Marfey法与质谱联用技术

LC/MS 决 定 氨 基 酸 绝对构型的原理
Marfey 法分离机制的探讨
Marfey法与质谱的联用
衍生化过程
Marfey 法分离机制的探讨
下图是用LC/MS来决定肽中氨基酸绝对构型的全 过程，命名作“高级Marfey法”
如图所示，肽水解所得氨基酸的混合物分成两部 分（sample 1和sample 2)。 Sample 1与FDAA衍生化后，直接用LC/MS分 析，通过衍生物的保留时间和质谱得以确定为何 种氨基酸，如果检测到有非常见氨基酸，其平面 结构可以通过其衍生物的质谱得以阐明。 Sample 2主要用来决定非常见氨基酸的绝对构 型。由于天然存在的肽类往往由D-型或L-型氨基 酸组成，在色谱图上，每个氨基酸给出一个峰， 其绝对构型无法在这一步决定。因此，为了得到 其对映体， Sample 2中的氨基酸必须在适当的 条件下进行外消旋化。但是，与FDAA衍生化及 外消旋化后所得的色谱图变得复杂了，很难发现 一对差向异构体。
在该法中使用了质量色谱。每对差向异构体有 两个峰，在以目标氨基酸衍生物分子离子碎片 的m/z值为检测指标的质量色谱图上可以选择 到这两个峰。 然后，通过比较Sample 1中原峰的保留时间和 Sample 2中新产生峰的保留时间，就可以根据 Marfey法中的洗脱规律来判定绝对构型了。
本法将可购得的氨基酸分为四类：中性 氨基酸、含-OH和酸性氨基酸、碱性和 N-甲基氨基酸，在同样的条件下研究其 分离行为。 FDAA主要与氨基酸上未取代的氨基、 酚羟基、巯基包括N-甲基反应。
如图所示：D-缬氨酸的FDAA衍生物为顺（Z） －式排列，两个疏水性取代基在同侧；L-缬氨 酸的FDAA衍生物为反（E）－式排列，两个 疏水性基团在异侧。
为了确定α－COOH是否对结构的判定必不可 少，文章对氨基酸甲酯和脱－COOH的氨基化 合物的FDAA衍生物进行了研究。
所测氨基酸甲酯及氨基化合物的判定结果如上 表所示，它们的UV谱与母氨基酸的完全相同， 保留时间比母氨基酸长，氨基酸甲酯的判定能 力下降。 另外，丙氨酸甲酯的FDAA衍生物未得判定， 丝氨酸甲酯衍生物显示相反的洗脱顺序。
购得的N-甲基氨基酸，例如丙氨酸、苯丙氨酸、 缬氨酸、亮氨酸和天冬氨酸的N-甲基衍生物， 尽管其保留时间长于各母氨基酸，但其判定能 力要低于母氨基酸。尤其是N-甲基丙氨酸无法 判定， N-甲基天冬氨酸以相反顺序被洗脱出。
综上，FDAA的L-氨基酸衍生物并不总是 先于对应的D-氨基酸衍生物被洗脱下来。 因此，阐明不了分离机制， Marfey 法就 不能用于非常见氨基酸的判定。 此外，实验结果表明以下两点对于洗脱 顺序至关重要：①氨基酸的疏水性；② 在分离过程中FDAA衍生物的构象。
其结构如下：
为了将Marfey法与质谱联用的方法建立起 来，必须解决如下三个问题： （1）解释Marfey法用作色谱技术的分离机制， 及其局限。 （2）如何在没有标准品的情况下有效地将 Marfey法和质谱联系起来，来检测和确定目 标氨基酸。 （3）如何从一个肽类样品的L-或D- 氨基酸中获 得相应的对映异构体
目前酶法和CD法已用于决定氨基酸的绝对 构型，但这些都是直接的方法， 确定一种对映 异构体时需要相对大量的样品及较长的分析时间， 因为在分析之前必须将每种氨基酸分离出来。
另一方面，色谱方法例如GC和HPLC已经 代替这些直接方法广泛使用，氨基酸的绝对构型 是通过衍生化后，在非对映环境下比较对照品氨 基酸的保留时间来决定的，这些色谱学方法的优 点在于分析所用的样品用量少、节省时间，并且 可以同时分析十种以上氨基酸。色谱学方法的缺 点在于需要对照品氨基酸，对于含有非常见氨基 酸的肽类是不适用的。
NO2 NH O NH2
H3C O2N F
氨基酸与Marfey试剂反应所得衍生物用常用的 HPLC进行分离，并在UV340 nm处进行检测。 L-氨基酸衍生物常常先于对应的D-氨基酸衍生物 从柱上洗脱下来，在梯度洗脱的条件下，该方法 能正确地确定氨基酸的绝对构型，并且具有很高 的灵敏度。
因此， Marfey法广泛用于肽类化合物的结构确 证，证实肽类合成中的外消旋作用。 但是，在没有标准品的情况下，将该方法用来分 析含非常见氨基酸的肽类还是很困难的。
每种氨基酸的非对映 异构体对都是通过其 D-异构体的保留时间 (tRD)和L-异构体的保 留时间(tRL)的差值(△t) 来判定的。当△t值大 于±1.0时，每组非对 映异构体对完全被分 离为两个非对映异构 体。 左边的表格显示了四 种氨基酸的两种异构 体保留时间及其差异。
对中性氨基酸已经获得很好的判定，所有L-型非 对映异构体都先于D-型被洗脱下来。随着烃基侧 链增长，判定效率提高，保留时间也会更长（亚 氨基酸和脯氨酸除外）。酪氨酸得到两衍生物， 因为FDAA会引入到－NH2上，也会引入到酚－ OH上。
使用UV（二极管阵列检测器）和NMR方法来 解决该问题（因为，它们易受构象的影响）。
如上图所示，在340和414nm处有特征性最大 吸收，是由二硝基苯上的硝基与氨基酸及L丙氨酰胺的－NH2之间的氢键所形成的发色团 产生的；而且，D-缬氨酸衍生物的UV谱与其 L-型衍生物的相符。所有被测氨基酸的衍生 物显示非常相似的UV谱，脯氨酸和N-甲基氨 基酸除外。尤其是给出相反洗脱顺序的双取 代衍生物及D-和L-鸟氨酸显示了特征的UV谱， 其吸收波长从340nm蓝移到320nm。
对于碱性氨基酸，赖氨酸和鸟氨酸有三种衍生 物：单α-取代、单ω-取代和二取代衍生物； 组氨酸有两种衍生物，单α-取代和双取代衍生 物。它们的单α-取代和双取代可被判定，而单 ω-取代衍生物无法判定，表明α-氨基的衍生 化对于判定是必要的。
但是碱性氨基酸的洗脱规律取决于所选流动相 的PH大小，可能为L D的常规顺序，也可 能相反。赖氨酸和组氨酸的双衍生物显示了正 常的洗脱规律，而鸟氨酸却显示相反的顺序， 尽管它们有较长的保留时间。
Marfey法与质谱联 用技术及其应用
目
录
前言 LC/MS决定氨基酸绝对构型的原理
1. Marfey 法分离机制的探讨 2. Marfey法与质谱的联用 3. 衍生化过程
小 结 应用举例
前
言
常见的确定化合物立体结构的方法有如下几 种： （1）化学转变法； （2）旋光比较法； （3）旋光谱（ORD）和圆二色光谱（CD）； （4）单晶X－射线衍射法； （5）核磁共振法； （6） Marfey法与质谱联用。
这些结果表明，稳定的构象，包括分子内氢 键，形成了一个像蒽一样的三环系统的平面 分子（如下图所示）。
综上，对于L-和D-氨基酸衍生物的判定基于其 疏水性的差异，源于氨基酸和L-丙氨酰胺α－ 碳上两个疏水性取代基的顺／反位置。于是， 顺式排列的FDAA衍生物与ODS作用更强烈， 比反式排列的衍生物有更长的保留时间。 对于大多数氨基酸来说，由于氨基酸侧链取代 基的疏水性往往小于－COOH， D-氨基酸衍生 物具有顺式结构，因此在Marfey 法中L-氨基 酸衍生物往往先于D-氨基酸衍生物出柱。 另有文献证明，氢键的形成对结构的判定也是 很有用的。
L-缬氨酸的FDAA衍生物的NOE实验显示，缬 氨酸的α-质子及L-丙氨酰胺的α-质子与苯环的 H－6之间存在着强烈的NOE，如上图所示； 而H－6与缬氨酸的异丙基和L-丙氨酰胺的甲 基之间没有NOE。另外，D-缬氨酸的FDAA衍 生物与L-衍生物几乎显示相同的NMR行为。 这些结果表明，两α-质子都在空间上位于苯环 H－6的附近，在L-和D-缬氨酸衍生物中均如 此。 由此，缬氨酸和丙氨酰胺的除－NH2以外的其 它取代基均位于垂直于二硝基苯平面的位置上， 在溶液中是稳定的，也是占优势的。
至此，第一个问题已基本得到解决。 由于氨基酸与L-FDAA所得衍生物的热不稳定 性和低疏水性，致使它们对LC/MS分析的敏 感性很差。于是，选择电喷雾离子化和fritFAB作为接口，并发展用 (1-氟-2，4-二硝基 苯基-5)-L-亮氨酰胺，即L-FDLA取代FDAA: (1-氟-2，4-二硝基苯基-5)-L-丙氨酰胺，作为 衍生化试剂，以便将Marfey法和质谱联系起 来。
酸性或含－OH氨基酸的判定相对于中性氨基 酸要难一些。因为其保留时间变短。侧链含有 酰氨基的天冬酰胺、谷氨酰胺比天冬氨酸和谷 氨酸更难判定。在含－OH的氨基酸中，丝氨 酸显示出最差的判定能力，但是高丝氨酸的判 定稍好些，氧甲基丝氨酸显示了与丙氨酸相似 的判定能力。另外，β-OH天冬氨酸的两个非 对映异构体显示相反的洗脱规律，而且它们的 保留时间极短
以上结果也可如下证实，考察用FDPA、 FDVA、FDIA、FDLA和D-FDAA的氨基酸衍 生物的分离行为，如下表所示：
如所预期，随着烃基侧链增长，其保留时间也 增长，判定能力也增强；而D-FDAA的氨基酸 衍生物则显示了相反的洗脱顺序。
本机理有一缺陷，即明确地评价两个功能基 团的疏水性是有困难的，可以考虑用氨基酸 衍生物保留时间的顺序来解释洗脱顺序。因 为在氨基酸中α－COOH是一个常见的功能基 团，而一个氨基酸的FDAA衍生物的疏水性也 决定于该氨基酸的侧链，因此，DL-氨基酸的 tR和洗脱顺序间的关系已如Table1所示。 如Figure4所示，具有常规洗脱顺序（L D） 的D-和L-氨基酸衍生物的tR要比侧链疏水性与 α－COOH相当的氨基酸衍生物的长，例如丝 氨酸和天冬氨酸。
另一方面，具有相反洗脱顺序的氨基酸衍生 物具有相对较短的平均保留时间。
于是，目标氨基酸的洗脱顺序可以用L-和D-氨 基酸衍生物的平均保留时间进行解释。DL-丝 氨酸和天冬酰胺衍生物可被看作临界样品，它 们的平均保留时间位于洗脱顺序的临界点上。 然而，鸟氨酸的二取代衍生物表现出非常有趣 的分离行为，它们的洗脱顺序是相反的，尽管 它们有相对较长的保留时间（27.3min），如 Figure4所示。对这种分离行为的研究正在进 行之中。
1984年，Marfey发明了一种用HPLC来决定氨 基酸绝对构型的方法，该方法基于这样一个原理： 通过手性试剂进行衍生化，将D-和L-氨基酸用 HPLC分离成对映异构体。 于是引入手性试剂FDAA（（1-氟-2，4-二硝基 苯基-5）-L-丙氨酰胺，(1-Fluoro-2，4dinitrophenyl-5)-L-alaninamide ），被命名为 Marfey试剂。