大鼠脑微血管内皮细胞的培养与鉴定

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糖尿病大鼠骨髓内皮祖细胞的培养与鉴定

长。培养第７天细胞Ｃ３Ｄ４和Ｃ１３均呈阳性，光共聚焦显微镜观察显示ＥＣ可以同时吞噬ａ —ＬＬ并结合ＵＡ一１Ｄ３激ＰｃＤＥ。论糖尿病大鼠骨髓可以分离培养出内皮祖细胞，能体外扩增，糖尿病内皮祖细胞的移植研究奠定了基础。并为
关键词糖尿病骨髓内皮祖细胞
ＣｌｒａｄＩｅｔｃｔｎｏｎｏｅａＰｏｅｉｒｅｓｒｍＢｎｒｏｆｉｅｃａＨａｇＱｒｎ，ＹｈＸｎｊｎＬｕｙ昭，ｕｕｅｎｎｆａｏｆｄｔｌｌｒｇｎｏｌｏｏｅｔｄｉｉｉＥｈｉｔＣｌｆＭａｒｗｏａｔｔＤｂｉＲ．ｕｎｉｇａｉｕ，ｉ０ｏｇ
ｄａｅｉａ．ＭｅｈｏＭｏｏｎｃｅｒｃｌｒａｖｓｅｒｍｏｅｍａｗｆｄａｔｃｒｔｂｅｉｒｄｅｅｎｒｆｇｔｏｎｒｎｉｂｔｃｒｔｔｄｓｎｕｌａｅｌｗｅｅｈｒｅｔｄｆｏｂｎ￣ｏｏｉｂｅｉａｙｄｎｓｔｇａｉｎｔｃｔｉｕａｉｎａｄｗｅｅｉ — ｓｙｄｃｄｉ１ｄｕｍｏｔｉｉｇＶＥＧＦａｄｂｕｅｎＭ９９ｍｅｉｃｎａｎｎｎＦＧＦ．ＴｈｐｅｉｉｏｅｎｅｐｅｓｏｆｅｄｏｈｌａｏｇｎｉｒｃｌｓｆｒＣＤ３ｎｅｓｃｆｐｒｔｉｘｒｓｉｎｏｎｔｅｉｌｐｒｅｔｅｌｏｃｏ４ａｄＣＤ１３３ｗｅｅｏｓｒｅｍｍｕｈｓｏｈｍｉｔｙａｄｉｍｕｏｌｏｅｅｎｅｈｏｏｉａｕｃｉｎｆｅｏｈｅｉｌｐｒｇｎｔｒｃｌｒｘｍｉｄｂｒｂｅｖｄｂｙｉｎｏｉｔｃｅｓｒｎｍｎｆｕｒｓｅｃ．Ｔｅｂｉｌｇｃｌｆｎｔｏｓｏｎｄｔｌｏｅｉｏｅｌｗｅｅｅａｎｅｙａｓ

大鼠肺微血管内皮细胞培养方法研究进展

生和发展都是以内皮细胞受损为基础，肺微血管内皮细胞在病理条件下，不仅是炎症反应的主要靶细胞，更是活跃的炎症细胞和效应细胞。

其功能和结构的完整性对于维持正常肺功能至关重要，这种特殊的细胞类型是研究肺功能不全及许多肺部疾病发生机制的理想细胞模型来源[4]。

近年，从生物化学、细胞生物学及分子生物学等方面探究内皮细胞生理功能的研究课题日益增多，有助于更全面认识PMVECs并了解其相关机制，进而可对相关疾病进行预防和治疗[5]。

近20年，国内外对PMVECs的研究取得众多成果，但其养困难、成本高、重复性差、易污染等问题，降低了培养成功率，因此建立完整高效的PMVECs培养方法意义重大。

本文总结了PMVECs培养的一般方法，具体流程，见图1。

图1 皮细胞培养一般流程1 肺微血管内皮细胞培养法1.1 原代培养肺微血管内皮细胞原代培养是指从活体生物中将肺组织取下进行培养，在完成首次传代培养之前的细胞都称为原代培养[6]。

国内外研究报道的肺微血管内皮细胞的方法主要有2种，一是组织块贴壁法[7-10]，二是酶消化法[11]。

2种方法各有利弊，组织块法操作简单、细胞成活率高、成本低、可减少因酶消化造成的细胞损伤，但是细胞迁出时间不好把握且组织块去除不彻底会造成其他杂细胞污染等。

酶消化法培养周期快、细胞生长速率快，但是消化时间和酶浓度不好控制，细胞成活率可能会因为消化时间过长受到影响。

1.1.1 组织块贴壁法组织块贴壁法是指将取自活体生物的组织，在无菌条件下剪成1×1×1 mm3小块，平铺在培养器皿中，加入含胎牛血清的培养基在37 ℃5%CO2条件下培养的方法。

组织块贴壁法的一般操作步骤：先去除组织胸膜，将去除胸膜的肺组织剪下1～3 mm左右的肺组织边缘，切成1×1×1 cm3组织块，用基础培养基DMEM清洗多次，至少3次，均匀地贴在25 cm2的培养瓶中，放入5% CO2 37 ℃的培养箱中培养1 h，等组织块贴壁后，加入完全培养基DMEM（20%FBS、ECGS、肝素钠、双抗等），放入培养箱中16 h以上，去除未贴壁的组织块，加入新的培养基，以后每2～3 d更换1次培养基。

改良的大鼠心肌微血管内皮细胞培养方法

１．２动物和试剂选用６～８周龄Ｗｉｓｔａｒ雄性大鼠（约６０～１００ｇ）
（上海斯莱克实验动物中心）。ＤＭＥＭ高糖培养基
（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，美国）；鼠尾胶（自制）；胰蛋白酶（１：２５０，Ａｍｅｒｅｓｃｏ，美国）；胎牛血清（ＦＢＳ，Ｇｉｂｃｏ，美国）；兔抗鼠ＣＤ３４单克隆抗体、兔抗鼠ＣＤ３１单克隆抗体（ＡｎｔｉｂｏｄｙＤｉａｇｎｏｓｔｉｃａＩｎｃ，美国）；兔抗人
比例：ＣＤ３４、ＣＤ３１为１：５００，ＶＩＩＩ因子为１：２００。
本文２Ｏ１２ —１２一Ｏ８收到，２０１３－０１ —１６修回，２Ｏ１３一Ｏ１ —１８接受
矗曩厦学杂志
２０１３年第２３卷第１期
圜篓一
篓
ＶＩＩＩ因子相关抗原多克隆抗体（ＤＡＫＯ，丹麦）；抗
兔及抗鼠ＡＢＣ试剂盒、ＤＡＢ显色试剂盒、ＦＩＴＣ标记羊抗兔ＩｇＧ（Ｂｅｙｏｔｉｍｅ，中国）；其余化学试剂为国产分析纯商品。１．３实验用肝素的配制
ｍ饵讲学杂志，２０１３。２３（１）：３９－－－４０
⑥ ２０１３ＣＨＩＮＥＳＥＪＯＵＲＮＡＬＯＦＭＩＣＲＯＣＩＲＣＵＬＡＴＩＯＮ

大鼠内皮祖细胞的分离培养与鉴定

大鼠内皮祖细胞的分离培养与鉴定赵洪雯;余荣杰;李敛;刘宏;干磊;吴雄飞;曾玲【期刊名称】《重庆医学》【年(卷),期】2007(036)018【摘要】目的研究大鼠骨髓来源的内皮祖细胞的分离培养和鉴定方法.方法纤维连接蛋白提前包被培养瓶和培养板中的盖玻片.密度梯度离心法分离SD大鼠骨髓单个核细胞,EGM-2完全培养基,贴壁法,37℃, 5%CO2,饱和湿度的恒温培养箱中原代培养.部分培养瓶细胞消化后计数.其余培养瓶和培养板中盖玻片细胞继续培养,细胞近融合时传代,分别在第6、9、12和24天进行细胞鉴定.内皮祖细胞鉴定:免疫细胞化学的vWF和VEGFR-2染色;内吞DiI标记的乙酰低密度脂蛋白(DiI-AcLDL)和结合FITC标记的荆豆凝集素-1(FITC-UEA-1)的激光共聚焦显微镜观察.结果培养细胞的形态学改变:骨髓单个核细胞种植24h后部分细胞开始贴壁、变大,倒置显微镜下贴壁细胞透亮度增强,并逐渐伸出伪足样突起,呈小杆状或梭形.培养第3天贴壁细胞开始增殖,呈"集落"样生长,外周梭形细胞较多.第6天梭形细胞显著增多,培养至第12天左右,梭形细胞首尾相连,呈"毛细血管"样排列.培养第6天的细胞数量级为106～107/瓶.内皮祖细胞的鉴定:激光共聚焦显微镜观察显示细胞DiI-acLDL和FITC-UEA呈红绿免疫双荧光阳性.培养第6天细胞VEGFR-2和vWF免疫细胞化学染色呈阳性.结论大鼠的骨髓单个核细胞可以培养为内皮祖细胞,且数量级达到106～107,可以满足动物实验研究的需要.【总页数】5页(P1836-1839,封2)【作者】赵洪雯;余荣杰;李敛;刘宏;干磊;吴雄飞;曾玲【作者单位】第三军医大学西南医院,肾科,重庆,400038;第三军医大学西南医院,肾科,重庆,400038;第三军医大学西南医院,肾科,重庆,400038;第三军医大学西南医院,肾科,重庆,400038;第三军医大学西南医院,肾科,重庆,400038;第三军医大学西南医院,肾科,重庆,400038;第三军医大学西南医院,骨科,重庆,400038【正文语种】中文【中图分类】R365;Q25【相关文献】1.大鼠外周血内皮祖细胞分离培养与鉴定 [J], 杜公文;高维陆;张辉;尹宗生2.大鼠骨髓来源内皮祖细胞的分离培养及鉴定 [J], 戴小珍;王兰;潘克俭;何浪;李红;姜鹤群3.大鼠骨髓和外周血早晚期内皮祖细胞的分离培养和鉴定 [J], 王红娟;王娟;李楠;高航;刘亢丁;4.大鼠骨髓源性内皮祖细胞的分离培养与鉴定*☆ [J], 卫肖艳;张莉;林明;陈欢;彭博;彭园园;李富运;洪培馨;范伊凡5.大鼠骨髓源性内皮祖细胞的分离培养与鉴定 [J], 卫肖艳;张莉;林明;陈欢;彭博;彭园园;李富运;洪培馨;范伊凡;因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。

成年大鼠心肌微血管内皮细胞的分离与培养

成年大鼠心肌微血管内皮细胞的分离与培养陈小燕;樊梦雅;李慧;蒋易楠;靖静;张海龙【摘要】目的本文建立一种简便、高效的成年大鼠心肌微血管内皮细胞分离及培养的方法.方法选取7~8周龄Wistar大鼠,麻醉后开胸取出心脏,采用离体心脏灌流和酶消化法进行心肌微血管内皮细胞的分离;取第3代细胞观察其增殖特征并绘制增殖曲线;用免疫细胞化学和免疫荧光对细胞的第Ⅷ因子相关抗原和CD31进行鉴定,利用基质胶检验其血管形成能力.结果体外培养心肌微血管内皮细胞呈多边形或梭形,具有典型的铺路石样生长特点;同时,第Ⅷ因子相关抗原和CD31呈阳性;具备血管形成能力.结论本方法培养的成年大鼠心肌微血管内皮细胞具有较高的纯度,方法简便易行,可用于心血管疾病基础及临床研究.%Objective To establish a simple and efficient method for isolation and culture of adult rat cardiac micro-vascular endothelial cells. Methods Wistar rats were anesthetized and thoracotomy was performed. Cardiac micro-vascular endothelial cells were isolated by heart perfusion and enzyme digestion. The morphology and growth curve of the third generation cells were examined by inverted microsc opy. Its molecular markers factor Ⅷ-related antigen and CD31 were detected by immunocytochemistry and immunofluoresence. The angiogenic ability was examined by matrigel. Results The primary cultured cardiac microvascular endothelial cells in vitro were polygonal or fusiform with typical paving stone-like growth characteristics. At the same time,the cells were positive stained by factorⅧ-related antigen and CD31 and showed angiogenic ability. Conclusions Cardiac microvascular endothelial cells cul-tured by this method possess high purity. The method is easy tooperate and can be used for laboratory and clinical research of cardiovascular diseases.【期刊名称】《基础医学与临床》【年(卷),期】2018(038)004【总页数】5页(P530-534)【关键词】细胞培养;内皮细胞;成年大鼠;心肌微血管【作者】陈小燕;樊梦雅;李慧;蒋易楠;靖静;张海龙【作者单位】河南大学医学院抗体药物开发技术国家地方联合工程实验室河南省抗体药物国际联合实验室细胞与分子免疫重点实验室,河南开封475004;河南大学医学院抗体药物开发技术国家地方联合工程实验室河南省抗体药物国际联合实验室细胞与分子免疫重点实验室,河南开封475004;河南大学医学院抗体药物开发技术国家地方联合工程实验室河南省抗体药物国际联合实验室细胞与分子免疫重点实验室,河南开封475004;郑州大学基础医学院,河南郑州450001;河南大学医学院抗体药物开发技术国家地方联合工程实验室河南省抗体药物国际联合实验室细胞与分子免疫重点实验室,河南开封475004;河南大学医学院抗体药物开发技术国家地方联合工程实验室河南省抗体药物国际联合实验室细胞与分子免疫重点实验室,河南开封475004【正文语种】中文【中图分类】R331心肌微血管是深入心脏内的终末细小分支，在心脏内分布广泛，结构上与其他血管不同，由单层内皮细胞和细胞外基质组成；微血管内皮细胞在表型与功能上均表现出不同于大血管内皮细胞的异质性，且其性质与功能在不同组织器官之间也具有显著差异[1]。

354.大鼠肺微血管内皮细胞的培养

基金项目:国家自然科学基金资助项目(No .30370561);河北省自然科学基金资助项目(No .C2004000639)作者单位:075029　河北张家口,河北北方学院病理生理教研室第一作者简介:陈瑞华(1966-),男,汉族,张家口人,副教授。

主要从事危重病的病理生理学研究。

△通信作者:ncylxf@s ohu .com文章编号:100728568(2007)0120016204・实验研究・大鼠肺微血管内皮细胞的培养陈瑞华,赵自刚,牛春雨△,张　静,张玉平【摘要】　目的　建立简单有效地获取大鼠肺微血管内皮细胞(P MVEC )的培养方法。

方法　从实验动物、培养基、植块方法、胎牛血清浓度等方面对植块培养法进行改进,应用W istar 雄性大鼠的肺组织,进行P MVEC 的原代培养并传代培养;通过倒置显微镜、扫描、透射电镜观察其形态,并进行免疫组织化学鉴定。

结果　体外培养的大鼠P MVEC 呈梭形或多角形,形成单层后呈典型的鹅卵石样或铺路石样排列,获得的血管内皮细胞纯度较高,抗Ⅷ因子阳性反应,成功建立了P MVEC 的原代培养方法。

结论　改进的植块培养法简便、可靠,获得的P MVEC 纯度高,生长状态良好,保持了内皮细胞的结构和功能,可用于其功能特性的进一步研究。

【关键词】　肺微血管;内皮细胞;细胞培养中图分类号:Q25 文献标识码:BCulture of Pul m onary M i crova scul ar Endotheli a l Cells i n Ra ts CHEN R u i 2hua,ZHAO Z i 2gang,N I U Chun 2yu,ZHAN J ing,ZHAN G Yu 2ping .D epa rt m en t ofPa thophysiololgy,Hebei N orth U n iversity,Z hang jiakou 075029,China【Abstract 】　O bjecti ve T o devel op a si m p le and rep r oductable method for the is olati on and p ri m aryculture of pul m onary m icr ovascular endothelial cells (P MVECs )of rats .M ethods The tissue bl ock pasted culture method was i m p r oved in experi m ent ani m al,culture -mediu m,tissue bl ock method,fetal bovine ser 2u m (F BS )and s p reading slide method .Rats P MVECs were p ri m ary cultured with lung tissue bl ock pasted methods using lung tissue of male W istar rats,and the cell mor phol ogy was observed using inverted m icr oscope and electr on m icr oscope,and identified using i m munohist oche m ical methods .Results The cultured P MVECs of rats in vitr o showed fusif or m shape or polygon,and the monolayer cultures dis p layed a typ ical cobblest one or pavingst one mor phol ogy and were inhibited when contacted each other,the P MVECs exp ressed fact or Ⅷass o 2ciated antigen.And the p ri m ary culture of P MVEC was established successfully .Conclusi on The pure pul 2monaryMVECs of rats can be attained rap idly and easily by the described method .The method is si m p le,eco 2nom ic and reliable,availability of these cells will facilitate further functi onal character studies .【Key words 】　Pul m onary m icr ovessel;Endothelial cell;Cell cultivati on 微血管内皮细胞衬附于血管内壁,定位于进行血液-组织交换的微血管,它不仅是构成血管组织间屏障的重要成分,而且在调节机体内环境的稳定、维持正常生理和免疫功能,以及介导疾病的发生、发展和转归等方面都发挥主要的作用。

体外培养大鼠心肌微血管内皮细胞缺氧模型的建立

ＴｈｅＣＭＥＣｓｗｅｒｅｃｕｌｔｕｒｅｄｂｙｔｈｅｍｅｔｈｏｄｏｆｐｌａｎｔｉｎｇｍｙｏｃａｒｄｉｕｍｔｉｓｓｕｅ．Ｉｔｓｓｐｅｃｉｆｉｃａｎｔｉｇｅｎｗｅｒｅｏｂｓｅｒｖｅｄｂｙｉｍｍｕｎｏｃｙｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ．
ｒａｔｉｏｎｏｆｌｏｗｏｘｙｇｅｎｄａｍａｇｅｍｏｄｅｌ（Ｉ），ｗｉｔｈｎｏｒｍａｌｓｅｒｕｍｆｒｅｅｏｘｙｇｅｎｔｒａｉｎｉｎｇａｓｔｈｅｃｏｎｔｒｏｌｇｒｏｕｐ（Ｎ）．Ｉｎｖｅｒｔｅｄｐｈａｓｅｃｏｎｔｒａｓｔｍｉ — ｃｒｏｓｃｏｐｅｏｂｓｅｒｖａｔｉｏｎｏｆｃｅｌｌｍｏｒｐｈｏｌｏｇｉｃａｌｃｈａｎｇｅｓｂｅｆｏｒｅａｎｄａｆｔｅｒｈｙｐｏｘｉａ，ＭＴＴｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｅｃｅｌｌｖｉｔａｌｉｔｙ，ＡｎｎｅｘｉｎＶ —ＦＩＴＣａｎｄＰＩｄｏｕｂｌｅｍａｒｋｉｎｇｍｅｔｈｏｄｔｏｄｅｔｅｒｍｉｎｅｃｅｌｌａｐｏｐｔｏｓｉｓｒａｔｅ．ＲｅｓｕｌｔｓＣｕｌｔｕｒｅｄｒａｔＣＭＥＣｓｈａｓｔｈｅｔｙｐｉｃａｌｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓｏｆｍｉｃｒｏｖａｓｃｕｌａｒ

新生大鼠心脏微血管内皮细胞的分离培养及鉴定

新生大鼠心脏微血管内皮细胞的分离培养及鉴定
周燕琼;郭福晓;贾强用;张艳美;郑燕珊;李乐娜;石刚刚
【期刊名称】《汕头大学医学院学报》
【年(卷),期】2008(21)3
【摘要】目的:介绍一种改良的心脏微血管内皮细胞(CMECs)的分离培养及鉴定方法。

方法:应用酶消化法分离大鼠CMECs,再用差速贴壁进行纯化。

结果:用光学显
微境、免疫细胞化学法进行第Ⅷ因子相关抗原染色来鉴定CMECs,其纯度约98%。

结论:该法简单且经济。

【总页数】4页(P135-136)
【关键词】新生大鼠;心脏微血管内皮细胞,分离,培养,鉴定
【作者】周燕琼;郭福晓;贾强用;张艳美;郑燕珊;李乐娜;石刚刚
【作者单位】汕头大学医学院药理学教研室;汕头大学医学院第一附属医院泌尿风
湿病区
【正文语种】中文
【中图分类】R-332;R322.11
【相关文献】
1.改良大鼠心脏微血管内皮细胞的培养方法及鉴定 [J], 周蓉芳;李莉;严静
2.大鼠脊髓微血管内皮细胞的分离培养与鉴定 [J], 苑晓晨;李炳蔚;秦伟伟;武清斌;
荆瀛黎;李宏伟;刘淑英;修瑞娟
3.大鼠心肌微血管内皮细胞的分离培养和鉴定 [J], 滕丽新;刘胜学;谢庭菊;何作云
4.大鼠脑皮质微血管内皮细胞的分离培养及鉴定 [J], 张磊;胡格;张涛;林红;索占伟;段慧琴;穆祥
5.SD大鼠心脏微血管内皮细胞的分离及培养 [J], 朱世辉;苏波;唐洪泰;李元义;刘世康;陈玉林;葛绳德
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hexarelin对ox-LDL引起的大鼠脑微血管内皮损伤的保护作用

亡，高ｅＯ提ＮＳ的表达水平，少蛋白质的硝基化程度。结论减
提示ｈｘｒｉｅａｌｅｎ对脑动脉粥样硬化可能有一定抑制作用。
ｈｘｒｌｅａｉ有效抑制由Ｏｅｎ能Ｘ—ＬＬ引起的脑微血管内皮细胞损伤，Ｄ
Ｄｉｈｎｈａ，Ｘａ，ＨａｉａｉｎｅａｔｎｆＰｙｉｌｇｎａｈｐｙｉｌｇａｏｇｕＺｕＨｏＷｅ，ＣｏＪｍｉ．ＤｐｒｍｅｔｏｈｓｏｏｙａｄＰｔｏｈｓｏｙ，ＩｓｉｔＢａｉＭｅｉａｃｎｅｈ— ｏｎｔｕｅｏｔｆｓｄｃｌＳｉｃｓＣｉｃｅｎｓｃｄｍｙｏｄｃｌｃｎｅ，ＳｈｏｓｄｃｎｅｉｇＵｉｎＭｅｉｌｏｌｅｅｉｇ１００ＣｉａｅｅＡａｅＭｅｉａｉｃｓｃｏｌＢａｉＭｅｉｉｅＰｋｎｎｏｄｃｌｇ，Ｂｑｎ００５，ｈｎｆＳｅｆｏｃａＣｅＡｂｔａｔＯｂｅｔｅＴｎｅｔａｅｔｅｐｏｅｔｅｅｆｃｓｏｅａｅｉｎｏ－ＤＬｉｄｃｄｅｄｔｅｉｌｎｕｙｉａｅｅｒｌｃｏ－ｓｒｃｊｃｉｏｉｖｓｉｔｈｒｔｃｉｆｔｆｘｒｌｏｘ—Ｌｎｕｅｎｏｈｌｊｒｎｒｔｒｂａｒ・ｖｇｖｅｈｎａｉｃｍｉ
ｈｘｒｌｎ０／Ｘ—Ｌｅａｅｉａｄ５ｍｇＬＯｎＤＬ（ｅｈｘ＋ＯＸ—Ｌｒｕ）ＤＬｇｏｐ．ＣｏｔｌｃｌｓｗｅｅｔａｅｉＢ（ｏｔｏｇｏｐ）ｅｌｖａｉｔｗｓａ・ｎｒｅｌｒｒｔｄｗｔＰＳｃｎｒｌｒｕ．Ｃｌｉｂｌｙａｓｏｅｈｉ

大鼠股动脉血管原代内皮细胞的分离与培养

-596•安徽医科大学学报Ada Unwersitatis Medicinalis Anhut2621Apr；56(4)网络出版时间：2621-3-116：50网络出版地址：https：//k/ki.3W/kcms/dwPH34.1025.R.26216317.1521.html大鼠股动脉血管原代内皮细胞的分离与培养刘倩，韩陈陈,罗婷婷，张雨，李浩，马场，魏伟摘要目的体外分离、培养并鉴定大鼠股动脉血管原代内皮细胞,为相对较小血管来源的原代内皮细胞功能研究提供细胞模型。

方法无菌取大鼠股动脉血管，胶原酶消化大鼠股动脉血管内皮细胞使其分离,流式细胞术检测内皮细胞纯度;流式分选出CD30阳性细胞，并用激光共聚焦鉴定内皮细胞;以CCK-C法、高内涵细胞成像法检测内皮细胞增殖能力，以法、Mv/gW胶法检测其迁移和成管功能。

结果胶原酶消化分离所得股动脉血管原代内皮细胞在2627-29-17接收基金项目：国家自然科学基金（编号：51562123、51330051、51273444）作者单位:安徽医科大学临床药理研究所，合肥230234作者简介:刘倩，女,硕士研究生；魏伟，男，博士，教授，博士生导师，责任作者,E-mVi：wwei@ahmu.efu.ch；马场，女，博士，副教授，责任作者，E-mail:mayane_ahmu@ 14~16d细胞覆盖培养瓶面积的2/3以上，细胞呈现典型铺路石状。

流式检测其纯度为3&34%,分选后利用CD30进行荧光染色鉴定，细胞均为CD30阳性；PGE3可显著上调CD30阳性内皮细胞增殖、迁移、成管功能。

结论该研究采用简便的方法成功分离得到股动脉血管原代内皮细胞,为研究相对较小血管来源的原代内皮细胞功能提供体外细胞模型。

关键词大鼠;股动脉;原代血管内皮细胞;分离培养;鉴定中图分类号R394.26；R322.120文献标志码A文章编号1000-1492（2620）04-0566-05 doi：r6.19465/p cnki.isspl000-0492.2621.04.hl7根据血管的结构、功能和运输方向差异,分为动脉、静脉和毛细血管。

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相类似。

本研究提示SARS 病毒并非来源于人工驯养的野生动物,而是来源于野生动物,其中蛇、鹰、蛤蚧、鳖最为可能。

广西原发病例接触病死猫后发病,因而老鼠仍很可能是SARS 病毒的最原始宿主,但其极低携带率和极低病毒量不但难于直接传给人类,而且也难检测到阳性老鼠。

SARS 抗体阳性的鹰,蛇、龟、蛤蚧均为食肉动物,而且高空飞翔的鹰和冬眠的蛇均有利于病毒繁殖和携带的低氧分压状态。

这些野生动物通过对鼠等动物的猎食而感染、富集。

然后在其体内繁殖和携带。

当被人类猎捕后,在冬末早春气温较暖湿度大的南方,长途运输严重缺氧使病毒发生变异,形成毒力和侵袭力强的SARS 病毒,在贩运人员和厨师近距离接触和捕杀过程中受伤感染而发病,然后通过家人护理或就医的医院医护人员诊疗中密切接触造成人间传播和暴发流行。

2003年我国成功扑灭SARS 的疫情,其中严格禁止捕猎贩运和宰杀野生动物是最主要的措施之一,与本研究结果相吻合。

因此,应禁止捕猎贩运和宰杀野生动物、每年冬春季节加强对发热肺炎病人监测,尤其是捕猎贩运和宰杀野生动物史或实验室病源研究史的发热肺炎病人监测排查、同时大搞爱国卫生运动、降低甚至消除鼠类等传播疾病的病原媒介是防范SARS 的发生和控制扑灭SARS 疫情的首要措施。

至于疑为SARS 病毒最原始宿主鼠类和蝙蝠及其通过食物链进入二级宿主野生动物的过程和机理仍有待以进一步的研究。

(参加本文工作的还有杨庆利、钟革、蓝光华、冯向阳、熊绮梦、陈岳波、韦东禄、刘志高、石友盟、李建民、蒙世安,在此一并致谢)参　考　文　献1　王汉章,王茂武,王建伟,等主编1传染性非典型肺炎防治培训教材(修订版).北京:中国协和医科大学出版社,2003.3210.2　廖祯华主编.广西壮族自治区地图集.北京.星球地图出版社.2003.42247.广西医科大学学报　2006Feb ;23(1)3广西区卫生厅资助课题(Z2002098)收稿日期:2005202201大鼠脑微血管内皮细胞的培养与鉴定3滕晓茗　周微雅　黄　燕　周祥祯(广西壮族自治区人民医院　南宁　530021)摘要　目的:探讨大鼠脑微血管内皮细胞体外培养方法,为血管内皮细胞的研究打下基础。

方法:用胶原酶消化大鼠脑皮质制成细胞悬液再进行培养;用光镜、电镜及免疫组化检测进行鉴定。

结果:分离的大鼠脑微血管内皮细胞体外培养一周左右可长成单层,光镜下为多角形或扁平梭形,呈“铺路石样”排列,透射电镜可见Weibel 2Palade 小体。

第Ⅷ因子相关抗原免疫组化测定阳性。

结论:该分离细胞培养法可培养出大鼠的脑微血管内皮细胞。

关键词　脑微血管;内皮细胞;体外培养中国图书资料分类法分类号　R331;R322113THE METH ODS OF CU LTURING AN D IDENTIFYING CEREBRAL MICR OVASCU LAR EN 2DOTHE L IAL CE LL IN RATSTeng Xiaoming ,Zhou Weiya ,Huang Yan ,et al.(The People ’s Hospital of Guangxi Zhuang Autonomous Region ,Nanning 530021China )Abstract Objective :To explore t he met hods of cult uring rat cerebral microvascular endot helial cells (RC 2M ECs ),so as to build up t he basis for t he st udies of vascular endot helial cells.Methods :After t he RCM EC were digested wit h collagenase Πto make suspension which are cultivated ,t he RCM EC were identified by immunohistochemical met hods and observed wit h light micro scope and elect ron microscope.R esult :Isolated RCM ECs grow to mo nolayer after one week of external cultivation.They present polygonal and arrange like pavement stones under light micro scope.Weibel 2Palade (W 2P )body can be seen under transmission e 2lect ron micro scope.Correlation antigens of Ⅷfactor are positive by fluorescent stain.Conclusion :The met hods for t he cultivation and identification of RCM ECs could cultivate cerebral microvascular endot helialcells.K ey w ords cerebral microvascular ;endot helial cell ;cultivation in external・05・广西医科大学学报　2006Feb ;23(1) 以往体外培养的血管内皮细胞主要来自动物胸、腹大动脉和人脐静脉,随着血管内皮细胞研究的发展,微血管内皮细胞的培养技术越来越受到人们的重视。

本文探讨一种酶溶液消化大鼠脑皮质的脑微血管内皮细胞培养方法。

1　材料与方法111　材料:RPMI 21640培养基、L 2谷氨酰胺、优质胎牛血清购自美国G ibco 公司;胶原酶Ⅱ型、促内皮细胞生长因子(ECGF )、D 2Hanks 液购自美国sigma 公司;第Ⅷ因子相关抗原抗体(福州新生物技术开发公司);右旋糖酐(武汉生命技术有限公司);青霉素、链霉素、肝素(华北制药)。

112　仪器:CO 2孵箱(德国Heraeus 公司);超净工作台(苏净集团安泰公司);相差显微镜(日本OL YMPS )113　动物:清洁级Wistar 大鼠2只、雄性,购自广西医科大学实验动物中心。

114　方法11411　培养液的配制:取一袋RPMI 21640粉剂溶于950ml三蒸水中,加210gNa HCO 3、016g L 2谷氨酰胺后充分搅拌使完全溶解,用三蒸水定容至1000ml ,用1mol/L NaO H 调p H 至618～710,滤过除菌(p H710～712)、分装后于4℃保存备用。

使用时加入20%胎牛血清、ECGF 、肝素25U/ml 、青霉素100IU/ml 、链霉素100mg/L 及L 2谷氨酰胺2mmol/L 。

11412　原代内皮细胞的分离及培养:①将大鼠处死,去头皮。

取出头颅并浸入75%的乙醇中消毒约1min ,在无菌状态下迅速取出大鼠大脑。

需小心剔除大血管和软脑膜;②将脑皮质剪下放入D 2Hanks 液中,漂洗数次后,将其剪碎。

再移入含0105%胰蛋白酶的小瓶内,在37℃水浴中消化10～20min ;③用有血清培养液中止消化。

置于玻璃研磨器内研磨,制成粗悬液。

经孔径为110μm 的尼龙筛网过滤,将滤液以4000r/min 离心10min ;④弃离心后的上清液。

给沉淀加入15%右旋糖酐溶液,重新悬浮沉淀后以4000r/min 离心20min 。

收集微血管片段;⑤用011%胶原酶消化10～20min 后加血清终止酶活性,用Hanks 液洗涤并离心去上清液后,给微血管片段加入RPMI 21640培养液;⑥接种到培养瓶中,置37℃、5%CO 2培养箱中(湿度100%)培养;⑦24h 后换液,将未贴壁的微血管段移入其它培养瓶继续贴壁生长。

之后每3d 换液一次,待内皮细胞生长密度达90%时,即可传代。

11413　传代内皮细胞的培养:0125%胰蛋白酶消化液均匀分布于细胞表面,在相差显微镜下观察见细胞变圆,间隙增大,则用含血清培养液中止消化、轻轻吹打,2000r/min 离心,1传2或3,余培养过程同原代培养。

11414　内皮细胞的观察及鉴定:①相差显微镜下形态学观察;②电镜下超微结构观察;③细胞生长曲线观察:将细胞5×104/ml ,分别接种于7只50ml 培养瓶中常规培养,以后每天取一瓶细胞用0125%胰蛋白酶消化收集细胞,用白细胞计数法[1]计算每瓶细胞每毫升活细胞数,一共观察7d ,并划出生长曲线;④第Ⅷ因子相关抗原的免疫组化检测。

将细胞接种于盖玻片上,用丙酮固定20min ,PBS 冲洗5min ×3次,011%TritonX 2100内浸20min 之后PBS 冲洗5min ×3次,3%H 2O 22甲醇室温下10min 阻断内源性过氧化物酶,滴加10%非免疫动物血清封闭10min ,加一抗F Ⅷ37℃湿盒孵育1h ,常规冲洗后加生物素标记二抗孵育10min ,加链霉菌抗生物素一过氧化物酶溶液孵育10min ,DAB 显色,苏木素复染、酒精脱水干燥,中性树胶封固,同时设立非血管内皮细胞为阴性对照组。

2　结　果211　细胞形态学观察:原代细胞24h 后,大部分细胞贴壁。

传代细胞015～2h 贴壁80%～90%,6～8d 长满瓶壁,呈“鹅卵石样”或“铺路石样”排列生长。

细胞呈多角形或扁平梭形,核卵圆形、可见核仁,见图1。

212　透射电镜下可见Weibel 2Palade (W 2P )小体(见图2)。

213　细胞生长曲线:3d 后细胞生长旺盛(见图3)。

214　第Ⅷ因子相关抗原阳性,胞浆中含棕黄色反应物质(见图4)。

图1　细胞多角形或扁平梭形,呈“铺路石样”排列,胞核卵圆形,可见核仁(×100)图2　W 2P 小体(×15000)・15・滕晓茗,等1大鼠脑微血管内皮细胞的培养与鉴定图3　内皮细胞生长曲线图4　S 2P 免疫组化染色法示胞浆中含棕黄色的阳性反应(×400)3　讨　论血管内皮细胞是衬附于血管内壁的一层细胞,它不仅是构成血管细胞间屏障重要成分,而且在调节血管舒缩状态、释放血管活性物质、调节机体内环境的稳定,维护正常生理功能等方面发挥重要作用。

因此,血管内皮细胞的研究具有重要意义,来源于大鼠脑微血管内皮细胞因脑皮质薄、血管细小、收集到的血管内皮细胞极其有限而使培养难以成功,选择酶的适宜消化浓度和控制好消化时间是培养成功的关键[2],脑微血管内皮细胞分离是将剪碎的脑皮质浸泡在消化酶中,酶的消化一般呈由外向里,最后被消化下来的细胞才是内皮细胞。