细胞凝集反应实验报告.
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【实验题目】
细胞凝集反应
【实验目的】
1、了解细胞的表面结构。
2、掌握细胞凝集的原理。
3、掌握细胞凝集实验的操作方法。
【实验材料与用品】
1. 试剂:PBS缓冲溶液、0.9%的氯化钠溶液(生理盐水)
2. 器具:酒精棉球、双凹片、载玻片、普通光学显微镜、托盘天平、滴管、离心管
3. 材料:兔子静脉血
【实验原理】
1.凝集素
凝集素(lectin)是一类含糖的(少数例外)并能与糖专一结合的蛋白质,它具有凝集细胞和刺激细胞分裂的作用。目前已发现近千种植物中含有凝集素,在各种真菌、无脊椎动物、脊椎动物、人体的各种组织和器官中及某些病毒体内也含有凝集素。常用的为植物凝集素,通常以其被提取的植物命名,凝集素为它们的总称。
在细胞表面,组成细胞膜的糖脂和糖蛋白伸出寡糖链,形成细胞外被(糖萼)。凝集素使细胞凝集是由于它与细胞表面的糖分子连接,在细胞间形成“桥”的结果,加入与凝集素互补的糖可以抑制细胞的凝集。
2.细胞凝集
细胞凝集是指细胞彼此聚集在一起,成为一簇不规则的细胞团,目前认为,细胞间的联系、细胞的生长和分化、肿瘤的发生与免疫反应都与细胞表面的分枝状糖分子有关。
3.细胞凝集的反应技术
(1)直接凝集反应技术
颗粒性抗原与相应的抗体血清混合后,在电解质的参与下,经过一定时间,抗原抗体凝集成肉眼可见的凝集块,这种现象称为凝集反应。血清中的抗体称为凝集素。抗原称为凝集原。细菌或其他凝集原都带有相同的电荷(阴电荷),在悬液中相互排斥而呈均匀的分散状态。抗原和抗体相遇后,由于抗原和抗体分子表面存在相互对应的化学基团,因而发生特异
性结合,称为抗原抗体复合物,由于抗体与抗原结合,降低了抗原分子间的排斥力,抗原表面的亲水基团减少,此时已有凝集趋势,在电解质参与下,中和了抗原抗体复合物的大部分电荷,使之失去了经典排斥力,分子间相互吸引,凝集成较大颗粒。出现了肉眼可见的凝集反应。
(2)间接凝集反应技术
可溶性抗原(或抗体)吸附于免疫学反应无关的颗粒表面上,当这些致敏的颗粒与相应的抗体(或抗原)相遇时,就会产生特异性的结合,在电解质的参与下,这些颗粒就会发生凝集现象。这种借助于载体的抗原抗体凝集现象就叫做间接凝集反应技术。
4.载体
具有吸附抗原(抗体)的载体很多,如聚苯乙烯乳胶、白陶土、活性炭、人和多种动物的红血球、某些细菌等。
良好的载体有以下几点基本要求:
(1)在生理盐水或缓冲液中无自凝现象;
(2)大小均匀;
(3)比重与介质相似,短时间内不沉淀;
(4)无化学或血清学活性;
(5)吸附抗原(或抗体)后,不影响其活性;
目前使用最广泛的是人的O型红血球和绵羊红血球。后者使用更广,因其来源方便,另外绵羊红血球的表面有大量的糖蛋白受体,极易吸附某些抗原物质,吸附性能好,且大小均匀一致。
【实验步骤】
一、大体流程
二、具体操作
1、称取土豆去皮块茎2g ,加10mlPBS 缓冲液,浸泡24小时,浸出的粗提液中即含有可溶性 土豆凝集素。(老师已做好)
2、抽取兔子静脉血液(加抗凝剂)1ml ,加生理盐水3ml ,在1000r/min 条件下,离心5min ,重复3次离心,最后按压积红细胞体积用生理盐水配成1%红细胞悬液。
3、分别用滴管吸取土豆凝集素和1%红细胞悬液各一滴,置双凹片左孔内,充分混匀。
4、同时分别用滴管吸取PBS 缓冲液和1%的红细胞悬液各一滴,置双凹片右孔内,充分混匀,做对照实验。
5、摇晃5—10min 后,观察有无发生细胞凝集并置显微镜下观察。
【实验结果与分析】
I .如图1、图2所示:刚开始计时时,两侧溶液均无凝集现象;4min 左右时,可看到双凹片左侧溶液中出现凝集现象,一部分血细胞在中央聚集呈沙粒状,溶液周围较澄清;而右侧溶
液无凝集现象。说明土豆凝集素可以使血液发生凝集,而PBS 缓冲液则不能。
图1: 刚开始时双凹片两侧溶液对比图 图2:4min 时双凹片两侧溶液对比图
II.如图3、图4所示:在10×10显微镜下观察,可看到左侧溶液中血细胞聚集,凝结成块状,土豆凝集素+红细胞悬液 混合 PBS+红细胞悬液 混合(对照) 摇晃5-10min 观察
显微镜下观察 取兔子静脉
血配置1%红细胞悬液
而右侧溶液中血细胞分散均匀,呈透明状。
图3: (10×10)显微镜下观察图(左侧)图4:(10×10)显微镜下观察图(右侧)
III.在高倍镜下观察如图5所示,可较清楚的看到血细胞聚集在一起,还可看到少数未发生凝集的血细胞;
高倍镜下(10×40),
观察到的凝集现象
由以上的观察可知:细胞凝集的时间较快,4min左右就可以发生明显凝集现象;细胞凝集的时间也受到土豆凝集素的浓度,以及血细胞的浓度影响,一般来说,凝集素的浓度越高,血细胞的浓度越高,细胞凝集的时间也会越短,凝集现象也越明显,但在本次实验中未进行不同浓度对凝集时间的影响的实验;从空白对照还可以看出,细胞发生凝集时凝集素必不可少的,没有细胞凝集素,细胞几乎不发生凝集。
实验反思:
第一次滴加完溶液后,在晃动双凹片的过程中因操作不熟练,使两个孔中的液体混到了一起,因此重新滴加了一次;在使用双凹片时要注意摇动的技巧,不可前后或左右单一地摇动,应该一手固定,一手成环形方向摇动,使凹槽内的液体转动起来,同时注意滴加的液体不宜过多,若加多了可用吸水纸吸掉部分多余液体,避免两个凹槽内的液体相互接触;
【注意事项】
1.实验前确定好双凹片的反正面,做好适当标记;
2.注意控制加入双凹片孔中的液体的量,以免使双凹片的2个孔中的液体混合;
3.摇晃双凹片时要注意摇动的技巧,不可前后或左右单一地摇动,应该一手固定,一手成
环形方向摇动,使凹槽内的液体转动起来;
4.显微镜下观察时,注意淀粉球和细胞的区分;淀粉球呈白色球状,略大于细胞;
5.实验过程中若凹槽内的水分蒸发过多,应及时补充PBS缓冲液,以免观察不到实验现象;
6.换用高倍镜下观察时,注意避免污染镜头,若液体过多,应用吸水纸吸取部分液体在进
行高倍镜下的观察;