茚三酮法测氨基酸
氨基酸的化学反应
氨基酸的化学反应
氨基酸的化学反应是其基团的特征性反应。
重要的有：
1、茚三酮反应。
所有具有自由α-氨基的氨基酸与过量茚三酮共热形成蓝紫色化合物（脯氨酸和羟脯氨酸与茚三酮反应产生黄色物质）医|学教|育网搜集整理。
用分光光度法可定量测定微量的氨基酸。
蓝紫色化合物的最大吸收峰在570nm波长处，黄色在440nm波长下测定。
吸收峰值的大小与氨基酸释放的氨量成正比。
2、与2，4-二硝基氟苯（DNFB）的反应。
在弱碱性溶液中，氨基酸的α-氨基很容易与DNFB作用生成稳定的黄色2，4-二硝基苯氨基酸（DNP-氨基酸），这一反应在蛋白质化学的研究史上起过重要作用，Sanger等人应用它测定胰岛素一级结构。
多肽顺序自动分析仪是根据相类似的原理设计的，即利用多肽链N端氨基酸的α-氨基与异硫氰酸苯酯PITC反应（Edman降解法）。
植物体内游离脯氨酸含量的测定
植物体内游离脯氨酸含量的测定目的意义植物在正常条件下游离脯氨酸（proline，Pro）含量很低，但在干旱、高温、低温、盐碱、水涝等逆境条件下便会大量积累，并且积累指数与植物的抗逆性呈正相关关系。
因此，脯氨酸可作为植物抗逆性的一项生化指标，测定其含量也成为抗性生理研究的重要内容之一。
本实验的目的是掌握游离脯氨酸含量的测定方法、原理及操作技术。
一、酸性茚三酮法（一）原理植物体内的氨基酸只有脯氨酸能与酸性茚三酮发生反应，生成稳定的红色产物。
该产物在515nm有一最大吸收高峰，其吸收值与脯氨酸的含量呈直线关系。
因此，样品中的脯氨酸含量可用酸性茚三酮法测定。
除脯氨酸外，酸性和中性氨基酸不能与酸性茚三酮形成红色产物，碱性氨基酸对这一反应只有轻度干扰，在同类样品的测定中可忽略不计，在不同样品的测定中可加入人造沸石排除这种干扰。
（二）实验材料、仪器与试剂1. 实验材料：正常生长与经逆境处理的植物茎、叶、穗等器官或组织。
2. 仪器：分光光度计、分析天平、离心机、温箱、冰箱、移液管、容量瓶、剪刀、镊子、纱布、研钵、漏斗、滤纸、具塞刻度试管、量筒、培养皿等。
3. 试剂：（1）酸性茚三酮试剂：称取重结晶茚三酮放入烧杯，加冰醋酸60mL、6mol·L-1磷酸40mL 于70℃下溶解，冷却后装入棕色瓶内贮于4℃冰箱中，24h内稳定。
现用现配。
（2）100μg·mL-1脯氨酸母液：精确称取脯氨酸溶于少量80％乙醇中，用蒸馏水定容至100mL。
（3）其他试剂：人造沸石、活性炭粉、冰醋酸、80％乙醇。
（三）操作步骤1. 标准曲线制作：（1）取7个50mL容量瓶，分别放入脯氨酸母液、、、、、、，用蒸馏水定容至刻度，摇匀，各瓶的脯氨酸浓度分别为、、、、、、μg·mL-1。
（2）另取具塞刻度试管8只（0～7号），0号加入2mL蒸馏水，1～7号分别加入不同浓度的标准系列各2mL，再分别加入冰醋酸2mL 和茚三酮试剂2mL，充分摇匀，加盖，沸水浴10～15min。
氨基酸纸上层析实验报告
竭诚为您提供优质文档/双击可除氨基酸纸上层析实验报告篇一：实验六氨基酸的纸层析法氨基酸的纸层析法一．目的了解并掌握氨基酸纸层析的原理和方法。
二、原理以滤纸为支持物的层析法，称为纸层析法。
纸层析所用展层剂大多由水和有机溶剂组成。
展层时，水为静止相，他与滤纸纤维亲和力强；有机溶剂为流动相，它与滤纸纤维亲和力弱。
有机溶剂在滤纸上又下向上移动的，称为上行法；有上向下移动的，称为下行法。
将样品在滤纸上确定的原点处展层，由于样品中各种氨基酸在两相中不断进行分配，且他们的分离系数各不相同，所以不同的氨基酸随流动相移动的速率也不相同，于是各种氨基酸在滤纸上就相互分离出来，形成距原点不等的层析点。
在一定条件下（室温、展层剂的组成、滤纸的质量、ph 值等不变），不同的氨基酸有固定的移动速率（Rf值）Rf=原点到层析点中心的距离/原点到溶剂前沿的距离。
用混合氨基酸做样品时，如果只用一种溶剂展层，由于某些氨基酸的移动速率相同或相近，就不能将它们分开，为此，当用一种溶剂展层后，可将滤纸旋转90度，以第一次所的层析点为原点，在用另一溶剂展层，从而达到分离的目的。
这种方法称为双向层析法。
本试验主要介绍的是单向层析法。
其中混合氨基酸有精氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸组成。
三、实验仪器1、新华滤纸2、层析缸3、细线4、点样管5、橡皮筋6、电吹风7、喷雾器四、实验试剂1、混合氨基酸（精氨酸，酪氨酸，苯丙氨酸）2、展层剂：正丁醇：12%氨水：95%乙醇：蒸馏水=13：3：3：1（v:v）3、0.5%茚三酮—无水丙酮溶液：0.5g茚三酮溶于100ml 无水丙酮，贮于棕色瓶中五、实验步骤1、取滤纸剪成20×10厘米的滤纸条一张，在一端打孔，系一根细线，在另一端2~3cm处用铅笔画一横线，中间画一圆点（原点）。
2、取毛细管一支(回收)，吸取氨基酸混合液，在原点处点样，样点直径不宜超过5mm,每点一次用吹风机吹干，点2~3次为佳。
3、点样后将滤纸放入层析缸中展层，注意点样线要高于层析液面，滤纸不要贴在层析缸璧上，当展层至另一端1~2cm处时，停止展层（大约2~3小时）。
氨基酸含量的测定
氨基酸含量的测定标准曲线绘制准确吸取200ug/ml的氨基酸标准溶液0.0，0.6，0.8，1.0,1.2，1.5，2.0 ml，分别置于25ml容量瓶或比色管中，各加水补充至溶剂为4.0ml，然后加入茚三酮和磷酸缓冲溶液各1ml，混合均匀，于水浴上加热15min，取出迅速冷至室温，再摇匀，加水至标线25ml，摇匀。
静置15min后，在570nm波长下，以试剂空白为参比液夨订其余各溶液的吸光度A。
以氨基酸的微克数为横坐标，吸光度A为纵坐标，绘制标准曲线。
样品的测定：吸取澄清的样品溶液1.5ml，平行三次，按标准曲线制作步骤，在相同条件下测定吸光度A 值，用测得的A值在标准曲线上即可查得氨基酸的微克数。
公式：氨基酸总量（ug/100g）=(c/m*1000)*100式中c是指从标准曲线上查得的氨基酸的ug数；M是指测定的样品溶液相当于样品的质量g；PH计酸度计测量ph的方法：(1)拿下笔帽(2)按on/off键，机器显示运作(3)将ph计放入待测液中(4)轻轻晃动ph计，保证内气泡逸出，使之于溶液充分接触，勿碰撞杯壁(5)ph计会立即显示数值，将笔置入待测液待数值稳定，30秒内将显示正确数值，(特：ph计数值上下浮动或不稳定是正常现象)(6)按hold键锁定数值，可在待测溶液外记录读取，继续按hold键解除锁定(7)按on/off键关闭ph计(8)轻甩PH计测试笔上多于的水，用蒸馏水或脱离子水冲洗，盖上笔帽测量温度方法在测试模式下，温度数值与ph数值同步显示在液晶面板上，但在校准模式下不显示，数值默认为摄氏温度。
（一）挥发性盐基氮（TVB-N）的测定半微量定氮法（1）原理：蛋白质在酶和细菌的作用下分解后产生碱性含氮物质，有氨、伯胺、仲胺等，此类物质具有挥发性，可在碱性溶液中被蒸馏出来，用标准酸滴定，计算含量。
（2）试剂①氧化镁混悬液(10g/L) 称取1.0g氧化镁，加100ml水，振摇成混悬液。
茚三酮显色法测定赖氨酸含量
■ L-赖氨酸的化学名称为L-2,6-二氨基己酸或α，ε-二 氨基己酸，属于单斜晶系，熔点为263℃，比旋光度是 +21°，难溶于醇和醚，易溶于水，等电点为9.59。游离的 L-赖氨酸具有很强的呈盐性，极易吸收空气的CO2生成碳酸 盐，故一般商品是以L-赖氨酸盐酸盐的形式存在。L-赖氨 酸盐酸盐的化学组成为C6H15O2N2Cl或C6H14O2N2·HCl，其相 对分子量为182.64，化学性质稳定，为无色晶体，几乎无 味，易溶于水，难溶于醇和醚，在25℃的水中溶解度为 793g/L。
一、茚三酮显色法测定赖氨酸含量
பைடு நூலகம்3.操作步骤
（1）绘制标准曲线 准确吸取已配好的标准浓度系列的亮氨酸溶液各0.5mL,
分别放入5支试管中，每种浓度做3个重复。再取一支试管加 入0.5mL蒸馏水做空白对照。向每支试管中各加入0.5mL的4 ％碳酸钠溶液和2mL茚三酮试剂（头一天配好的），混匀， 在80℃恒温水浴上保温30min。取出后，立即放入冷水浴中 冷却3min，然后向每管内加入5mL的95％乙醇，摇匀，在分 光光度计上500nm波长处进行比色，以空白做对照，读取吸 光度。以吸光度值为纵坐标，亮氨酸浓度为横坐标，绘出标 准曲线，并求出曲线的斜率。
10mL8％的甲酸，最后加水到100mL ■ 茚三酮试剂：称取1lg茚三酮和1g氯化镉(CdCl2)，加入25mL
上述缓冲溶液和75mL乙二醇，室温下放置一天，第二天使用。 若出现沉淀，则过滤后使用。注意该溶液不能现用现配，一定 要配制好后第二天使用，也不宜放置过久 ■ 4％和2％无水碳酸钠溶液：各50mL ■ 标准亮氨酸溶液：准确称取25mg亮氨酸，加数滴稀盐酸，待 溶解后定容至50mL，该溶液亮氨酸浓度为500μg／mL。准确 吸取上述母液1、3、5、7、9mL，分别稀释至25mL，待用 ■ 722型分光光度计、水浴锅
茚三酮比色法测乙肝宁水提物中总游离氨基酸含量
茚三酮比色法测乙肝宁水提物中总游离氨基酸含量邹龙;李仲秋;刘辉;夏新华【摘要】目的:建立乙肝宁复方水提物中总游离氨基酸含量测定的方法.方法:以乙肝宁复方水提物中总游离氨基酸含量和蛋白质含量为指标,对总游离氨基酸含量测定最佳除蛋白的乙醇浓度和药液比进行筛选；采用茚三酮比色分光光度法,于568 nm,测定乙肝宁复方中总游离氨基酸的含量.结果:醇浓度为70％,生药浓度为1g/mL(生药比1∶6)可较好除去蛋白质等大分子物质,减少测定干扰；采用茚三酮比色法,标准曲线方程为:A=0.055 9C-0.225 3(r=0.9991),平均回收率为98.8％,RSD为2.07％(n=9),线性关系良好.该法测得乙肝宁复方药材中总游离氨基酸的含量为1.47％,乙肝宁浸膏中含量为5.65％.结论:该方法简便、快速准确,可用于测定乙肝宁复方中游离氨基酸的含量测定.【期刊名称】《赣南医学院学报》【年(卷),期】2012(032)002【总页数】4页(P161-164)【关键词】乙肝宁;总游离氨基酸;含量测定;茚三酮比色法【作者】邹龙;李仲秋;刘辉;夏新华【作者单位】湖南中医药大学药学院湖南长沙 410208;湖南中医药大学药学院湖南长沙 410208;湖南中医药大学药学院湖南长沙 410208;湖南中医药大学药学院湖南长沙 410208【正文语种】中文【中图分类】Q503乙肝宁复方为治疗病毒性乙型肝炎的一临床有效验方［1］，该复方由黄芪、白花蛇舌草、绵茵陈、金钱草、党参、蒲公英、制何首乌、牡丹皮、丹参、茯苓、白芍、白术、川楝子十三味药组成［2］，具有补气扶正、健脾化湿、滋肾养肝、利胆清热、活血化瘀等作用［3］。
在本实验早期对乙肝宁复方工艺制备方法优化研究中，发现乙肝宁水提液经絮凝澄清纯化处理后在吸湿性方面较传统醇沉纯化方法处理后有较大改善［4］。
故本课题旨在考察壳聚糖絮凝澄清法对乙肝宁中无效成分游离氨基酸、鞣质、蛋白质等的作用，以探讨其较低吸湿性的原理，说明引起中药制剂吸湿性强的原因。
茚三酮显色分光光度法测定食品中α-氨基酸含量的方法探讨
茚三酮显色分光光度法测定食品中α-氨基酸含量的方法探讨丁永霞【摘要】采用茚三酮显色分光光度法测定食品中α-氨基酸的总含量,通过试验摸索,确定了以甘氨酸为标准品、茚三酮为显色剂的测定方法.试验结果表明,该方法的最佳反应条件为:pH值5.5,在沸水浴中加热显色20 min,常温条件下的最大吸收波长566 nm.用甘氨酸配制系列标准溶液,通过标准曲线法对待测溶液进行定量分析,其相关系数为0.999 5,回收率在95.5％～104.3％范围内,表明该方法具有操作简便、结果准确、重现性良好的特点.【期刊名称】《食品工程》【年(卷),期】2017(000)001【总页数】3页(P55-57)【关键词】茚三酮;分光光度法;α-氨基酸;甘氨酸【作者】丁永霞【作者单位】菏泽市疾病预防控制中心,山东菏泽274010【正文语种】中文【中图分类】TS207.4UV—2550紫外可见分光光度计，日本岛津公司；FA2004N电子分析天平，上海精密科学仪器公司；石英比色皿（1cm）；玻璃比色皿；容量瓶；移液管；吸管；蒸馏烧瓶；加热套；pH试纸。
盐酸溶液，浓度6 mol/L，分析纯；甘氨酸，优级纯；茚三酮试剂，分析纯；乙酸，分析纯；乙酸钠，分析纯；NaOH溶液，浓度1 mol/L，分析纯；酚酞指示剂。
乙酸-乙酸钠缓冲溶液（pH=5.5）：精确称取50 g乙酸钠（CH3COONa·3H20）于烧杯中，加入150mL蒸馏水，用移液管移取2.50mL冰醋酸，加热溶解，冷却后转移到250mL容量瓶中，用馏水定容至刻度。
茚三酮乙二醇溶液（质量浓度3%）：精确称取3 g水合茚三酮，加入50mL乙二醇，低温加热溶解后，转移至100mL容量瓶中，用乙二醇定容至刻度，转移到试剂瓶后置于0℃～5℃冰箱中保存备用（临用时配）。
甘氨酸标准储备液：准确称取0.1000 g甘氨酸标准品，加馏水溶解定容到100mL容量瓶中，摇匀，转移到玻璃试剂瓶后置于0℃～5℃冰箱中备用，此溶液质量浓度为1000 μg/mL。
饲料蛋白水解氨基酸含量的测定-实验方案
四、实验条件
2
1.仪器： (1) 样品粉碎机 (2) 样品筛（60 目） (3) 分析天平（感重 0.0001 g） (4) 真空泵 (5) 过滤器 (6) 恒温干燥箱 (7) 漩涡混匀仪 (8) 磁力搅拌器 (9) 酒精喷灯 (10)蒸空冷冻干燥仪 (11)纯水系统 (12)注射器 (13)0.22 μm 微孔滤膜 (14)100/1000 μL 移液枪 (15)试管（20*200）、烧杯、量筒、容量瓶、漏斗、氨基酸样品瓶等玻璃器具 (16)日立 L-8900 全自动氨基酸分析仪：配有自动进样器，2622#色谱柱，可见分光光度计， 柱温箱配有电子加热/制冷温控装置，EZChrom Elite 分析软件。 2.试剂： （1）酸解剂——盐酸溶液，c(HCl)=6 mol/L：盐酸(GR)与纯水 1:1 混合，每升盐酸溶液 含 5 g 苯酚。 （2）样品稀释溶液/空白溶液——盐酸(GR)溶液，c(HCl)=0.02 mol/L （3）17 种氨基酸混合标准储备液，各组分浓度 c(氨基酸)=2.50 μmol/mL, （4）混合氨基酸标准工作液：取 40 μL 氨基酸标准储备液用样品稀释溶液稀释至 1 mL， 使各氨基酸组分浓度 c(氨基酸)=100 nmol/mL。 （5）液氮、氮气 （6）燃烧用酒精 （7）超纯水 （8）不同 pH 和离子强度的洗脱用柠檬酸钠缓冲液（按仪器说明书配制）
中蛋白质水解后氨基酸的含量。
蛋白质水解法适于含动植物蛋白的单一饲料、配合饲料、浓缩饲料和预混料中氨基酸
的测定，包含常规酸水解法、氧化酸水解法和碱水解法。氧化酸水解法主要用于测定含硫
氨基酸，碱水解法只适于测定色氨酸。普通酸水解法会破坏色氨酸和部分破坏含硫氨基酸，
适于测定除色氨酸、含硫氨基酸(胱氨酸和蛋氨酸等)以外的蛋白水解氨基酸，使用最广，
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
茚三酮显色法测定氨基酸的含量
一．原理：凡含有自由氨基的化合物，如蛋白质、多肽、氨基酸的溶液与水合茚三酮共热时，能产生紫色化合物，可用比色法进行测定。
氨基酸与茚三酮的反应分两个步骤。
第一步是氨基酸被氧化形成CO2、NH3和醛、茚三酮被还原成还原型茚三酮；第二步是所形成的还原型茚三酮与另一个茚三酮分子和NH3缩合生成有色物质。
二．仪器：721型分光光度计台天平减压蒸馏器干燥容量瓶移液枪烧杯试管架试管水浴锅。
三．药品：（1）标准氨基酸溶液：配制成0.3mmol/L 溶液
（2）pH5.4，2mol/L 醋酸缓冲液：量取86mL 2mol/L 醋酸钠溶液，加入14mL 2mol/L 乙酸混合而成。
用pH 检查校正。
（3）茚三酮显色液：称取170mg 茚三酮和30mg 还原茚三酮，用20mL 乙二醇甲醚溶解
（4）60％乙醇。
（5）样品液：每毫升含0.5～50μg 氨基酸。
茚三酮若变为微红色，则需按下法重结晶：称取5g 茚三酮溶于15～25mL 热蒸馏水中，加入0.25g 活性炭，轻轻搅拌。
加热30min 后趁热过滤，滤液放入冰箱过夜。
次日析出黄白色结晶，抽滤，用1mL 冷水洗涤结晶，置干燥器干燥后，装入棕色玻璃瓶保存。
还原型茚三酮按下法制备：称取0.5g 茚三酮，用12.5mL 沸蒸馏水溶解，得黄色溶液。
将0.5g 维生素C 用25mL 温蒸馏水溶解，一边搅拌一边将维生素C 溶液滴加到茚三酮溶液中，不断出现沉淀。
滴定后继续搅拌15min，然后在冰箱内冷却到4℃，过滤、沉淀用冷水洗涤3 次，置五氧化二磷真空干燥器中干燥保存，备用。
乙二醇甲醚若放置太久，需用下法除去过氧化物：在500mL 乙二醇甲醚中加入5g 硫酸亚铁，振荡1～2h，过滤除去硫酸亚铁，再经蒸馏，收集沸点为121～125℃的馏分，为无色透明的乙二醇甲醚。
四、操作步骤
1．标准曲线的制作
分别取0.3mmol/L 的标准氨基酸溶液0，0.2，0.4，0.6，0.8，1.0mL 于试管中，用水补足至1mL。
各加入1mL pH5.4，2mol/L 醋酸缓冲液；再加入1mL 茚三酮显色液，充分混匀后，盖住试管口，在100℃水浴中加热15min，用自来水冷却。
放置5min 后，加入3mL60％乙醇稀释，充分摇匀，用分光光度计测定OD570nm。
（脯氨酸和羟脯氨酸与茚三酮反应呈黄色，应测定OD440nm）。
以OD570nm 为纵坐标，氨基酸含量为横坐标，绘制标准曲线。
混匀，盖住试管口后在100°水浴加热15min，然后用自来水冷却。
放置5min 后，加入3ml60%的乙醇稀释，充分摇匀。
2．氨基酸样品的测定
取样品液1mL，加入pH5.4，2mol/L 醋酸缓冲液1mL 和茚三酮显色液1mL，混匀后于100℃沸水浴中加热15min，自来水冷却。
放置5min 后，加3mL 60％乙醇稀释，摇匀后测定OD570nm（生成的颜色在60min 内稳定）。
将样品测定的OD570nm 与标准曲线对照，可确定样品中氨基酸含量。