蛋白A、蛋白G 、蛋白L
抗体纯化工艺
抗体纯化工艺一、概述抗体纯化工艺是制备高纯度、高活性抗体的关键步骤之一。
该工艺包括多个步骤，如细胞培养、抗体捕获、杂质去除和抗体纯化等，旨在获得纯度高、活性好的抗体产品。
本文将详细介绍抗体纯化工艺的各个步骤及相关技术方法。
二、细胞培养1.细胞株选择–选择适合抗体生产的细胞株，如CHO细胞、HEK293细胞等。
–考虑细胞株的稳定性、表达水平和生长特性等因素。
2.培养基配方优化–根据细胞株要求，优化培养基的成分，如碳源、氮源、生长因子等。
–添加适量的抗生素保持培养的无菌状态。
3.培养条件控制–控制培养室的温度、湿度和二氧化碳浓度等参数。
–定期检测培养液的pH值和溶氧含量，并进行适当调整。
三、抗体捕获1.细胞收获–选择最佳的细胞收获时间点，通常在细胞进入衰老期前进行。
–使用适当的方法（如离心、超滤等）将培养液中的细胞分离出来。
2.细胞破碎–使用机械方法或化学方法将细胞破碎，释放抗体和细胞内组分。
–注意选择合适的破碎条件，以保持抗体的完整性和活性。
四、杂质去除1.固体杂质的去除–使用离心、滤膜等方法去除细胞碎片、沉淀和残留的细胞碎片等固体杂质。
–选择合适的离心速度和滤膜孔径，以避免抗体的损失。
2.溶液杂质的去除–使用离子交换、凝胶过滤、亲和层析等方法去除溶液中的蛋白质、DNA、RNA等杂质。
–根据目标抗体的特性选择合适的去除方法。
五、抗体纯化1.亲和层析–使用亲和介质（如蛋白A、蛋白G、蛋白L等）将目标抗体从其他成分中分离出来。
–根据目标抗体的种类选择合适的亲和介质。
2.离子交换层析–利用抗体与离子交换介质之间的电荷相互作用进行分离。
–通过调整pH值、盐浓度等参数来实现对抗体的选择性吸附和洗脱。
3.凝胶过滤层析–利用凝胶过滤介质的孔径大小选择性地分离抗体。
–根据抗体的分子量和亲和性选择合适的凝胶过滤介质。
4.逆流色谱–利用逆流色谱技术实现对抗体的纯化和富集。
–通过改变流动相和温度等条件来调节抗体与逆流色谱介质之间的相互作用。
金黄色葡萄球菌蛋白a（spa）介绍[新版]
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金黄色葡萄球菌A蛋白百科内容来自于：金黄色葡萄球菌A蛋白（Staphylococal Protein A，SPA）是一种从金黄色葡萄球菌细胞壁分离的蛋白质。
早在1940年，Vevwey发现在某些金黄色葡萄球菌中，含有一种物质，在双向扩散试验中能与正常人血清形成沉淀。
Jensen也发现类似现象，并将其命名为A抗原。
直到1963年Lofkvist等分离了该抗原，并证明它是一种蛋白质。
为与A与糖相区别，Grov将其命名为金黄色葡萄球菌A蛋白，简称SPA或蛋白A。
由于SPA的一些免疫特性，它已引起广大免疫学者的兴趣，并发展成为免疫学上一种极为有用的工具。
研究概述金黄色葡萄球菌A蛋白分析：金黄色葡萄球菌A蛋白胶体金（SPA-CG）分子的特征性构象特点，探讨其作为原子力显微镜观测原位标记物的可行性。
方法：应用原子力显微镜扫描生理状态下分布在云母表面的金黄色葡萄球菌A蛋白胶体金分子，并进行结构分析及理论计算。
结果：极少数平卧的SPA-CG呈中部球形隆起，两端长短不一的弯曲棒状肽链环抱球形隆起的独特结构，形成反“C”字形结构，球形隆起直径为单个胶体金直径的3～4倍；极少数SPA-CG呈逗号样；绝大多数SPA-CG呈一侧面稍凹的椭球形结构，结构稳定、均一，长径为（40．88±1．58）nm，宽径为（20．82±0．68）n，高度（Z 轴）为（10．51±0．28）nm。
结论：单个胶体金标记的金黄色葡萄球菌A蛋白分子具有独特、稳定、均一的特征性构象，可作为原子力显微术观测的原位标记物。
性质特点临床常见葡萄球菌菌种(1)SPA存在于大多数金黄色葡萄球菌中，而不存在于表皮葡萄球菌中。
并且主要存在于血浆凝固酶阳性菌株，而不存在于阴性菌株中。
前者是致病的，后者是非致病的，但在体内研究中尚未发现SPA和菌株致病性之间有任何肯定的关系。
不同菌株间的SPA含量有明显差异，以I株金黄色葡萄球菌含SPA量最高，SPA和细胞壁的肽聚糖呈共价结合。
检验科生化脂蛋白(a)测定的标准操作规程
检验科生化脂蛋白(a)测定的标准操作规程【目的】体外检测血清脂蛋白(a)含量。
【职责】1.实验室工作人员均应熟知并严格遵守本SOP，室负责人监督落实。
2.本SOP的改动，可由任一使用本SOP的工作人员提出，并报经下述人员批准签字：室负责人、科主任。
【标本类型及实验前准备】1.受检者的准备病人空腹12h，不饮酒24h后采集血样。
体检对象抽血前应有两周的的正常状况记录。
妊娠后期各项血脂都会增高，应在产后或中哺乳后3个月检验才能反应其基本血脂水平。
注意有无应用影响血脂的药物，如降血脂药、避孕药等。
此外，对于体检者，采血的季节都应做相关记录，因为血脂水平有季节性变动，为了前后比较应在每年同一季节检验，应嘱体检对象在抽血前24小时内不做剧烈运动。
2. 静脉采血除非是卧床的病人，一般在采血时取坐位。
体位影响水分在血管内外的分布，会影响测试项目的浓度。
在采血前至少应静坐5分钟，一般从肘静脉取血，使用止血带的时间不超过1分钟，穿刺成功后立即松开止血带。
【仪器设备】东芝TBA-FX8全自动生化分析仪，低速离心机一、检测原理样本中的脂蛋白（a）与包被有特异脂蛋白（a）抗体的胶乳颗粒反应，发生凝聚反应。
凝聚反应使反应溶液中的浊度增加，并在一定范围内与样本中的脂蛋白（a）的浓度成正比，通过在600nm波长处测定吸光度的变化值，即可测得样本中脂蛋白（a）的浓度。
二、试剂1.试剂本科使用上海复星长征医学科技有限公司LP(a)试剂盒，为液体双试剂。
各组分如下：试剂1（R1）叠氮化钠 1.0 g/L甘氨酸缓冲液 40 mmol/L试剂2（R2）脂蛋白（a ）抗体致敏胶乳颗粒叠氮化钠 1.0 g/L2.校准要求2.1校准品：使用与试剂配套使用的复星长征校准品对测定进行校准。
2.2 校准间隔2．2．1 试剂批号变更时，使用与试剂配套使用的复星长征校准品对测定进行校准后再对临床病人样本进行测定。
2．2．2 室内质量控制出现问题时使用与试剂配套使用的复星长征校准品对测定进行校准并确认问题得到解决后方可对临床病人样本进行测定。
蛋白质的功能性质
pH和溶解度
▪ 大多数食品Pro.酸性（即Pro. 分子中Asp\Glu 残基 总和大于Lys\Arg\His残基总和），pH=4~5沉淀
▪ 所以，大多数食品蛋白质溶解度pH图是一条U形曲 线。最低溶解度出现在蛋白质pI附近
⑴pH：
在pI由于蛋白质 – 蛋白质相互作用增强，使得蛋 白质与水相互作用最弱，所以蛋白质水合力最低； 而高于或低于pI，由于净电荷和推斥力的增加，使 蛋白质肿胀结合较多水。 大多数蛋白质结合水能力在pH=9~10比任何pH来 的大。
⑵离子强度：
▪ 低盐浓度（<0.2mol/L）盐能提高蛋白质的结 合水能力。盐离子与蛋白质的结合并没有影响蛋白 质分子上带电基团的水合壳层， 蛋白质结合水能力 的增加基本上来自于结合离子自身缔合的水；高盐 浓度，更多的水与盐离子结合，导致蛋白质脱水。
▪ 清蛋白 能溶于pH=6.6水
例:血清清蛋白质,卵清蛋白质
▪ 球蛋白
能溶于pH=7.0稀盐溶液
例:大豆蛋白质
▪ 谷蛋白 溶于酸(pH=2)碱(pH=1.2)溶液
例:小麦谷蛋白质
▪ 醇溶谷蛋白 能溶于70%乙醇
例:玉米醇溶蛋白质
6、术语: ▪ 水溶性蛋白质（WSP）
water soluble protein ▪ 水可分散蛋白质（WDP）
四、温度和溶解度
▪ 在恒定pH和离子强度，大多数蛋白质溶解度在0-
40℃范围内随T↑，而↑ ▪ 特例：β-酪蛋白和一些谷类蛋白质其溶解度与T呈
负相关性。 ▪ 原因：当T>40℃热动能↑导致蛋白质结构展开
（变性）于是原先埋藏在蛋白质结构内部的非极性 基团暴露，促进了聚集和沉淀使蛋白质溶解度↓
生物化学名词解释
名词解释血脂：血浆中脂类的总称，包括甘油三酯TG，磷脂PL，游离胆固醇FC，胆固醇酯CE，游离脂肪酸FFA血浆脂蛋白：甘油三酯和胆固醇不溶于水，不能直接在血液运输，借助载体蛋白和极性类脂合成微溶于水的大分子复合物高脂血症：血浆中TC和（或）TG水平升高高脂蛋白血症：血浆中CM，VLDL，LDL，HDL等脂蛋白出现一种或几种浓度过高的现象酸碱平衡：机体通过各种调节机制，排出体内多余的酸性或碱性物质，调节体液酸碱物质含量及其比例，维持体液pH在正常范围内氧解离曲线：以血氧饱和度为纵坐标，PO2为横坐标所得的曲线P50：使Hb氧饱和度达到50%时的PO2碱剩余：在标准条件下，即温度37℃，一个标准大气压、PCO2为40mmHg、Hb 完全氧合时，将1L全血的pH调整到7.40时所需加入的酸量或碱量血钙：血浆中的钙，可分为扩散钙和非扩散钙。
生物转化：机体对非营养物质进行代谢转变，使其极性增加，水溶性增强，易于排出的过程血液中主要以胆红素－清蛋白复合物的形式存在和运输，肝细胞中运输以葡萄糖醛酸黄疸：胆红素呈金黄色，由于胆红素在组织细胞内沉积而造成的黄染现象内生肌酐清除率：肾单位时间内，把若干ml血浆中的内生肌酐全部清除出去的能力（能早期反映肾小球的滤过功能）肾小球滤过率：单位时间内两肾生成的原尿量心肌损伤标记物：当心肌细胞损伤时，可大量释放至循环血液中，其血液浓度变化可反映心肌损伤及其程度的特异性物质激素：机体某些内分泌腺或内分泌细胞合成并直接分泌入血的生物活性物质，经血液循环送达并作用于靶器官，靶细胞，调节特定的代谢和生理过程填空，选择，判断超速离心法密度由大到小（颗粒由小到大）：高密度脂蛋白HDL，低密度脂蛋白LDL，极低密度脂蛋白VLDL，乳糜微粒CM电泳法：乳糜微粒，阝，前阝和∝脂蛋白（CM，LDL，VLDL，HDL）CM主要载脂蛋白B48外源性甘油三酯TGVLDL主要载脂蛋白B100内源性甘油三酯LDL载脂蛋白B100内源性胆固醇TCHDL载脂蛋白Aⅰ，Aⅱ胆固醇的逆向转运载脂蛋白Cⅱ，激活LPL（脂蛋白脂肪酶）LDL升高是动脉粥样硬化AS的首要导致血脂测定的四个基本标准：TC，TG，HDL－C，LDL－C细胞外液阳离子以Na＋，阴离子Cl－。
蛋白质--生物化学
• Damaged, defective, misfold, and mutant proteins are rapidly degraded via the ubiquitin pathway, and accumulation of undegraded protein can lead to disease. • Ubiquitin-dependent proteolysis plays a major role in the regulation of cellular events. Eg: -ubiquitin-dependent destruction of a cyclin allows cells to pass from the M phase into G1.
Mitochondrial proteolytic system
cytoplasmic proteins
endosomelysosome system
Mitochondria Lysosome/ endosome
Ubiquitinproteasome system
Autophagosome
ER proas inflammation, cell damage, or deficiency of growth factors can either directly activate caspases or cause mitochondria to release cytochrome C and other factors that activate a caspase cascade and result in the rapid degradation of cellular proteins.
免疫沉淀IP
免疫沉淀(Immunoprecipitation, IP)原理IP是利用抗原蛋白质和抗体的特异性结合以及细菌蛋白质的“protein A/G"特异性地结合到抗体(免疫球蛋白)的FC片段的现象开发出来的方法。
目前多用protein A/G预先结合在argarose beads上，使之与含有抗原的溶液及抗体反应后，beads上的prorein A/G就能达到吸附抗原的目的。
通过低速离心，可以从含有目的抗原的溶液中将目的抗原与其它抗原分离。
免疫沉淀实验的操作步骤比较多，同时由于在非变性条件下进行实验，所以要得到一个完美的实验结果，不仅需要高质量的抗体，同时对免疫沉淀体系也需要有严格的控制指标。
免疫沉淀实验从：蛋白样品处理；抗体-agarose beads孵育；抗体-agarose beads复合物洗涤到最后的鉴定，每步都非常关键，需要严格控制实验流程中每个关键步骤的质量，才能最终达到你的实验目的。
IP实验步骤基本实验步骤(1)收获细胞，加入适量细胞IP裂解缓冲液(含蛋白酶抑制剂)，冰上或者4℃裂解30min，12,000g离心30 min后取上清；(2) 取少量裂解液以备Western blot分析，剩余裂解液将1μg相应的抗体和10-50 μl protein A/G-beads加入到细胞裂解液，4°C缓慢摇晃孵育过夜；(3)免疫沉淀反应后，在4°C 以3,000 g速度离心5 min，将protein A/G-beads离心至管底；将上清小心吸去，protein A/G-beads用1ml裂解缓冲液洗3－4次；最后加入15μl 的2×SDS 加样缓冲液，沸水煮10分钟；(4)SDS-PAGE, Western blotting或进行质谱分析。
一、样品处理：免疫沉淀实验成功与否，第一步处理样品非常关键。
免疫沉淀实验本质上是处于天然构象状态的抗原和抗体之间的反应，而样品处理的质量决定了抗原抗体反应中的抗原的质量，浓度以及抗原是否处于天然构象状态。
免疫沉淀步骤及问答--abmart
免疫沉淀步骤及问答--abmartIP实验原理 (来源abmart)免疫沉淀(Immunoprecipitation, IP)原理IP是利用抗原蛋白质和抗体的特异性结合以及细菌蛋白质的“protein A/G"特异性地结合到抗体(免疫球蛋白)的FC片段的现象开发出来的方法。
目前多用protein A/G预先结合在argarose beads上，使之与含有抗原的溶液及抗体反应后，beads上的prorein A/G就能达到吸附抗原的目的。
通过低速离心，可以从含有目的抗原的溶液中将目的抗原与其它抗原分离。
免疫沉淀实验的操作步骤比较多，同时由于在非变性条件下进行实验，所以要得到一个完美的实验结果，不仅需要高质量的抗体，同时对免疫沉淀体系也需要有严格的控制指标。
免疫沉淀实验从:蛋白样品处理;抗体-agarose beads孵育;抗体-agarose beads复合物洗涤到最后的鉴定，每步都非常关键，需要严格控制实验流程中每个关键步骤的质量，才能最终达到你的实验目的。
IP实验步骤基本实验步骤(1)收获细胞，加入适量细胞IP裂解缓冲液(含蛋白酶抑制剂)，冰上或者4?裂解30min， 12,000g离心30 min后取上清;(2) 取少量裂解液以备Western blot分析，剩余裂解液将1μg相应的抗体和10-50 μl protein A/G-beads加入到细胞裂解液，4?C缓慢摇晃孵育过夜;(3)免疫沉淀反应后，在4?C 以3,000 g速度离心5 min，将protein A/G-beads离心至管底;将上清小心吸去，protein A/G-beads用1ml裂解缓冲液洗3,4次;最后加入15μl的2×SDS 加样缓冲液，沸水煮10分钟;(4)SDS-PAGE, Western blotting或进行质谱分析。
一、样品处理:免疫沉淀实验成功与否，第一步处理样品非常关键。
免疫沉淀实验本质上是处于天然构象状态的抗原和抗体之间的反应，而样品处理的质量决定了抗原抗体反应中的抗原的质量，浓度以及抗原是否处于天然构象状态。
常见蛋白质标签
常见蛋白质标签总结2008-12-08 22:06Protein tags are peptide sequences genetically grafted onto a recombinant protein. Often these tags are removable by chemical agents or by enzymatic means, such as proteolysis or intein splicing. Tags are attached to proteins for various purposes.一、氨基酸标签（含小肽标签）A stretch of amino acids is added to the protein and enables the recovery of the labelled protein by its unique affinity. Usually its easiest to add the tag to either end of the protein to ensure its accessibility and not to disturb the protein folding.组氨酸标签（His tag）一般为6个组氨酸，用Ni2+ （Cu2+）亲和层析纯化FLAG tag ：N-DYKDDDDK-C ，recovered with specific antibodyHA tag：an epitope derived from the Influenza protein haemagglutinin (HA，禽流感病毒血凝素)，e.g. N-YPYDVP-C，recovery with an HA antibodyMYC tag：an epitope derived from the human proto-oncoprotein MYC，e.g.N-ILKKATAYIL-C, N-EQKLISEEDL-C，recovery with an MYC antibodySBP tag：Streptavidin Binding Peptide，链霉亲合素结合肽，38 amino acid tag (MDEKTTGWRGGHVVEGLAGELEQLRARLEHHPQGQREP)，更多参考在SigmaCBP tag：钙调蛋白结合肽（CBP; 26aa）钙调蛋白结合肽与钙调素结合是Ca2+依赖的，这种结合不受标签所处的位置影响（N端和C端均可），在中性pH条件下使用2mM EGTA可以很方便的将目标蛋白洗脱下来。
刀豆蛋白A
糖类结合蛋白质
01 简介
03 提取分离 05 用途
目录
02 结构特性 04 稳定性
基本信息
刀豆蛋白A（Concanavalin A，缩写ConA）是一种糖类结合蛋白质，又叫刀豆球蛋白A、伴刀豆球蛋白、刀 豆素、刀豆凝集素，是一种植物血凝素，具有强力的促有丝分裂作用，有较好的促淋巴细胞转化反应的作用，其 促淋巴细胞转化最适浓度为40-100μg/ml，能沉淀肝糖原，凝集羊、马、狗、兔、猪、大鼠、小鼠、豚鼠等动物 及人红细胞。还能选择性激活抑制性T细胞（Ts）细胞，对调节机体免疫反应具有重要作用。
简介
简介
刀豆属豆科，因豆荚形似刀而得名“刀豆”，又因荚形似人挟剑横斜，故又名“挟剑豆”。刀豆性味甘、温， 功效温和中下气，益肾补元，治虚寒呃逆、呕吐、腹胀、肾虚腰痛、痰喘。刀豆种子内含伴刀豆球蛋白 ( Concanavalin A，简称 ConA)、脲酶( Urease)、L-刀豆氨酸( L-Canavanine)、胰蛋白酶抑制剂( Trypsin inhibitors)等物质。其中，ConA是一种植物血球凝集素( Phytohemagglutin)，其本质是一类多价的、非免疫 来源的、对糖及其缀合物高度专一识别的蛋白质。它在植物体内的作用是促进种子的成熟和发芽，储存蛋白质， 转移糖，防御病原微生物，促进细胞生成等。它通过各种机制对动物产生抗营养作用，为刀豆种子中的抗营养因 子。在刀豆种子中，ConA的含量较为丰富，占总蛋白的1% ～3%。
结构特性
Hale Waihona Puke 结构特性自刀豆和豌豆等籽粒中提取而得的一种植物凝集素。为四聚体球蛋白，分子量。每个亚基含237个氨基酸残 基，分子量，结合一个Ca2+和一个Mn2+，含一个糖结合部位。能与α-甘露糖、α-葡萄糖(细胞膜糖蛋白上)专一 地结合，结合位点要求是α-D-吡喃甘露糖或α-D吡喃葡萄糖六元环中的C-3/C-4和C-6未被取代羟基。能与以α1，2糖苷键连接的甘露二糖和甘露三糖有最大的亲和力 。
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蛋白 A 、蛋白 G 、蛋白L
蛋白A (Protein A) 是金黄色葡萄球菌的一个株系的细胞壁蛋白，它通过Fc区与哺乳动物的IgG结合，天然的Protein A，42kDa，含有四个Ig Fc结合位点，其中2个是有活性的，而用于纯化抗体的，一般是重组的protein A，含有4个Ig Fc区域结合位点。
蛋白A作为亲和配基被偶联到琼脂糖基质上即蛋白A琼脂糖（protein A agarose），可以特异性的和样品中的抗体分子结合，而使其他杂蛋白不结合，具有极高的选择性。
1个蛋白A 分子至少可以结合2个IgG。
天然蛋白A 和重组的蛋白A对于IgG的Fc段有着相似的特异结合。
但重组的蛋白A经改造后含有一个C末端半胱氨酸，可以单一位点偶联于琼脂糖上，降低了空间位阻，增加了与抗体的结合能力。
蛋白A与IgG的结合强度很大成度上依赖于该抗体的种属和亚型，蛋白A琼脂糖常用于免疫沉淀鼠IgG2a, IgG2b, IgA, 兔IgG, 以及人的IgG1, IgG2和IgG4几种抗体。
蛋白G是一种源自链球菌G族的细胞壁蛋白，分子量25kDa，为三型Fc受体。
蛋白G可以与IgG的Fc 区域特异性结合，与Protein A相比对IgG具有更好的结合能力，血清蛋白结合水平更低，纯度更高，配基脱落也相对更低。
重组蛋白G已经除去了与白蛋白及细胞表面结合位点，减少了交叉反应和非特异性结合。
因此，它比天然蛋白G和蛋白A有更大的亲和力。
蛋白G作为亲和配基被偶联到琼脂糖基质上即蛋白G琼脂糖（protein G agarose），可以特异性的和样品中的抗体分子结合，Protein G能结合所有的人和鼠的IGG抗体亚型，包括鼠的IGG1。
Protein G也可以与小鼠的IGG2a和IGG2b结合，而Protein A则不能。
Protein L是从马格努斯消化链球菌分离出来的能和免疫球蛋白特异性结合的蛋白质，分子量36Kd，与蛋白A和蛋白G结合到（抗体）的Fc区不同的是，蛋白L通过轻链相互作用结合的抗体。
因为重链的任何部分都不会参与结合相互作用，蛋白L结合更宽范围的抗体类大于蛋白A或G蛋白L结合所有抗体类，包括IgG，IgM，IgA的，IgE和IgD的代表。
尽管有很宽的结合范围内，蛋白质L不是一个通用的抗体结合蛋白。
L蛋白结合仅限于那些含有κ轻链的抗体，在人类和小鼠抗体，抗体分子除了包含κ轻链，其余有ι轻链。
例如，它结合人VκI，VκIII和VκIV亚型但不结合VκII亚型。
补充：Antibody and antibody fragment purification: MabAffinity & FabAffinity Platform
We offer an extensive product line of high-flow agarose based chromatography media and resins for fast and convenient purification of antibody and fragments of various species and subclasses from different sources, including recombinant protein A, protein G or protein L as affinity ligands.
Protein A, Protein G, and Protein L are native and recombinant proteins of microbial origin that bind to mammalian immunoglobulin molecules.The high chemical stability of these proteins makes them ideal choices as affinity chromatography ligands for repeated binding-elution and cleaning cycles.
Coupling these ligands with a high-flow agarose matrix gives our MabAffinity and FabAffinity separation toolboxes the power to do one-step antibody and antibody fragment purification at a very high yield.
Compared with cyanogen bromide activation, or other traditional mult-point attachment chemistries, our enhanced alkaline-stable and oriented coupling chemistry with long hydrophilic spacer arm not only extend greatly the pH range both for working and CIP with much better life time and less leakage, but also increase the exposure of coupled ligand to target with higher capacity for less steric hindrance .。