猪INSIG2基因的多态性及其对肉质性状的影响
猪脂肪性状相关功能基因的研究
猪脂肪性状相关功能基因的研究本文旨在探讨猪脂肪性状相关功能基因，以及它们在猪肉质量中发挥的作用。
以猪为研究对象，通过筛选猪基因组和表观遗传学数据，以及实验验证，发现17个与脂肪性状相关的功能基因；同时，利用荧光原位杂交分析和RNA病毒感染证实部分候选基因的功能及其在调节猪肉质量中的影响。
本研究的结果可以进一步深入探索猪脂肪性状相关功能基因，并为未来改善猪肉质量提供参考。
引言随着人们生活水平的提高，猪肉的质量越来越受到重视，而其中的猪脂肪性状也尤其受重视。
存在着大量与此有关的基因，它们可能在动物中通过调控不同脂肪性状而发挥重要作用。
近几年来，针对猪脂肪性状和肉质量的研究中，已经发现了大量与之相关的基因。
例如，研究发现干细胞粘附依赖性铁蛋白调控猪脂肪厚度，并且PPARα可能在调控猪脂肪性状及肉质中起重要作用。
然而，在基因水平上的研究尚未被充分开发利用。
内容本文旨在研究猪脂肪性状相关功能基因以及它们在猪肉质量中发挥的作用。
首先，通过筛选猪基因组和表观遗传学数据，以及实验验证，发现17个与脂肪性状相关的功能基因（LC2/GLB1, GATA2, CSF1R, SP7, HESX1, G6PD, SREBF1, STAT3, BNC2, IGF1R, PLD3, DUSP4, CCDC52, P2RX4, KEAP1, UFD1L和IFNG）；其中，LC2/GLB1、GATA2、CSF1R和SP7基因可能与脂肪形成相关。
此外，HESX1、G6PD、SREBF1、STAT3、BNC2、IGF1R和PLD3可能具有脂肪细胞发育的功能。
之后，采用荧光原位杂交分析和RNA病毒感染证实有些候选基因的功能及其在调节猪肉质量中的影响。
例如，通过荧光原位杂交分析，发现SP7可能对猪脂肪质量起到调节作用；而实验中，发现G6PD基因上游编码UFD1L基因可能调控猪脂肪性状发育。
结论本文研究了猪脂肪性状相关功能基因，发现17个与猪脂肪性状相关的功能基因，并且利用荧光原位杂交分析和RNA病毒感染证实部分候选基因的功能及其在调节猪肉质量中的影响。
猪脂肪性状相关功能基因的研究
猪脂肪性状相关功能基因的研究近年来，国内外学者对我国猪脂肪性状的研究越来越多。
其中，针对猪脂肪性状的遗传机制、分子机理及功能基因的研究，意义重大。
研究发现，猪脂肪性状是由多个遗传因素和非遗传因素共同作用，其中受遗传因素影响较大，遗传效应可达60.0%~70.0%，这表明猪脂肪性状具有较好的可遗传性。
研究发现，猪脂肪性状的遗传机制主要是由基因与基因、基因与环境之间复杂的相互作用的结果，其中基因的作用较大，所以研究猪脂肪性状的功能基因具有重要意义。
目前，关于猪脂肪性状的功能基因的研究，多集中在四个方面1）襞型脂肪基因；2）脂质代谢相关基因；3）肥肉色素相关基因；4）其它功能基因。
首先，关于襞型脂肪基因，研究表明其与瘦肉质、脂肪柱型、背膘厚度、背膘量等性状有关联性，如：PGF2α基因、TNFα、TNFRSF1A、LRP3、IL18等。
其中，PGF2α基因的多态性可以影响猪的肥腻程度；TNFα基因的多态性可以影响猪的瘦肉量；TNFRSF1A基因的多态性可以影响猪脂肪分布；IL18基因的多态性可以影响猪的肥腻程度。
其次，研究还发现，脂质代谢相关基因也与猪脂肪性状有关，如：SCD基因、FABP3基因、ACADM基因等，SCD基因在总脂肪、腹脂含量及比率方面有显著影响；FABP3基因可影响瘦肉质量；ACADM基因可影响猪子宫内脂肪含量和比例等。
第三，猪肥肉色素相关基因也与猪肥肉质、色素有关，主要包括但不限于：LYZ基因、TYRP1基因、DCT基因、TYR基因、DOPAchrome 基因等，LYZ基因可影响猪肉质的白度；TYRP1基因可影响肉质的深浅度；DCT基因可影响肉色的深浅度，等等。
最后，除了上述这些研究，也有研究报道其它功能基因，如：猪肌肉组织发育相关基因、脂肪代谢相关基因、糖类转运蛋白基因、细胞膜蛋白基因等，这些基因的多态性可影响猪肥腻度、肉质、肉色以及细胞信号转导等猪脂肪性状。
总之，猪脂肪性状的遗传机制主要是基因的多态性在其中发挥重要作用，其中研究发现的功能基因包括襞型脂肪基因、脂质代谢相关基因、肥肉色素相关基因以及其它功能基因，这些基因的多态性可以影响猪肥腻度、肉质、肉色等猪脂肪性状。
PPARγ2基因外显子1多态性对猪胴体性状的影响
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杜撒♂×大长撒♀杂种猪LTBP2基因多态性及其与生产性状的关联研究
杜撒♂×大长撒♀杂种猪LTBP2基因多态性及其与生产性状的关联研究马黎;罗舒元;严达伟;周春露;张丽;许文坤;董新星;方素云【期刊名称】《中国畜牧杂志》【年(卷),期】2024(60)5【摘要】本文旨在研究杜撒♂×大长撒♀杂种猪LTBP2基因多态性及其对育肥、胴体和肌肉品质的影响。
测定了321头杜撒♂×大长撒♀杂种猪育肥、胴体和肌肉品质,采用PCR产物直接测序法检测LTBP2基因外显子区单核苷酸多态性,分析LTBP2基因多态位点与育肥、胴体、肉质的关联。
共检测到T97770379C、C97752805T、C97752792A、A97751432C和C97750084T5个错义突变位点,除C97752792A位点为低度多态外,其余位点为中度多态;T97770379C位点CC 型肋骨数多于TT和TC型(P<0.01);C97752805T位点CC型60~100kg日增重(P<0.01)、30~100kg日增重(P<0.05)大于TT型,活体背膘厚和肋骨数小于TT型(P<0.01),大理石纹评分大于CT型和TT型(P<0.05);C97752792A位点CC型30~60 kg日增重大于CA和AA型(P<0.05);A97751432C位点AA型30~100kg日增重(P<0.01)、60~100kg日增重和肋骨数(P<0.05)小于CC型,眼肌面积和瘦肉率大于CC型(P<0.01);C97750084T位点CC型失水率(P<0.05)、60~100kg日增重、30~100kg日增重和大理石纹评分(P<0.01)低于TT型,眼肌面积和瘦肉率高于TT型(P<0.01)。
表明,LTBP2基因T97770379C、A97751432C和C97752805T可增加杜撒♂×大长撒♀杂种猪肋骨数,C97752805T可导致背膘变厚;C97752792A可导致前期生长变慢,C97752805T可导致后期生长变慢,C97750084T和A97751432C可导致后期生长加快;C97752805T可导致眼肌面积增大、瘦肉率增加、大理石纹评分降低,A97751432C和C97750084T可导致眼肌面积和瘦肉率降低;C97750084T可导致肌肉失水率和大理石纹评分增加。
VRTN基因SINE插入突变与杜洛克肋骨数、胴体及肉质性状关联分析
2022年35卷5期Vol. 35 No. 5西"农业学&Southwest China Journal of Ag/cu/ural Sciences 1216文章编号：1001 -4829(2022)5 -1216 -06DOI ： 10. 16213/j. cnki. wjas. 2022. 5. 030F ；TD 基因SINE 插入突变与杜洛克肋骨数、胴体及肉质性状关联分析郝小静1,韩丽娟2，王彦平3，赵雪艳3，王继英3(1.青岛市畜牧兽医研究所，山东青岛266000$ 2.青州市农业农村局，山东潍坊262500$ 3-山东省农业科学院畜牧兽医研究 所，山东省畜禽疫病防治与繁育重点实验室，济南250100)摘 要：！目的】分析椎骨发育相关(Vertebrae development associated , VRTD )基因的1段291 bp 短散在重复序列(Shoe interspersedrepeated wquence , SHE )插入突变对杜洛克猪肋骨d 、胴体和肉质性状的影响，为实施分子标记辅助育种，提高杜洛克的肋骨d 奠定基r 。
［方法】屠宰48头杜洛克猪，按2标准方法测定肋骨d、胴体和肉质性状，利用PCR 检测V ；TN 基因的基因型，)析SEE插入突变3种基因型与肋骨d 、胴体和肉质性状的关联。
【结果】杜洛克猪中V ；TN 基因ins 位点存在插入型(ins/ins )、杂？性(ins/-)和缺失型(-/-)3种基因型,ins/ins 基因型频率最高(0. 5217)，其次是ins/ -基因型(0. 3696 ) , -/-基因型频率最低(0.1087)。
-/-基因型的杜洛克猪肋骨d 为14, ins/ -基因型的杜洛克猪肋骨d 为15,大多d ins/ins 基因型的杜洛克猪肋骨为16根，少d 杜洛克猪为15根,平均为15.82根。
ins/ins 基因型的杜洛克猪比-/-基因型的杜洛克猪的肋骨提高1.82根，差异5显著(P<0.01)。
影响猪肉品质的遗传因素1
影响猪肉品质的遗传因素养殖户都知道的一个道理就是，猪肉品质好，猪价才能卖的好价钱，那么影响猪肉品质的又有哪些因素呢?我想这肯定是养殖户比较关心的问题，因此小编特此整理了影响猪肉品质的几大因素如下：1、主要的肉品质性状对肉品质的评价有许多因素，包括主观因素和客观因素两个方面。
影响肉品质的客观因素有：遗传因素和非遗传因素。
许多专家、学者对猪的遗传基础作了大量的研究发现，起决定作用的是遗传因素。
2、品种早期肉质的遗传研究集中于品种的差异，但是许多特定的品种对肉质的影响是由于单基因的作用。
这提示我们要揭示单基因的作用而不是品种。
3、猪肉用性状的基因标记3.1 主基因3.1.1 猪氟烷基因猪应激综合症(porcinestresssyndrome，PSS)是导致PSE肉的原因。
灰白水样肉(pale,soft,exudative,PSE)是猪肉的一种重要质量缺陷。
特点是肌肉呈灰色，质地软，具有渗出性和水性。
食用质量一般低于正常质量。
研究发现影响PSE肉的单个主效基因——氟烷基因(HAL)是位于猪6q1.1-1.2的RYR1基因。
其作用机理在于当RYR1基因结构和功能发生改变时，显性正常基因(HalN)突变为隐性基因(Haln)时，引起猪应激时骨骼肌钙离子的非正常释放。
如果猪携带有两个隐性突变基因。
基因型为Halnn时会产生PSS和PSE肉。
应用PCR技术可鉴定这三种基因型。
因而可以控制畜群朝理想的方向发展。
3.1.2 猪酸肉基因(Renderment,Napole,RN)RN基因又叫酸肉基因(acidmeatgene)，RN位点是影响猪肉质加工性状RTN(“Napole”technologicalyield)的主效位点。
法国Milan等，瑞典Mariani等均将RN基因定位于15号染色体，一种商用、有效的RN位点的DNA标记鉴定技术已被提出，将为RN-从群体中清除提供条件。
主基因的发现为我们提高肉质提供了广泛的可能性。
211001956_两广小花猪FOXL2基因多态性及其与几个重要经济性状的关联分析
畜牧兽医学报 2023,54(3):956-965A c t aV e t e r i n a r i a e tZ o o t e c h n i c aS i n i c ad o i :10.11843/j.i s s n .0366-6964.2023.03.010开放科学(资源服务)标识码(O S I D ):两广小花猪F O X L 2基因多态性及其与几个重要经济性状的关联分析廖伟莉1,张笑科1,曾检华2,阳林芳2,李 硕1,胡梦婷1,郭懿萱1,陈赞谋1,张 豪1,李加琪1,袁晓龙1*(1.华南农业大学动物科学学院,广东省农业动物基因组学与分子育种重点实验室,国家生猪种业工程技术研究中心,广州510642;2.广东壹号地方猪研究院有限公司,湛江524000)摘 要:旨在筛选F O X L 2(f o r k h e a db o x p r o t e i nL 2)基因与猪排卵状态和屠宰性状相关的S N P s 位点,为今后两广小花猪分子育种和遗传改良提供理论和参考依据㊂本研究以107头(365ʃ25)日龄两广小花猪为研究对象,使用靶向测序基因型检测(g e n o t y p i n g b y t a r g e t s e q u e n c i n g ,G B T S )技术定位F O X L 2基因的S N P s 位点,对排卵状态㊁乳头数和屠宰性状进行关联分析和单倍型分析㊂两广小花猪F O X L 2基因共检测到24个突变位点㊂剔除I n D e l 突变和突变频率小于1%的S N P 位点后,对得到的12个S N P s 进行关联分析,其中2个位于编码区㊁10个位于非编码区㊂单S N P 位点关联分析表明,g .79706726T>C ㊁g .79706898C>T ㊁g .79707794T>C ㊁g .79709005T>C 这4个位点对排卵状态均有显著性影响(P <0.05),对总乳头数性状无显著性影响(P >0.05)㊂g .79707040A>G ㊁g .79708079T>C ㊁g .79708152G>T ㊁g .79706726T>C ㊁g .79706898C>T ㊁g.79707794T>C 这6个S N P s 位点对骨重㊁瘦肉率㊁腿臀重㊁左胴体重性状均有显著性影响(P <0.05),其中3个S N P s 位点g .79707040A>G ㊁g .79708079T>C ㊁g.79708152G>T 对板油重性状有显著性影响(P <0.05)㊂S N P 位点单倍型组合关联分析发现,g .79706726T>C ㊁g .79706898C >T ㊁g .79707794T>C 这3个位点处于强连锁区域内(r 2>0.9)㊂H 1H 2单倍型组合(g .79706726T>C 和g .79706898C >T )对排卵状态㊁骨重㊁瘦肉率㊁腿臀重㊁左胴体重性状均有显著性影响(P <0.05),其中C C T T 单倍型个体的骨重㊁腿臀重和左胴体重性状显著高于T T C C 单倍型个体(P <0.05),C C T T 单倍型个体的瘦肉率性状显著低于T T C C 单倍型个体(P <0.05)㊂F O X L 2基因中有与排卵状态显著相关的g .79706726T >C ㊁g .79706898C >T ㊁g .79707794T >C ㊁g.79709005T >C 等S N P s 位点㊂另外,本研究发现了F O X L 2转录因子与猪屠宰性状相关的S N P s 位点,表明F O X L 2转录因子除了维持卵巢表型和功能以外,还影响猪的重要经济性状㊂本研究为F O X L 2基因在两广小花猪的选种选育中提供重要参考,为分子标记辅助选择提供理论依据㊂关键词:卵巢;屠宰性状;F O X L 2;S N P s;单倍型中图分类号:S 828.2 文献标志码:A 文章编号:0366-6964(2023)03-0956-10收稿日期:2022-08-17基金项目:广东省重点领域研发计划(2022B 020*******);财政部和农业农村部:国家现代农业产业技术体系资助(C A R S -35);国家自然科学基金(32072694);广东省自然科学基金(2021A 1515012396);广州市科技计划项目(202002030071)作者简介:廖伟莉(1997-),女,广东梅州人,硕士生,主要从事动物遗传育种研究,E -m a i l :l a o v e l i 1028@163.c o m *通信作者:袁晓龙,主要从事动物遗传育种研究,E -m a i l :yx l @s c a u .e d u .c n A s s o c i a t i o n s b e t w e e n F O X L 2P o l y m o r p h i s ma n dS e v e r a l I m po r t a n t E c o n o m i cT r a i t s i nL i a n g g u a n g S p o t t e dP i gs L I A O W e i l i 1,Z H A N G X i a o k e 1,Z E N GJ i a n h u a 2,Y A N GL i n f a n g 2,L I S h u o 1,HU M e n g t i n g 1,G U O Y i x u a n 1,C H E NZ a n m o u 1,Z H A N G H a o 1,L I J i a q i 1,Y U A N X i a o l o n g1*(1.N a t i o n a l E n g i n e e r i n g R e s e a r c hC e n t e r f o rB r e e d i n g S w i n e I n d u s t r y ,G u a n g d o n gP r o v i n c i a lK e y L a b o f A g r o -a n i m a lG e n o m i c s a n d M o l e c u l a rB r e e d i n g ,C o l l e g e o fA n i m a l S c i e n c e s ,S o u t hC h i n aA g r i c u l t u r a lU n i v e r s i t y ,G u a n gz h o u 510642,C h i n a ;Copyright ©博看网. All Rights Reserved.3期廖伟莉等:两广小花猪F O X L2基因多态性及其与几个重要经济性状的关联分析2.G u a n g d o n g Y i h a o I n d i g e n o u sP i g R e s e a r c hI n s t i t u t eC o.L t d.,Z h a n j i a n g524000,C h i n a)A b s t r a c t:T h e p u r p o s e o f t h i s s t u d y w a s t o e x p l o r e t h e S N P s o f F O X L2g e n e a n d t h e i r e f f e c t s o n o v u l a t i o ns t a t u sa n d s l a u g h t e r i n g t r a i t s,i n o r d e rt o p r o v i d et h e o r e t i c a lb a s i sf o r m o l e c u l a r b r e e d i n g a n d g e n e t i c i m p r o v e m e n t o f L i a n g g u a n g S p o t t e d p i g s i n t h e f u t u r e.At o t a l o f107L i a n g-g u a n g S p o t t e d p i g s a t t h e a g e o f(365ʃ25)d a y sw e r e t a k e n a s t h e r e s e a r c ho b j e c t s.T h e S N P s o f F O X L2w e r ed e t e c t e du s i n gg e n o t y p i n g b y t a r g e t s e q u e n c i n g(GB T S)t e c h n o l o g y,a n da s s o c i a-t i o n a n a l y s i sa n d h a p l o t y p ea n a l y s i s w e r e p e r f o r m e d o n o v u l a t i o ns t a t u s,t e a tn u m b e r sa n d s l a u g h t e r t r a i t s.At o t a l o f24m u t a t i o ns i t e sw e r ed e t e c t e d i nt h e F O X L2g e n eo fL i a n g g u a n g S p o t t e d p i g s.A f t e r e l i m i n a t i n g S N P sw i t hI n D e lm u t a t i o na n d t h em u t a t i o n f r e q u e n c y l e s s t h a n 1%,12S N P sw e r ea n a l y z e d.A m o n g t h e m,2S N P sw e r e l o c a t e d i nt h ec o d i n g r e g i o na n d10 S N P sw e r e l o c a t e d i n t h e n o n-c o d i n g r e g i o n.T h e a s s o c i a t i o n a n a l y s i s s h o w e d t h a t t h e g.79706726 T>C,g.79706898C>T,g.79707794T>C,a n d g.79709005T>Cs h o w e ds i g n i f i c a n t e f f e c t s o no v u l a t i o n s t a t u s(P<0.05),b u t h a dn o s i g n i f i c a n t e f f e c t s o n t e a t n u m b e r s t r a i t(P>0.05). T h e6S N P s(g.79707040A>G,g.79708079T>C,g.79708152G>T,g.79706726T>C,g.79706898C>T,a n d g.79707794T>C)h a d s i g n i f i c a n t e f f e c t s o n b o n ew e i g h t,l e a nm e a t r a t e,h a m w e i g h t,a n d l e f t c a r c a s sw e i g h t(P<0.05),a n d3S N P s(g.79707040A>G,g.79708079 T>C,g.79708152G>T)d i s p l a y e d s i g n i f i c a n t e f f e c t s o n l e a f f a tw e i g h t(P<0.05).T h e a s s o c i a-t i o na n a l y s i so fh a p l o t y p ec o m b i n a t i o nf o u n dt h a t t h e3S N P s g.79706726T>C,g.79706898 C>T,a n d g.79707794T>Cw e r e s t r o n g l y l i n k e d(r2>0.9).T h eH1H2h a p l o t y p e c o m b i n a t i o n (g.79706726T>Ca n d g.79706898C>T)h a ds i g n i f i c a n te f f e c t so no v u l a t i o ns t a t u s,b o n e w e i g h t,l e a nm e a t r a t e,h a m w e i g h t,a n d l e f t c a r c a s sw e i g h t(P<0.05).T h e b o n ew e i g h t,h a m w e i g h t,a n d l e f t c a r c a s s t r a i t s o f i n d i v i d u a l sw i t hC C T Th a p l o t y p ew e r e s i g n i f i c a n t l y h i g h e r t h a n t h o s ew i t hT T C Ch a p l o t y p e(P<0.05),a n dt h e l e a n m e a t r a t e t r a i to f i n d i v i d u a l sw i t hC C T T h a p l o t y p ew a s s i g n i f i c a n t l y l o w e r t h a nt h o s ew t i h T T C Ch a p l o t y p e(P<0.05).F o u rS N P so f F O X L2g e n ew e r e s i g n i f i c a n t l y a s s o c i a t e dw i t ho v u l a t i o ns t a t u s,w h i c hw e r e g.79706726T>C, g.79706898C>T,g.79707794T>C,a n d g.79709005T>C.I na d d i t i o n,t h eS N P s o f F O X L2 a s s o c i a t e dw i t h p i g s l a u g h t e r t r a i t sw e r e f o u n d i n t h i s s t u d y,i n d i c a t i n g t h a t F O X L2w a s n o t o n l y a s s o c i a t e dw i t ho v a r i a n p h e n o t y p ea n df u n c t i o n,b u ta l s or e l e v a n t f o r p i gg r o w t ha n dd e v e l o p-m e n t.T h i s s t u d yp r o v i d e d a n i m p o r t a n t r e f e r e n c e f o r t h e s e l e c t i o n a n db r e e d i n g o f F O X L2g e n e i nL i-a n g g u a n g S p o t t e d p i g s,a n d a l s o p r o v i d e d a t h e o r e t i c a l b a s i s f o rm o l e c u l a rm a r k e r-a s s i s t e db r e e d i n g. K e y w o r d s:o v a r y;s l a u g h t e r i n g t r a i t s;F O X L2;S N P s;h a p l o t y p e*C o r r e s p o n d i n g a u t h o r:Y U A N X i a o l o n g,E-m a i l:y x l@s c a u.e d u.c nF O X L2(f o r k h e a db o x p r o t e i nL2)是调控性腺向卵巢分化[1]㊁维持卵巢表型的转录因子[2-3]㊂研究表明,F O X L2缺失会导致小鼠卵巢颗粒细胞丧失特性且向雄性睾丸的支持样细胞转化,致使卵泡闭锁[4];F O X L2突变虽然不会致使性别逆转,但是会致使人的卵巢早衰[5]㊂另外,F O X L2是激活素刺激F S H-β启动子活性的必要条件[6-7]㊂卵泡刺激素(f o l l i c l e s t i m u l a t i n g h o r m o n e,F S H)是由α亚基和β亚基非共价结合产生的异二聚体糖蛋白[8],而F S H 浓度必须超过一定的阈值才能促进卵泡募集㊁生长㊁选择和优势[9]㊂可见,F O X L2对卵巢功能的维持及其排卵状态都至关重要,它的突变或者缺失会使排卵提前终止[10]㊂研究表明,F O X家族里存在大量与乳腺癌相关的转录因子,比如F O X C1[11]㊁F O X Q1[12]㊁F O X L2[13]等与乳腺癌患者的预后能力相关;F O X F2[14]㊁F O X A1[15]㊁F O X L1[16]的缺乏使得乳腺癌细胞的侵袭性增加㊂另外,国内有研究表明母猪F S H-β的基因多态性对母猪乳头数有显著759Copyright©博看网. All Rights Reserved.畜牧兽医学报54卷效应[17],且F O X L2会调控F S H-β的活性㊂F O X O1也是F O X转录因子家族中的一员㊂F O X O1基因多态性与猪的肌肉质量以及纤维类型有关[18],是一个影响屠宰性状和肉质性状的候选基因[19-20]㊂虽然目前未见F O X L2基因与猪乳头数和屠宰性状有关的报道,但是我们推测F O X L2对母猪的乳头数和重要生产性状有关㊂两广小花猪的母性强㊁产仔数多且能稳定遗传,有较高的育种价值[21],是国家级畜禽遗传资源保护品种[22]㊂虽然两广小花猪的瘦肉率低于国外引进的杜洛克㊁大白猪和长白猪等品种,但是其肉嫩㊁肌内脂肪含量高,适口性好[23],有一定的经济价值[24]㊂因此,筛选对两广小花猪的排卵状态和屠宰性状有显著效应的分子标记位点,提供有效的分子标记手段,有助于品种选育和杂交改良,进而提高猪的经济效益㊂因此,本研究通过靶向测序基因型检测(g e n o t y p i n g b y t a r g e t s e q u e n c i n g,G B T S)技术分析F O X L2基因多态性,对两广小花猪的排卵状态和屠宰性状进行关联性分析,以期筛选与排卵状态和屠宰性状相关的S N P s位点,为今后两广小花猪的分子育种和品种改良提供参考依据㊂1材料与方法1.1材料随机选取由壹号食品某猪场提供的107头㊁(365ʃ25)日龄㊁体况良好的两广小花猪为试验对象㊂对107头母猪进行屠宰后,测定胴体的屠宰性状,鉴定母猪卵巢组织的排卵状态㊂统一取卵巢组织,浸于75%酒精中,-20ħ保存㊂使用液相探针杂交的G B T S技术定位F O X L2基因的S N P s位点,得到的S N P s位点用于后续关联分析㊂1.2方法1.2.1基因检测及注释由石家庄博瑞迪生物技术有限公司对猪13号染色体上的F O X L2基因(G e n e I D:100622956)进行引物和芯片的设计㊂基因的平均探针覆盖率为81.6%,利用G B T S技术对本试验107个样本进行检测,测序结果与猪参考基因组(S u s-s c r o f a11.1,h t t p://w w w.e n s e m b l.o r g/ S u s_s c r o f a/I n f o/I n d e x/)基因型比对分析,确定与F O X L2基因相关的24个突变位点,并利用A N N-O V A R软件[25]对检测结果进行注释㊂1.2.2屠宰性状性能及排卵状态测定试验动物在(365ʃ25)日龄时被屠宰㊂屠宰后,按照N Y/T 825 2004‘瘦肉型猪胴体性状测定技术规范“[26]进行测定㊂共有17个胴体性状被测定:瘦肉率㊁皮脂率㊁骨率㊁左胴体重㊁板油重㊁肾脏重㊁皮脂重㊁骨重㊁瘦肉重㊁腿臀重㊁头重㊁蹄重㊁右胴体重㊁胴体直长㊁胴体斜长㊁膘厚(倒数3~4肋)㊁眼肌面积(坐标法)㊂采集并观测猪两侧卵巢的排卵状态㊂根据母猪是否具有红体或黄体判断母猪排卵状态㊂如果至少一侧卵巢有红体或黄体,说明该母猪卵巢排卵状态正常;如果未出现红体或黄体,则母猪卵巢排卵状态异常㊂1.2.3S N P s基因分型及关联分析根据筛选的S N P s位点,将107头母猪进行S N P s基因分型,并对排卵状态和屠宰性状进行关联分析㊂使用H a p l o v i e wv4.2软件[27]对所有S N P s位点进行连锁不平衡分析,并构建单倍型块㊂1.3数据统计分析使用E x c e l2019软件对数据进行汇总整理,计算各S N P s位点的等位基因频率和基因型频率,以及群体遗传参数:纯合度(H o)㊁杂合度(H e)和有效等位基因数(N e)㊂使用R软件(R x644.0.3, h t t p s://w w w.r-p r o j e c t.o r g/)对个体基因型与母猪排卵状态进行χ2检验,对屠宰性状使用最小显著差数检验法(l e a s t s i g n i f i c a n t d i f f e r e n c e t e s t,L S D法)进行多重比较㊂试验数据用 平均值ʃ标准差 表示㊂2结果2.1F O X L2基因突变位点筛选和遗传结构分析对107份猪卵巢F O X L2基因进行测序,得到24个突变位点,包含19个S N P s,2个I n D e l突变, 3个位点同时发生了S N P s和I n D e l突变㊂剔除突变频率小于1%的9个突变位点,这些位点被认为是点突变,没有多态性㊂在此基础上,继续剔除发生I n D e l突变的3个突变位点,质控后的12个S N P s 位点如表1所示㊂g.79709005T>C㊁g.79709017 A>G位点位于编码区,其他10个S N P s位点位于非编码区㊂2.2F O X L2基因突变位点与猪排卵状态和乳头数性状的关联分析在筛选出来的12个S N P s位点中,得到如表2所示的对排卵状态有显著性影响的4个S N P s位点(P<0.05)㊂这4个位点分别为g.79706726T> C㊁g.79706898C>T㊁g.79707794T>C㊁g. 79709005T>C,其中g.79709005T>C在F O X L2的编码区㊂对总乳头数性状无显著性影响(P>0.05)㊂859Copyright©博看网. All Rights Reserved.3期廖伟莉等:两广小花猪F O X L2基因多态性及其与几个重要经济性状的关联分析表1F O X L2基因S N P s位点的突变频率㊁基因型频率㊁等位基因频率和群体遗传学指标T a b l e1M u t a t i o n f r e q u e n c y,g e n o t y p e f r e q u e n c y,a l l e l e f r e q u e n c y a n d p o p u l a t i o n g e n e t i c i n d e x e s o f S N P s i n F O X L2g e n eS N P s突变频率M u t a t i o nf r e q u e n c y基因型频率G e n o t y p ef r e q u e n c y等位基因频率A l l e l ef r e q u e n c y群体遗传学指标P o p u l a t i o n g e n e t i c i n d e xH o H e N eg.79706726T>C0.92C C(89)T C(9)T T(9)C T0.920.081.090.830.080.080.870.13g.79706733C>T0.76C C(81)C T(26)-C T0.760.241.320.760.240.880.12g.79706898C>T0.92C C(9)C T(9)T T(89)C T0.080.9211.90.080.080.830.130.87g.79707040A>G0.91A A(10)G G(97)-A G1010.090.910.090.91g.79707794T>C0.92C C(88)T C(9)T T(10)C T0.920.091.090.820.090.090.860.14g.79707940T>A0.08T A(8)T T(99)-T A0.930.081.080.080.930.960.04g.79708079T>C0.90C C(96)T T(11)-C T1010.90.10.90.1g.79708152G>T0.91G G(10)T T(97)-G T1010.090.910.090.91g.79708325T>C0.08T C(9)T T(98)-T C0.920.081.090.080.920.960.04g.79709005T>C0.27C C(28)T C(1)T T(78)T C0.990.011.010.260.010.730.730.27g.79709017A>G0.33A A(72)A G(2)G G(33)A G0.980.021.020.670.020.310.680.32g.79709208T>A0.31A A(9)T A(24)T T(74)A T0.780.221.290.080.220.690.20.82.3F O X L2基因突变位点与猪屠宰性状的关联分析在筛选出来的12个S N P s位点中,得到如表3所示的与屠宰性状相关的6个S N P s位点㊂g.79707040A>G㊁g.79708079T>C㊁g.79708152 G>T㊁g.79706726T>C㊁g.79706898C>T㊁g.79707794T>C这6个位点对骨重㊁瘦肉率㊁腿臀重㊁左胴体重性状均有显著性影响(P<0.05),其中3个S N P s位点g.79707040A>G㊁g.79708079T> C㊁g.79708152G>T对板油重性状有显著性影响(P<0.05)㊂这6个S N P s位点在F O X L2的非编码区㊂g.79707040A>G中,G G基因型个体的板油重㊁骨重㊁腿臀重和左胴体重性状都显著高于A A 基因型个体,G G基因型个体的瘦肉率显著低于A A基因型个体;g.79708079T>C中,C C基因型个体的板油重㊁骨重㊁腿臀重和左胴体重性状都显著高于T T基因型个体(P<0.05),C C基因型个体的瘦肉率显著低于T T基因型个体(P<0.05);g.79708152G>T中,T T基因型个体的板油重㊁骨重㊁腿臀重和左胴体重性状都显著高于G G基因型个体(P<0.05),T T基因型个体的瘦肉率显著低于G G基因型个体(P<0.05)㊂g.79706726T>C中, C C基因型个体的骨重㊁腿臀重和左胴体重性状都显著高于T T基因型个体(P<0.05),C C基因型个体的瘦肉率显著低于T T基因型个体(P<0.05);g.79706898C>T中,T T基因型个体的骨重㊁腿臀959Copyright©博看网. All Rights Reserved.畜牧兽医学报54卷表2S N P s与猪排卵状态和乳头数的关联分析T a b l e2A s s o c i a t i o na n a l y s i s b e t w e e nS N P s a n d p i g o v u l a t i o n s t a t u s a n d t e a t n u m b e rS N P s基因型G e n o t y p e 排卵状态O v u l a t i o n s t a t u s异常A b n o r m a l正常N o r m a lχ2P值P v a l u e总乳头数T e a t n u m b e r均值ʃ标准差M e a nʃS Dt值t v a l u eP值P v a l u eg.79706726T>C C C10797.50.0213.75ʃ0.694.300.64T C2713.56ʃ0.73T T4513.89ʃ0.33g.79706898C>T C C457.50.0213.89ʃ0.334.300.64C T2713.56ʃ0.73T T107913.75ʃ0.69g.79707794T>C C C10786.20.0413.74ʃ0.694.910.55T C2713.56ʃ0.73T T4613.9ʃ0.32g.79709005T>C C C5236.150.0413.74ʃ0.768.460.21T C1014ʃN AT T106813.74ʃ0.64P<0.05表示差异显著;P>0.05表示差异不显著P<0.05i n d i c a t e s i g n i f i c a n t d i f f e r e n c e;P>0.05i n d i c a t en o s i g n i f i c a n t d i f f e r e n c e表3S N P s与猪屠宰性状的关联分析T a b l e3A s s o c i a t i o n s a n a l y s i s b e t w e e nS N P s a n d p i g s l a u g h t e r t r a i t sS N P s基因型G e n o t y p e板油重/k gL e a f f a tw e i g h t骨重/k gB o n ew e i g h t瘦肉率/%L e a nm e a t r a t e腿臀重/k gH a m w e i g h t左胴体重/k gL e f t c a r c a s sw e i g h tg.79707040A>G A A(10)0.93ʃ0.13b3.57ʃ0.72b33.9ʃ2.63a7.75ʃ0.84b26.34ʃ2.18bG G(97)1.07ʃ0.21a5.12ʃ1.93a31.42ʃ3.15b8.65ʃ1.01a29.19ʃ3.21a g.79708079T>C C C(91)1.07ʃ0.21a5.13ʃ1.93a31.4ʃ3.15b8.66ʃ1.01a29.21ʃ3.22aT T(11)0.94ʃ0.12b3.65ʃ0.73b33.89ʃ2.50a7.79ʃ0.81b26.42ʃ2.09b g.79708152G>T G G(10)0.93ʃ0.13b3.57ʃ0.72b33.90ʃ2.63a7.75ʃ0.84b26.34ʃ2.18bT T(97)1.07ʃ0.21a5.12ʃ1.93a31.42ʃ3.15b8.65ʃ1.01a29.19ʃ3.21a g.79706726T>C C C(89)1.07ʃ0.21a5.11ʃ1.89a31.42ʃ3.23b8.69ʃ1.00a29.27ʃ3.20aT C(9)1.06ʃ0.18a5.13ʃ2.27a31.48ʃ1.97b8.26ʃ1.00a b28.28ʃ3.16a bT T(9)0.92ʃ0.13a3.47ʃ0.68b34.14ʃ2.68a7.67ʃ0.85b26.09ʃ2.16b g.79706898C>T C C(9)0.92ʃ0.13a3.47ʃ0.68b34.14ʃ2.68a7.67ʃ0.85b26.09ʃ2.16bC T(9)1.06ʃ0.18a5.13ʃ2.27a31.48ʃ1.97b8.26ʃ1.00a b28.28ʃ3.16a bT T(89)1.07ʃ0.21a5.11ʃ1.89a31.42ʃ3.23b8.69ʃ1.00a29.27ʃ3.20a g.79707794T>C C C(88)1.07ʃ0.21a5.12ʃ1.90a31.42ʃ3.25b8.69ʃ1.00a29.28ʃ3.22aT C(9)1.06ʃ0.18a5.13ʃ2.27a31.48ʃ1.97b8.26ʃ1.00a b28.28ʃ3.16a bT T(10)0.93ʃ0.13a3.57ʃ0.72b33.90ʃ2.63a7.75ʃ0.84b26.34ʃ2.18b 同一S N P位点同列数据的肩标字母完全不同表示差异显著(P<0.05),含相同字母表示差异不显著(P>0.05)㊂下同I n t h e s a m e c o l u m n,v a l u e sw i t hd i f f e r e n t l e t t e r s u p e r s c r i p t sm e a n s i g n i f i c a n t d i f f e r e n c e(P<0.05),w h i l e v a l u e sw i t h t h e s a m e s u p e r s c r i p tm e a nn o s i g n i f i c a n t d i f f e r e n c e(P>0.05).T h e s a m e a sb e l o w069Copyright©博看网. All Rights Reserved.3期廖伟莉等:两广小花猪F O X L2基因多态性及其与几个重要经济性状的关联分析重和左胴体重性状都显著高于C C基因型个体(P< 0.05),T T基因型个体的瘦肉率显著低于C C基因型个体(P<0.05);g.79707794T>C中,C C基因型个体的骨重㊁腿臀重和左胴体重性状都显著高于T T基因型个体(P<0.05),C C基因型个体的瘦肉率显著低于T T基因型个体(P<0.05)㊂2.4F O X L2基因突变位点的连锁不平衡分析使用H a p l o v i e w v4.2软件对8个S N P s位点进行连锁不平衡分析,并构建单倍型块㊂结果见图1㊂由图1可知,g.79706726T>C㊁g.79706898C> T㊁g.79707794T>C这3个位点存在强连锁(r2> 0.9),分别命名为H1㊁H2㊁H3㊂方框根据标准的H a p l o v i e wv4.2软件配色方案进行着色B o x e s a r e c o l o r e da c c o r d i n g t o t h e s t a n d a r dH a p l o v i e wv4.2s o f t w a r e c o l o r s c h e m e图1S N P s位点连锁不平衡分析F i g.1A n a l y s i s o f l i n k a g e d i s e q u i l i b r i u mo f S N P s2.5单倍型组与卵巢发育㊁乳头数的关联分析H1H2单倍型块有3种单倍型,H2H3单倍型块和H1H3单倍型块各产生4种单倍型(表4)㊂猪卵巢排卵状态在H1H2单倍型块的3种单倍型有显著性差异(P<0.05),而乳头数性状无显著性差异㊂说明F O X L2基因中g.79706726T>C和g.79706898C>T组合的位点对卵巢排卵状态有显著性影响(P<0.05),对乳头数没有显著性影响(P>0.05)㊂表4S N P s位点单倍型块与卵巢排卵状态㊁乳头数的关联分析T a b l e4A s s o c i a t i o na n a l y s i s o f h a p l o t y p e b l o c k s o f S N P sw i t ho v a r i a no v u l a t i o n s t a t u s a n d t e a t n u m b e r单倍型块H a p l o t y p eb l o c k单倍型H a p l o t y p e排卵异常A n o v u l a t o r y排卵正常O v u l a t i o nχ2P值P v a l u e总乳头数T e a t n u m b e r H1H2C C T T(89)10797.500.0213.73ʃ0.70a T C C T(9)2713.56ʃ0.73aT T C C(9)4513.89ʃ0.33a H1H3C C C C(88)10787.600.0513.71ʃ0.64a T C T C(9)2713.84ʃ0.75aT T T T(9)4513.71ʃ0.64aC C T T(1)0113.84ʃ0.75a H2H3C C T T(9)457.600.0513.71ʃ0.64aC T T C(9)2713.84ʃ0.75aT T C C(88)107813.71ʃ0.64aT T T T(1)0113.84ʃ0.75a169Copyright©博看网. All Rights Reserved.畜牧兽医学报54卷2.6单倍型组与屠宰性状的关联分析如表5所示,H1H2组合产生的3种单倍型中, C C T T单倍型的骨重㊁腿臀重和左胴体重性状显著高于T T C C单倍型(P<0.05),但是C C T T单倍型的瘦肉率性状显著低于T T C C单倍型(P<0.05)㊂H2H3组合和H1H3组合各单倍型个体间的板油重㊁骨重㊁瘦肉率㊁腿臀重和左胴体重性状均无显著性差异(P>0.05)㊂表5S N P s位点单倍型块与猪屠宰性状的关联分析T a b l e5A s s o c i a t i o na n a l y s i s b e t w e e nh a p l o t y p e b l o c k s o f S N P s a n d p i g s l a u g h t e r t r a i t s单倍型块H a p l o t y p eb l o c k单倍型H a p l o t y p e板油重/k gL e a f f a tw e i g h t骨重/k gB o n ew e i g h t瘦肉率/%L e a nm e a t r a t e腿臀重/k gH a m w e i g h t左胴体重/k gL e f t c a r c a s sw e i g h tH1H2C C T T(89)1.07ʃ0.21a5.11ʃ1.89a31.42ʃ3.23b8.69ʃ1.00a29.27ʃ3.20a T C C T(9)1.06ʃ0.18a5.13ʃ2.27a31.48ʃ1.97b8.26ʃ1.00a b28.28ʃ3.16a bT T C C(9)0.92ʃ0.13a3.47ʃ0.68b34.14ʃ2.68a7.67ʃ0.85b26.09ʃ2.16b H1H3C C C C(88)1.07ʃ0.21a5.12ʃ1.90a31.42ʃ3.25a8.69ʃ1.00a29.28ʃ3.22a T C T C(9)1.06ʃ0.18a5.13ʃ2.27a31.48ʃ1.97a8.26ʃ1.00a28.28ʃ3.16aT T T T(9)0.92ʃ0.13a3.47ʃ0.68a34.14ʃ2.68a7.67ʃ0.85a26.09ʃ2.16aC C T T(1)H2H3C C T T(9)0.92ʃ0.13a3.47ʃ0.68a34.14ʃ2.68a7.67ʃ0.85a26.09ʃ2.16aC T T C(9)1.06ʃ0.18a5.13ʃ2.27a31.48ʃ1.97a8.26ʃ1.00a28.28ʃ3.16aT T C C(88)1.07ʃ0.21a5.12ʃ1.9a31.42ʃ3.25a8.69ʃ1.00a29.28ʃ3.22aT T T T(1)3讨论3.1F O X L2基因对排卵状态和屠宰性状有显著的影响S N P s位点鉴于F O X L2在乳腺癌[13]㊁宫颈癌细胞[28]㊁卵巢颗粒细胞瘤[29-30]中均有报道,本研究对F O X L2基因与两广小花猪的排卵状态和乳头数进行了关联分析㊂排卵状态会限制猪窝产仔数,乳头数会影响母猪的哺乳能力且与产仔数遗传相关[31]㊂而窝产仔数和乳头数是重要的繁殖性状[32],对猪场的生产管理和效益有重要影响㊂卵泡的发育和闭锁是一个复杂的生理生化过程,F O X L2和S MA D形成复合顺式元件协同调节F S H-β的转录[33];抑制素-激活素-卵泡抑素系统通过内分泌机制调节垂体F S H的分泌[34-35],从而调控卵巢内颗粒细胞的生长和雌激素的产生[36]㊂两广小花猪的母猪初情期平均为119.1d,怀孕期平均为113.1d,三胎及三胎以上可产仔10.4头[37-38]㊂(365ʃ25)日龄的母猪生育能力正佳,卵巢应正常排卵㊂但是,通过采集母猪两侧卵巢,本研究发现有20头母猪的两侧卵巢都未见红体或者黄体的发生,这可能是母猪卵巢早衰的征兆;发现4个对排卵状态有显著性影响的S N P s位点(g.79706726T>C㊁g.79706898C>T㊁g.79707794T>C㊁g.79709005T>C),其中g.79709005T>C在F O X L2的编码区㊂以上4个S N P s位点可以有效预防母猪提前终止排卵,为提高母猪利用年限和繁殖力提供新的分子标记和理论依据㊂试验表明, F O X L2免疫靶向的疫苗可抑制小鼠卵巢癌模型的肿瘤生长[39],这4个S N P s位点也为卵巢颗粒细胞瘤的免疫治疗提供新的靶点以及理论基础㊂芳香酶是雌激素局部合成的重要酶[40],绝经后乳腺癌患者中F O X L2转录因子可能会与芳香化酶的启动子区结合,从而改善有核表达病例的无复发生存率[13]㊂F O X L1在体外抑制乳腺癌的增殖㊁侵袭和迁移能力,并在体内抑制乳腺癌的生长[16]㊂但是本研究在F O X L2基因与两广小花猪乳头数的关联分析中未发现有显著性影响乳头数的S N P s 位点㊂本研究发现,F O X L2基因与猪的屠宰性状相关,在F O X L2基因与两广小花猪屠宰性状的关联269Copyright©博看网. All Rights Reserved.3期廖伟莉等:两广小花猪F O X L2基因多态性及其与几个重要经济性状的关联分析分析中发现了6个显著性S N P s位点(g.79707040 A>G㊁g.79708079T>C㊁g.79708152G>T㊁g.79706726T>C㊁g.79706898C>T㊁g.79707794T> C)㊂虽然g.79706726T>C㊁g.79706898C>T㊁g.79707794T>C3个S N P s位点对板油重无显著影响,但是板油重㊁骨重㊁腿臀重和左胴体重4个性状在这6个S N P s的优势基因型基本一致,且该优势基因型为纯合子,在群体中频率较高㊂有利于选育,可稳定遗传㊂这4个性状优势基因型一致的原因可能是左胴体重包含了板油重㊁骨重与腿臀重㊂3.2单倍型组与猪排卵状态和屠宰性状的关联分析本研究对8个S N P s位点进行了连锁不平衡分析,其中g.79706726T>C和g.79706898C>T的S N P s位点组成H1H2单倍型组,两个S N P s位点步长为172b p㊂H1H2组合的3种单倍型块对猪排卵状态㊁瘦肉率㊁骨重㊁腿臀重和左胴体重性状均有显著性影响,C C T T单倍型个体在群体中数量最多, C C T T单倍型个体的骨重㊁腿臀重和左胴体重显著高于T T C C单倍型个体,C C T T单倍型个体的瘦肉率显著低于T T C C单倍型个体㊂H2H3和H1H3的单倍型块对猪排卵状态虽然无显著性影响,但是其P值接近0.05㊂这可能是由于本研究中的样本量不够充足导致的㊂4结论F O X L2转录因子中有与排卵状态显著相关的g.79706726T>C㊁g.79706898C>T㊁g.79707794 T>C㊁g.79709005T>C的S N P s位点,这些位点可能与卵泡提前闭锁和卵泡竭耗相关㊂另外,本研究发现了F O X L2转录因子与猪屠宰性状相关的6个S N P s位点,这证实了基因多效性假说㊂其中g.79706726T>C㊁g.79706898C>T㊁g.79707794 T>C既与排卵状态有关,又与屠宰性状有关㊂表明F O X L2转录因子除了维持卵巢表型和功能以外,还和猪的生长发育息息相关㊂可为F O X L2基因在两广小花猪中的选种选育提供重要参考,为分子标记辅助育种提供理论依据㊂参考文献(R e f e r e n c e s):[1] G A R C I A-O R T I ZJE,P E L O S IE,OMA R IS,e ta l.F o x l2f u n c t i o n s i n s e xd e t e r m i n a t i o n a n dh i s t o g e n e s i st h r o u g h o u tm o u s eo v a r y d e v e l o p m e n t[J].B M C D e vB i o l,2009,9:36.[2] S I N C L A I R A,S M I T H C.F e m a l e sb a t t l e t os u p p r e s st h e i r i n n e rm a l e[J].C e l l,2009,139(6):1051-1053.[3]徐超,李凤,郝海生,等.性别相关基因在牛早期性别发育中的表达规律研究[J].畜牧兽医学报,2017,48(10):1892-1901.X U C,L I F,HA O H S,e ta l.S e x-r e l a t e d g e n e se x p r e s s i o nd u r i n g d e v e l o p m e n to ft h ee a r l y b o v i n ef e t u s e s[J].A c t aV e t e r i n a r i ae tZ o o t e c h n i c aS i n i c a,2017,48(10):1892-1901.(i nC h i n e s e)[4] S C HM I D T D,O V I T T C E,A N L A G K,e ta l.T h em u r i n e w i n g e d-h e l i x t r a n s c r i p t i o n f a c t o r F o x l2i sr e q u i r e df o r g r a n u l o s ac e l ld i f f e r e n t i a t i o na n do v a r ym a i n t e n a n c e[J].D e v e l o p m e n t,2004,131(4):933-942.[5] MO R KL,MA A T O U KD M,M C MA H O NJA,e t a l.T e m p o r a l d i f f e r e n c e s i n g r a n u l o s a c e l l s p e c i f i c a t i o n i nt h e o v a r y r e f l e c t d i s t i n c t f o l l i c l e f a t e s i nm i c e[J].B i o lR e p r o d,2012,86(2):37.[6] B E R N A R D D J,T R A N S.M e c h a n i s m s o fa c t i v i n-s t i m u l a t e dF S H s y n t h e s i s:t h es t o r y o fa p i g a n daF O X[J].B i o l R e p r o d,2013,88(3):78.[7] B I L E Z I K J I A N L M,J U S T I C E N J,B L A C K L E R AN,e t a l.C e l l-t y p e s p e c i f i cm o d u l a t i o n o f p i t u i t a r y c e l l sb y ac t i v i n,i n h i b i n a nd f o l l i s t a t i n[J].M o l Ce l lE n d o c r i n o l,2012,359(1-2):43-52.[8] D I A S JA,U L L O A-A G U I R R EA,B O U S F I E L DGR,e t a l.E d i t o r i a lf o r t h e M C Es p e c i a l i s s u eo n N o v e le n d o c r i n e m e c h a n i s m s i n t h e r e g u l a t i o n o fr e p r o d u c t i o n [J].M o lC e l l E n d o c r i n o l,2014,382(1):385-386.[9] O D L E A K,C H I L D SG V.S MA D-F O X L2r e g u l a t i o no f F S H B:a g a m e o f h u m a n a n d m o u s e[J].E n d o c r i n o l o g y,2020,161(7):b q a a077.[10] UH L E N HA U T N H,T R E I E R M.F o r k h e a dt r a n s c r i p t i o n f a c t o r s i n o v a r i a n f u n c t i o n[J].R e p r o d u c t i o n,2011,142(4):489-495. 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影响猪肉嫩度的遗传因素
影响猪肉嫩度的遗传因素任武泽! 孙世铎! 罗桂芬（西北农林科技大学动物科技学院U 陕西杨凌P"&"##)摘要：嫩度是猪肉品质的一个重要方面。
影响猪肉嫩度的因素很多，遗传因素是改善猪肉嫩度的关键。
本文对肌纤维性状、钙蛋白酶蛋白水解系统和肌内脂肪的有关基因进行了论述，包括!"#$基因家族、钙调蛋白激酶（45!6）基因、钙激中性蛋白酶（4789）基因、钙蛋白酶抑制蛋白（47:;）基因、心脏脂肪酸结合蛋白（<+=7>8）基因、脂肪组织脂肪酸结合蛋白（7+=7>8）基因、过氧化氢酶体激活增殖受体（887?#）基因以及与肌内脂肪有关的VIG。
其中有些已被认为是肉嫩度的候选基因。
对改善猪肉嫩度所面临的问题及研究前景进行了讨论。
关键词：猪肉嫩度；遗传因素；肌纤维性状；钙蛋白酶蛋白水解系统；肌内脂肪中图分类号! V$H(W V$H$XT+& 文献标识码：动物肌肉是人们蛋白质的主要来源之一，其基本组成单位是肌纤维，此外还有一定量的脂肪、结缔组织。
近年来，猪肉品质已成为猪遗传育种学家研究的热点和难点问题。
研究表明，肌肉的嫩度与肌纤维类型、数目、直径、肌内脂肪（,-./01 2345360/ 70.，89:）含量，以及结缔组织的含量和状态密切相关;"<+=。
嫩度是影响猪肉品质（如适口性）的一个重要方面，本文就有关猪肉嫩度的研究作一综述。
" !"#$基因家族哺乳动物肌纤维在胚胎形成过程中受到!"#$家族的调控。
!"#$家族包括!"#$%、!&’(（2>?@A-,-，肌细胞生成素）、)"*+,和)"*+-。
它们编码碱性螺旋%环%螺旋蛋白（B04,5 CA6,D% 6??E%CA6,D，BFGF），通过调节肌肉分化阶段特异性蛋白的表达来参与肌细胞的分化。
其中)"*+,和!"#$%在肌细胞增殖过程中表达；!"#$%在肌细胞分化末期表达；而)"*+-主要在生后表达;H=。
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猪INSIG2基因的多态性及其对肉质性状的影响蒋明;李杰;陈斌;李智;董莲花【摘要】试验以杜洛克猪、大白猪、大围子猪、沙子岭猪、桃源黑猪、五指山猪和杜长大商品猪为试验材料,通过测序和PCR-RFLP的方法对胰岛素诱导基因2(INSIG2)5'调控区域的多态性进行检测,并分析该基因对猪肉质性状的影响,结果表明:在该区域发现T-502C、G-460C和T-609C 3个突变位点,T-502C和G-460C 所选所有品种都处于Hardy-Weinberg平衡状态,T-609C除了五指山猪外也都符合Hardy-Weinberg平衡,在肉质性状上,T-502C位点,TT型个体的系水力和嫩度显著高于CC型;G-460C位点,杂合子CG型在贮存损失上显著高于CC型和GG型,大理石纹GG型和CG型差异不显著但是都显著高于CC型,肉质色度方面GG型和CC型差异不显著但显著高于CG型;T-609C位点,TT型的贮存损失显著高于CT型, 但和CC型差异不显著, 嫩度CC型显著高于CT型和TT型,INSIG2基因可能是一个与猪肉系水力、嫩度和大理石纹相关的分子遗传标记.%In this experiment, the Duroc, Yorkshire, Daweizi, Shaziling, Taoyuan, Wuzhishan and the DLY Hybrid were chose, the polymorphism of insulin induced genes 2 (INSIG2)'s 5' regulatory regionswere detected through the sequencing and PCR-RFLP method, and we also analyzed the association of polymorphisms of INSIG2 with the meat traits, the results show that this area has three mutations:T-502C, G-460C and T-609C, the T-502C and G-460C arein Hardy Weinberg equilibrium among all the selected varieties, T-609C are also in Hardy Weinberg equilibrium besides wuzhishan pigs; on the meat quality traits, for T-502C sites, water holding capacity and tenderness of TT type are significantly higher than that of CC type; for G-460C sites, CG typeis significantly higher than CC and GG, in marble, GG and CG type was not significant but were significantly higher than that of CC, on fleshy chromaticity, GG type and CC was not significant, but significantly higher than CG type; for T-609C sites, TT is significantly higher than CT in storage loss, but no significant difference between CC type, in tenderness, CC was significantly higher than that of CT and TT, INSIG2 gene is likely to be one of the molecular genetic markers forwater holding capacity, tenderness and the marble.【期刊名称】《养猪》【年(卷),期】2015(000)005【总页数】6页(P81-86)【关键词】INSIG2;限制性内切酶;多态性;脂肪代谢;肉质性状【作者】蒋明;李杰;陈斌;李智;董莲花【作者单位】湖南农业大学动物科学技术学院,湖南长沙 410128;畜禽遗传改良湖南重点实验室,长沙 410128;湖南农业大学动物科学技术学院,湖南长沙 410128;畜禽遗传改良湖南重点实验室,长沙 410128;湖南农业大学动物科学技术学院,湖南长沙 410128;畜禽遗传改良湖南重点实验室,长沙 410128;湖南农业大学动物科学技术学院,湖南长沙 410128;畜禽遗传改良湖南重点实验室,长沙 410128;湖南农业大学动物科学技术学院,湖南长沙 410128;畜禽遗传改良湖南重点实验室,长沙410128【正文语种】中文【中图分类】S828我国是生猪养殖大国，同时也是猪肉消费大国，猪肉在我国的日常饮食中有着举足轻重的地位，经过十几年的育种工作，我国猪的瘦肉率、生长速度、饲料报酬等指标都得到了很大的提高。
但随着人民生活水平的提高，消费者对猪肉的需求不仅仅只满足于肉的充足，而更加倾向于肉质尤其是风味、口感和营养，因此改善肉品质成为我国生猪育种体系及育种公司工作的重要组成部分[1]。
研究表明，肌纤维的类型和大小、结缔组织以及肌内脂肪的含量与肉质品质密切相关[2]。
其中肌内脂肪、大理石纹是肉质品质评定中必不可少的指标，其含量的多少直接影响肉质的风味、多汁性和嫩度[3]。
因此一些与脂肪沉积相关的基因也成为肉品质分子选育的重要候选基因。
胰岛素诱导基因（Insulin Induced Gene,INSIG），在哺乳动物体内存在两种亚型，分别为INSIG1和INSIG2[4]，是近年来发现的与脂肪代谢相关的新基因之一，在脂肪细胞分化和脂肪代谢的过程中发挥重要的作用[5]。
它们的主要功能是与固醇调节元件结合蛋白（Sterol Regulatory Element Binding Proeein,SREBPs）及其裂解活化蛋白（SREBPs Cleavage Activating Protein,SCAP）结合，最终以三者复合物的形式调节脂肪合成所需的各种酶类的转录[6]。
本试验以两个外来品种杜洛克、大白猪，4个中国地方品种沙子岭猪、五指山猪、大围子猪、桃源黑猪和杜长大商品猪为研究对象，采用PCR-RFLP方法对INSIG2基因进行多态性分析，并将其与肉质性状进行关联性分析，旨在挖掘与肉质性状相关联的遗传分析标记，为生猪育种工作提供理论依据。
1 材料与方法1.1 试验时间与地点试验于2013—2014年在湖南农业大学动物科学技术学院进行。
1.2 试验材料试验猪耳样采自于益阳农科所种猪场、正虹原种猪场和地方品种猪种猪场。
其中益阳农科所种猪场杜洛克47头、大白猪62头；正虹原种猪场大白猪71头、杜长大65头；中国地方猪品种有：五指山猪47头、大围子猪45头、桃源黑猪48头、沙子岭猪45头。
剪取试验猪小块耳组织放入灭菌的1.5 mL Eppendorf管中，加入70%的酒精，放于-20℃用于提取DNA，随机选取平均体重达到100 kg左右的72头大白猪进行屠宰测定。
1.3 基因组DNA提取和检测酚仿法提取基因组DNA，TE溶解，Nanodrop 2000核酸测定仪检测DNA浓度和纯度，-20℃保存备用。
1.4 性状的测定对屠宰的试验猪测定其嫩度、肉色、pH、滴水损失、失水率、熟肉率、大理石纹等指标，指标测定过程在屠宰现场和畜禽遗传改良湖南重点实验室进行。
其中肉色采取传统评分和色差仪两种方法测量，色差仪量测的肉质色度（Chroma,C）=（a2+b2）0.5（+a表示红度，-a表示绿度；+b表示黄度，-b表示蓝度）。
1.5 引物设计和PCR扩增根据GenBank上公布的猪的INSIG2基因的DNA序列（GenBank_NO：NG_008188），利用NCBI和UCSC中BLAST程序在线比对获得猪INSIG2基因的5'的调控区基因序列，用Primer 5.0和Oligo 6.0软件设计调控区的引物，引物由上海生工有限公司合成，引物信息见表1。
表1 INSIG2基因的引物?PCR扩增条件：94℃预变性5 min；94℃变性30 s，58 ℃复性30 s，72 ℃延伸60 s，33个循环；72 ℃延伸10 min，4℃保存。
扩增产物用1%琼脂糖凝胶电泳检测。
1.6 SNP位点检测分别选取杜洛克、大白猪、杜长大、五指山猪、大围子猪、桃源黑猪、沙子岭猪各10个DNA混池，然后以混池DNA为模板进行PCR反应，结果用琼脂糖凝胶电泳检测，选取特异性高、条带明亮单一的PCR产物进行测序，测序由铂尚生物技术（上海）有限公司完成。
测序结果用DNAStar 7.1软件比对寻找SNP位点，然后继续通过DNAStar 7.1软件分析确定限制性内切酶的酶切位点。
1.7 扩增产物的酶切1.7.1 限制性内切酶的选择使用DNAStar 7.1软件对包括SNP位点在内的4～7个碱基选择内切酶，尽量保证除SNP位点外，DNA片段的其他片段区域内无该内切酶酶切位点，如存在多个酶切位点，必须保证不用基因型DNA酶切后片段大小能通过电泳区分开来，以便区分基因型。
利用DNAStar 7.1软件选出的合适内切酶见表2。
表2 INSIG2基因的限制性内切酶位点限制性内切酶酶切产物/bp T-502CMwoⅠ C：63、216、583；T：63、793 G-460C Bsp MⅠ C：315、541；G：856 T-609C TaqⅠ C：166、690；T：8561.7.2 酶切反应体系和反应条件 INSIG2 T-502C位点MwoⅠ酶切反应体系：酶切反应总体系为15 μL，10×Buffer Tango缓冲液1.5 μL，MwoⅠ（10 U/μL）0.2 μL，PCR 产物5 μL，其余的用超纯水补齐，37 ℃水浴4～6 h；G-460C位点Bsp MⅠ酶切反应体系：酶切反应总体系为15 μL，10×Buffer Tango缓冲液1.5 μL，Bsp MⅠ（5 U/μL）0.2 μL，PCR 产物5 μL，其余的用超纯水补齐，37℃水浴4～6 h；T-609C位点TaqⅠ酶切反应体系：酶切反应总体系为15 μL，10×Buffer Tango 缓冲液1.5 μL，TaqⅠ（10 U/μL）0.15 μL，PCR产物5 μL，其余的用超纯水补齐，65℃水浴4～6 h。