f u DNA 聚合酶, 限制性内切酶Xba Ⅰ、K lenow 、K pn Ⅰ、Hind Ⅲ、Nhe Ⅰ、Apa Ⅰ、T 4DNA 连接酶均购自Promega C orporation ; 琼脂糖凝胶DNA 回收试剂盒购自天根生化科技(北京有限公司; 小鼠抗Myc 单克隆抗体购自Santa CruzBiotechnology , Inc ; 碱性磷酸酶标记马抗小鼠IgG 抗体和辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠IgG 购自Vector Laboratories Ltd ; 预染蛋白分子量Marker 为Bio 2Rad Laboratories 产品; DME M 培养基为G ibco BR L Life T echnologies 产品; 小牛血清为北京元亨圣马公司产品; 其它试剂均为国产分析纯。
11113主要仪器:ATC201型PCR 仪为美国阿波罗公司产品;680酶标仪、凝胶自动成像系统和半干式转移电泳装置均为美国Bio 2Rad 产品; 双稳电泳仪、小型垂直板电泳槽为北京六一仪器厂产品; 超净工作台为北京东联哈尔仪器制造有限公司产品; 倒置显微镜重庆光电仪器总公司产品; 恒温气浴摇床(THZ 2C 型太仓市实验设备厂产品; 扫描仪为上海中晶科技有限公司产品。
112带有人CD5信号肽的pcDNA3112CD5sp 质粒表达载体的构建利用常规方法将人C D5pC oVS 质粒中转到粒中, 构建成中CPV 的VP2序列(AB120727设计1对引物:上游引物:5′CTG TG ATGG AG C AG TT C AACC AG, 下游引物:5′AT AT AATTTT CT AGG TG CT AG T TG 。
然后通过PCR 方法从含有VP2基因的质粒中扩增VP2基因的编码序列。
上下游引物的5’端分别引入的NheI 和ApaI 酶切位点利于VP2基因与载体的连接。
鉴于目前缺少VP2的特异性抗体, 在下游引物设计时去除VP2基因的终止密码子, 使VP2基因与pcDNA311A 载体上的Myc 2His 标签融合, 这不仅便于后续Western blot 的检测, 同时也利于表达产物的分离纯化。
引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。
PCR 反应条件为:94℃5min ; 94℃1min ,58℃1min ,72℃2min , 循环30次;72℃10min 。
114VP2基因真核表达载体的构建将上述扩增的PCR 产物和pcDNA 2C D5sp 质粒载体分别用NheI 和ApaI 双酶切, 用回收试剂盒分别回收双酶切的目的片段和载体, 然后通过与构建pcDNA3112C D5sp 质粒相同的方法构建VP2基因的真核表达载体pcDNA 2C D5sp 2VP2。
重组质粒的鉴定采用Xba Ⅰ和Apa Ⅰ双酶切法。
115质粒表达载体在293T 细胞中的转染采用磷酸钙转染法[9]。
用重组的真核表达载体pcDNA 2C D5sp 2VP2转染293T 细胞, 同时以空载体pcDNA311A 转染293T 细胞作为阴性对照。
116重组VP2蛋白的鉴定采用Western blot 法。
当细胞转染48h 后, 收集培养基, 用三氯乙酸沉淀法浓缩培养基中的蛋白质。
取蛋白溶液进行S DS 2PAGE 凝胶电泳, 转膜后在含有5%脱脂奶粉的T BST 中4℃封闭过夜。
然后用1∶500倍稀释的小鼠抗Myc 单克隆抗体在室温杂交2h , 再以1∶1000倍稀释的碱性磷酸酶标记的羊抗小鼠的IgG 为二抗杂交1h , 最后加入1m L 显色液(NBT ΠBCIP 显色5～10min , 自来水冲洗终止反应,056Lisha Ding et al. ΠAc ta Microbiologica Sinica (2009 49(5根据在膜上的显色带来判断结果, 最后用扫描仪记录显色结果。
117重组VP2蛋白的大量制备与纯化用上述同样的方法平行转染5瓶293T 细胞(T 75细胞瓶 ,48h 后收集培养基, 加入Ni 2NT A 琼脂糖凝胶颗粒吸附含有Myc ΠHis 标签的重组VP2蛋白, 然后利用含有咪唑的洗脱缓冲液将VP2蛋白洗脱, 最后用透析袋和PEG 12000浓缩VP2蛋白。
蛋白浓度采用Brad ford 蛋白定量试剂(T 行测定。
118VP2f R 采用E 16的碳酸钠缓冲液(115g ΠL Na 2C O 3219g ΠL NaHC O 3 将T fR 蛋白质或BS A (阴性对照配成5μg Πm L 浓度。
在聚苯乙烯96孔板每孔中加100μL ,4℃过夜(包被。
次日用T BST 洗涤缓冲液洗3次。
加入用T BST 洗涤缓冲液倍比稀释的VP2蛋白(5、215、1125、01625、01313、01156、01078、01039μg Πm L 100μL ,4℃过夜,T BST 洗3次。
每孔加入小鼠抗Myc 单克隆抗体(250倍稀释 100μL , 在37℃摇床放置2h , T BST 洗3次。
每孔再加入辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠IgG (500倍稀释100μL , 在37℃摇床放置1h , T BST 洗4次。
甩干孔中残留的洗液, 加新鲜配置的底物溶液(在磷酸2柠檬酸缓冲液含有014mg Πm L 邻苯二胺和012%H 2O 2 100μL ,37℃反应10～30min 。