药品生产技术《谷氨酸发酵工艺流程》

一、谷氨酸简介谷氨酸一种酸性氨基酸，分子内含两个羧基，化学名称为α-氨基戊二酸。

为无色晶体，有鲜味，微溶于水，而溶于盐酸溶液，等电点。

大量存在于谷类蛋白质中，动物脑中含量也较多。

分子式C5H9NO4、分子量。

谷氨酸在生物体内的蛋白质代谢过程中占重要地位，参与动物、植物和微生物中的许多重要化学反响。

谷氨酸可生产许多重要下游产品如L—谷氨酸钠、L—苏氨酸、聚谷氨酸等。

氨基酸作为人体生长的重要营养物质，不仅具有特殊的生理作用，而且在食品工业中具有独特的功能。

谷氨酸钠俗称味精，是重要的鲜味剂，对香味具有增强作用。

谷氨酸钠广泛用于食品调味剂，既可单独使用，又能与其它氨基酸等并用。

谷氨酸为世界上氨基酸产量最大的品种，作为营养药物可用于皮肤和毛发。

用于生发剂，能被头皮吸收，预防脱发并使头发新生，对毛乳头、毛母细胞有营养功能，并能扩张血管，增强血液循环，有生发防脱发成效。

用于皮肤，对治疗皱纹有疗效。

脑组织只能氧化谷氨酸，而不能氧化其它氨基酸，故谷酰胺可作为脑组织的能量物质，改良维持大脑机能。

谷氨酸作为神经中枢及大脑皮质的补剂，对于治疗脑震荡或神经损伤、癫痫以及对弱智儿童均有一定疗效。

在工业上，聚谷氨酸可降解塑料，是环境友好材料。

谷氨酸发酵是典型的代谢控制发酵。

谷氨酸的大量积累不是由于生物合成途径的特异，而是菌体代谢调节控制和细胞膜通透性的特异调节以及发酵条件的适合。

谷氨酸产生菌主要是棒状类细菌，这类细菌中含质粒较少，而且大多数是隐蔽性质粒，难以直接作为克隆载体，而且此类菌的遗传背景、质粒稳定尚不清楚，在此类细菌这种构建适宜的载体困难较多。

需要对它们进行改建将棒状类细菌质粒与的质粒进行重组，构建成杂合质粒。

受体菌选用短杆菌属和棒杆菌属的野生菌或变异株，特别是选用谷氨酸缺陷型变异株为受体，便于从转化后的杂交克隆中筛选产谷氨酸的个体，用谷氨酸产量高的野生菌或变异菌作为受体效果更好。

供体菌株选择短杆菌及棒杆菌属的野生菌或变异株，只要具有产谷氨酸能力都可选用, 但选择谷氨酸产量高的菌株作为供体效果最好。

这样就可以较容易地在棒状类细菌中开展各项分子生物学研究。

有了适宜的载体及其转化系统后，就可通过DNA体外重组技术进行谷氨酸产生菌的改造。

这对以后谷氨酸发酵的低本钱、大规模、高质量有较大的开展空间。

二、谷氨酸发酵的工艺流程菌种的选育，培养基配制，斜面培养，一级种子培养，二级种子培养，发酵〔发酵过程参数控制通风量、glutamicum：生物素缺陷型、温度敏感型；北京棒杆菌、钝齿棒杆菌；短杆菌属：黄色短杆菌、天津短杆菌。

在已报道的谷氨酸生产菌中，除芽孢杆菌外，它们都有一些共同特点：革兰氏阳性，菌体为球形、短杆至棒状，不形成芽孢，没有鞭毛，不能运动，需要生物素作为生长因子，在通气条件下才能产生谷氨酸。

生产原料玉米、小麦、甘薯、大米等。

其中甘薯和淀粉最为常用，大米进行浸泡磨浆，再调成15B，调，加细菌α-淀粉酶进行液化，85℃30min，加糖化酶60℃糖化24h，过滤后可供配置培养基。

甘蔗糖蜜、甜菜糖蜜。

糖蜜原料因含丰富的生物素，不宜直接用来作为谷氨酸发酵的碳源。

预处理方法为，活性碳或树脂吸附法和亚硝酸法吸附或破坏生物素。

也可以再发酵液中参加外表活性剂或添加青霉素。

培养基制备谷氨酸发酵培养基组成包括碳源、氮源、无机盐和生长因子等。

碳源目前使用的谷氨酸生产菌均不能利用淀粉，只能利用葡萄糖、果糖等，有些菌种还能利用醋酸、正烷烃等做碳源。

在一定的范围内，谷氨酸产量随葡萄糖浓度的增加而增加，但假设葡萄糖浓度过高，由于渗透压过大，那么对菌体的生长很不利，谷氨酸对糖的转化率降低。

国内谷氨酸发酵糖浓度为125-150g/L，但一般采用流加糖工艺。

氮源常见无机氮源：尿素，液氨，碳酸氢铵。

常见有机碳源：玉米浆，豆浓，糖蜜。

当氮源的浓度过低时会使菌体细胞营养过度贫乏形成“生理饥饿〞，影响菌体增殖和代谢，导致产酸率低。

随着玉米浆的浓度增高，菌体大量增殖使谷氨酸非积累型细胞增多，同时又因生物素过量使代谢合成磷脂增多，导致细胞膜增厚不利于谷氨酸的分泌造成谷氨酸产量下降。

碳氮比一般控制在100:15—30。

生物素含硫水溶性维生素，是B族维生素的一种，又叫做维生素H 或辅酶R。

广布于动物及植物组织，已从肝提取物和蛋黄中别离，是多种羧化酶辅基的成分。

生物素的作用主要影响谷氨酸生产菌细胞膜的通透性，同时也影响菌体的代谢途径。

生物素对发酵的影响是全面的，在发酵过程中要严格控制其浓度。

〔具体可看控制膜渗透性〕种子扩大培养斜面培养，谷氨酸生产菌适用于糖质原料，需氧，以生物素为生长因子，32℃培养18-24h。

一级种子在摇瓶机上振荡培养，培养基1000ml装2021250ml振荡，32℃，培养12h。

二级种子用种子罐培养，料液量为发酵罐投料体积的1%，用水解糖代替葡萄糖于32℃进行通气搅拌7-10h。

二级种子培养过程中，l，活力旺盛处于对数生长期。

各条件均逐步接近发酵条件〔培养基成分见培养基配制〕。

谷氨酸发酵在发酵罐中进行。

适应期，尿素分解氨使in把谷氨酸菌杀灭。

在发酵10h～14h污染噬菌体，仍是把发酵加热至45℃10min，压出发酵罐，进行分罐处理，一般可分成两罐来处理。

发酵18h后出现OD下跌，此时残糖在3％左右，出现耗糖缓慢或停止。

镜检没有发现菌体碎片，可能是溶源菌或发酵前期出现高温现象，造成菌体自溶。

处理方法补入4u-5u单位纯生物素，压入相对同期的发酵液10％的量，继续发酵。

发酵结果比同期发酵结果略差。

细胞膜渗透性控制控制磷脂的合成细胞膜磷脂含量低，有利于提高细胞膜通透性。

油酸缺陷型：油酸缺陷型突变株阻断了油酸的合成，丧失了脂肪酸生物合成的能力。

甘油缺陷型：甘油缺陷型菌株的遗传阻碍是丧失α-磷酸甘油脱氢酶，自身不能合成α-磷酸甘油和磷脂。

温度敏感突变株：其突变位置发生在与谷氨酸分泌有密切关系的细胞膜的结构基因上，发生碱基的转换或颠换，这样为基因所指导释出的酶，在高温时失活，导致细胞膜某些结构的改变。

控制细胞壁的合成细胞壁合成不完全，细胞膜容易造成机械损伤和经不起渗透压的压力，造成膜的破坏，加大通透性。

对数生长期早期，添加青霉素或头孢霉素C。

青霉素抑制细胞壁的后期合成。

提取工艺谷氨酸提取的根本方法有：等电点结晶法，特殊沉淀法，离子交换法，溶剂萃取法，液膜萃取法。

味精公司的提取技术是先用高速离心法从发酵液中别离出菌体，再浓缩3倍后加硫酸调pH使谷氨酸结晶，提取收率约90％。

目前国内从发酵液中提取L-谷氨酸普遍采用的步骤是先用等电点法结晶大量L-谷氨酸，母液采用732阳离子交换树脂浓缩其中的L-谷氨酸，洗脱得到的谷氨酸溶液，再回到等电罐进行结晶回收提取收率约90-95％。

这种工艺存在着以下的缺陷：①在结晶和离子交换过程中要使用大量的硫酸调节发酵液和母液的pH，造成环境污染；②在低温下交换，高温下洗脱，使树脂反复的溶胀收缩，使用寿命缩短；③等电点废液中存在大量NH4离子，用氢型树脂进行交换时，NH4离子可与L-谷氨酸离子进行竞争，使L-谷氨酸的收率降低。

谷氨酸钠现行生产工艺：可以看出现在味精生产均采用先从谷氨酸铵发酵液别离谷氨酸半成品，用NaOH或Na2CO3进行中和转化为谷氨酸一钠，经脱色、浓缩、精制而成味精的根本工艺。

因此在提取工艺中，需要完成：谷氨酸铵→谷氨酸→谷氨酸一钠的产品转化过程。

而此转化过程需要消耗大量的酸碱，产生大量环境污染，提高生产本钱。

生产工艺直接等电点方法〔少数锌盐法〕→等电离交方法→浓缩连续等电点法〔少数厂家采用〕。

等电点法还能分成常温、中低温、一次低温〔盐酸、硫酸〕，带菌体浓液一次等电点法。

别离方式：间歇三足式离心机→连续锥兰式别离机、沉降式别离机、带式滤过机。

水解等电法：谷氨酸发酵液经适当浓缩后，参加盐酸进行加压水解，此时菌体蛋白质被水解，而发酵液中残糖等有机杂质遭破坏可过滤出去，滤液在经脱色和浓缩后，用碱液中和至谷氨酸的等电点，在低温下放置，让谷氨酸结晶析出。

此法的有点在于菌体蛋白质中谷氨酸得到了利用，并且发酵液中的谷氨酰胺和焦谷氨酸都变成了谷氨酸，所以谷氨酸提取收率比拟高，但是工艺复杂。

流程如下：发酵液-----浓缩-----用盐酸水解-----过滤-----滤液脱色-----浓缩-----用碱液中和浓缩液，控制PH值-----低温放置，析出晶体。

低温等电点法：当溶液的PH值等于谷氨酸等电点时，谷氨酸的溶解度最小。

例如，30℃，溶解度为，5℃，溶解度小于，因此可以采用低温等电点法，将谷氨酸从发酵液中提取结晶。

流程如下：发酵液边冷却边用盐酸调节pH值-----pH值～发酵液-----加晶种-----25℃育晶2h-----边冷却便调节pH值～发酵液-----搅拌16h-----4℃静置4h-----谷氨酸晶体。

低温连续等电点法：目前我国味精生产厂多数采用一次低温等电点法，对于谷氨酸含量%～%的发酵液其提取收率为75%～80%。

优点是析出晶体颗粒粗易别离，大小均匀，光泽度好适用于不正常发酵液谷氨酸的提取。

具体操作如下：发酵液在等电点罐中采用低温等电点法结晶，待析晶完全后以晶体及母液作为种子，维持一定的温度和pH值，然后一边连续添加新发酵液一边放料，进出料量保持一致，放出的物料在育晶罐中让晶体长大，育晶结束以后进行别离得到谷氨酸晶体。

鉴别通过革兰氏染色法可鉴别发酵终点的判断确定放罐的指标有：产物的产量、过滤速度、氨基氮的含量、菌丝形态、pH值、发酵液的外观和粘度等。

发酵终点的掌握，就要综合考虑这些参数来确定。