《基因克隆的策略》PPT课件
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《目的基因的克隆》PPT课件
2021/4/25
1
一般来说，目的基因的克隆战略分为两另一类是利用PCR扩增技术甚至化学合成法体外直接合成目的基因 ，然后将之克隆表达。
2021/4/25
5’ A
A PCR扩增产物 5’
T7 lacZ MCS ori 5’
T
Apr T T 载体 5’
2021/4/25
6
3. PCR盒式引物扩增法
5‘ 端不含磷酸基 团
变性 引物退火
Sau3A部分酶切 加装盒式接头片段
2021/4/25
扩增
染色体DNA
7
2021/4/25B 基因的构建基因的基本概念 基因文段之间存在部分重叠区
第二，保证DNA片段大小均一
超声波处理后的DNA片段呈平头末端，需加装人工接头
部分酶切法一般选用四对碱基识别序列的限制性内切酶，如：
Sau3AI或MboI等，这样DNA酶解片段的大小可控
连接前，上述处理的DNA片段必须根据载体的装载量进行分级
分离，以杜绝不相干的DNA片段随机连为一体！
电脑分析指纹图谱，如发现任何两个克隆DNA的指纹图谱有 部分相同的，则其两个YAC片段就有互相重叠的可能性，于是 这两个YAC克隆的DNA片段克隆在染色体上是排列一起的
2021/4/25
20
酶切片段末端标记法
H
H
H
H
S S SS S SS S S
克隆DNA
载体DNA
S S SSS
十克隆指纹图谱
SS SS S
2021/4/25
单
将若干YAC克隆固定在薄膜上，并复制二十份薄膜；合成20种 不同序列的短探针，其序列是随机的
用20种探针随机定位杂交（一对一）20份YAC克隆薄膜 如果某两个克隆同时对同一种探针呈现杂交阳性反应，则这两 个克隆有可能是相互重叠的。若将杂交阳性结果记为“1”，而 阴性结果记为“0”，可清晰地列成一张表，最终排出上述YAC 克隆的排列顺序
基因克隆操作过程PPT课件
Takara网站提供的同尾酶信息
.
12
2011-10-23
基因克隆操作过程
12
5'
TGATCA
ACTAGT
5'
BclI
5'
GGATCC
CCTAGG
BamHI
GGATCC
CCTAGG
5'
5'
T
5' GATCA
ACTAG 5'
T
5'
a)获得连接方 向不同的两种 5' 产物；
退火
T GATCC ACTAG G
5'
GCATGCCCCCC G
C GGGGGGACGTC
CTGCAGGGGGG C
G CCCCCCGTACG
5'
CTGCAGGGGGG C
G CCCCCCGTACG
5'
Klenow
T4-DNA ligase
PstI
5'
GCATGCCCCCCTGCAG
CGTACGGGGGGACGTC
PstI
CTGCAGGGGGGCATGC
C
C
3' CCCCCCGTACG
G 3' GGGGGGACGTC
CTGCAGGGGGG 3' G
退火
5'
GCATGCCCCCC G
C GGGGGGACGTC
CTGCAGGGGGG C
G CCCCCCGTACG
5'
Klenow
T4-DNA ligase
5'
GCATGCCCCCCTGCAG
CGTACGGGGGGACGTC
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基因克隆操作过程
12
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TGATCA
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5'
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5'
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CCTAGG
BamHI
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CCTAGG
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5'
T
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T
5'
a)获得连接方 向不同的两种 5' 产物；
退火
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GCATGCCCCCC G
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CTGCAGGGGGG C
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5'
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5'
Klenow
T4-DNA ligase
PstI
5'
GCATGCCCCCCTGCAG
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PstI
CTGCAGGGGGGCATGC
C
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G 3' GGGGGGACGTC
CTGCAGGGGGG 3' G
退火
5'
GCATGCCCCCC G
C GGGGGGACGTC
CTGCAGGGGGG C
G CCCCCCGTACG
5'
Klenow
T4-DNA ligase
5'
GCATGCCCCCCTGCAG
CGTACGGGGGGACGTC
目的基因的分离和克隆PPT课件
用超声波或高速搅拌DNA溶液 断裂片段两端没有与克隆载体匹配的粘末端, 因此插入
载体之前还需要进行修饰加工，少用
②限制性内切酶降解（鸟枪法）
过去用EcoRⅠ,现在用Sau3A
断裂片段两端有与克隆载体匹配的粘末端，可以直接与 处理过的载体连接。
• ⑶ DNA片断与载体的连接包装
• 常用载体：粘性质粒 λ噬菌体
数量分布及大小 将扩增好的cDNA（即许多带有cDNA重组体大肠杆菌培养皿内所形成的菌落或噬菌斑）转印到硝酸纤维素膜上，碱解后加带标记 的探针进行杂交，能显示特异结合探针的点（克隆）便是目的基因所在处。
• 二、目的基因与载体的连接 适配子连接法（带有相应酶切点的粘性末端）
TCGCCGGCGCTTAA－5’ 二、根据目的基因本身特点中最有效简捷的途径。 mRNA差异显示（mRNA differential display DD）PCR法全称为内含子) 可在原核/真核表达 ⑴反复循环便于获得大量的基因拷贝 In（1－P） 若目的基因序列短小可化学合成。 1）以Oligo(dT) 为引物：从模板3’末端开始，沿模板的3’→5’方向合成, 对于较长的mRNA分子很难得到全长cDNA ②基因组DNA + λ噬菌体 ——重组DNA—包装成噬菌体——感染细菌 噬菌斑 ：
3. mRNA中拷贝数大于基因组中的拷贝数, 利 于获得较多的模板。（转录特征）
4. 可在原核细胞中表达有生物活性蛋白 5. 不同种类不同状态的细胞的cDNA不同 6. 不能研究基因组的结构功能
构建cDNA1.制备mRNA1)取材：mRNA约占总RNA的1－5％，所以应选 用目的基因mRNA表达最丰富的组织细胞为材 料来源，如获胰岛素基因，由应以胰岛β细胞 为原始生物材料，细胞因子基因应选用经抗原 或丝裂原刺激培养的淋巴细胞为材料
载体之前还需要进行修饰加工，少用
②限制性内切酶降解（鸟枪法）
过去用EcoRⅠ,现在用Sau3A
断裂片段两端有与克隆载体匹配的粘末端，可以直接与 处理过的载体连接。
• ⑶ DNA片断与载体的连接包装
• 常用载体：粘性质粒 λ噬菌体
数量分布及大小 将扩增好的cDNA（即许多带有cDNA重组体大肠杆菌培养皿内所形成的菌落或噬菌斑）转印到硝酸纤维素膜上，碱解后加带标记 的探针进行杂交，能显示特异结合探针的点（克隆）便是目的基因所在处。
• 二、目的基因与载体的连接 适配子连接法（带有相应酶切点的粘性末端）
TCGCCGGCGCTTAA－5’ 二、根据目的基因本身特点中最有效简捷的途径。 mRNA差异显示（mRNA differential display DD）PCR法全称为内含子) 可在原核/真核表达 ⑴反复循环便于获得大量的基因拷贝 In（1－P） 若目的基因序列短小可化学合成。 1）以Oligo(dT) 为引物：从模板3’末端开始，沿模板的3’→5’方向合成, 对于较长的mRNA分子很难得到全长cDNA ②基因组DNA + λ噬菌体 ——重组DNA—包装成噬菌体——感染细菌 噬菌斑 ：
3. mRNA中拷贝数大于基因组中的拷贝数, 利 于获得较多的模板。（转录特征）
4. 可在原核细胞中表达有生物活性蛋白 5. 不同种类不同状态的细胞的cDNA不同 6. 不能研究基因组的结构功能
构建cDNA1.制备mRNA1)取材：mRNA约占总RNA的1－5％，所以应选 用目的基因mRNA表达最丰富的组织细胞为材 料来源，如获胰岛素基因，由应以胰岛β细胞 为原始生物材料，细胞因子基因应选用经抗原 或丝裂原刺激培养的淋巴细胞为材料
《基因克隆与表达》课件
总结基因克隆与表达的重要性，并鼓励进一步学习和研究。
2 留下问题和展望
引发学生对基因克隆与表达的思考和问题，并展望该领域的未来发展。
什么是基因克隆与表达
解读基因克隆与表达的定义， 了解其在基因研究中的作用。
基因克隆和表达的重要 性
探讨基因克隆与表达在科学 研究和应用中的重要价值。
课程大纲介绍本课程的内容和学习 Nhomakorabea 标，为后续的学习做好准备。
基因克隆
基因克隆是获取目标基因及其背后的DNA片段的过程。PCR、限制性酶切和连接反应是基因克隆中常用的关键 技术。
2 重组蛋白表达
探讨重组蛋白表达的步骤以及在基因工程和生物医药领域中的可行表达体系选择。
3 基因治疗
介绍基因治疗的原理和在疾病治疗中的应用前景。
结论
在基因研究和应用中，基因克隆和表达起着至关重要的作用。通过了解相关技术和应用，我们可 以更好地理解基因的功能和探索其在生物科学中的潜力。
1 基因克隆和表达的重要性再强调
PC R
探讨聚合酶链式反应（PCR）在 基因克隆中的原理、步骤和应 用。
限制性酶切
介绍限制性酶切的原理及其在 基因克隆中的应用。
连接反应
讨论连接反应在基因克隆中的 原理、步骤和应用。
基因表达
基因表达是指利用转化和重组蛋白表达系统来实现基因功能研究和基因治疗的过程。
1 转化
深入解析转化的原理、步骤和转化后的检测方法。
《基因克隆与表达》PPT 课件
这是一份专业的《基因克隆与表达》PPT课件，将带你深入了解基因克隆和表 达的重要性以及相关技术。通过本课件，你将掌握基因克隆和表达的关键步 骤和应用。
简介
基因克隆与表达是研究基因结构和功能的重要方法。本课程将介绍基因克隆与表达的基本概念、原理和技术， 并探讨其在生物科学研究和应用中的重要性。
2 留下问题和展望
引发学生对基因克隆与表达的思考和问题，并展望该领域的未来发展。
什么是基因克隆与表达
解读基因克隆与表达的定义， 了解其在基因研究中的作用。
基因克隆和表达的重要 性
探讨基因克隆与表达在科学 研究和应用中的重要价值。
课程大纲介绍本课程的内容和学习 Nhomakorabea 标，为后续的学习做好准备。
基因克隆
基因克隆是获取目标基因及其背后的DNA片段的过程。PCR、限制性酶切和连接反应是基因克隆中常用的关键 技术。
2 重组蛋白表达
探讨重组蛋白表达的步骤以及在基因工程和生物医药领域中的可行表达体系选择。
3 基因治疗
介绍基因治疗的原理和在疾病治疗中的应用前景。
结论
在基因研究和应用中，基因克隆和表达起着至关重要的作用。通过了解相关技术和应用，我们可 以更好地理解基因的功能和探索其在生物科学中的潜力。
1 基因克隆和表达的重要性再强调
PC R
探讨聚合酶链式反应（PCR）在 基因克隆中的原理、步骤和应 用。
限制性酶切
介绍限制性酶切的原理及其在 基因克隆中的应用。
连接反应
讨论连接反应在基因克隆中的 原理、步骤和应用。
基因表达
基因表达是指利用转化和重组蛋白表达系统来实现基因功能研究和基因治疗的过程。
1 转化
深入解析转化的原理、步骤和转化后的检测方法。
《基因克隆与表达》PPT 课件
这是一份专业的《基因克隆与表达》PPT课件，将带你深入了解基因克隆和表 达的重要性以及相关技术。通过本课件，你将掌握基因克隆和表达的关键步 骤和应用。
简介
基因克隆与表达是研究基因结构和功能的重要方法。本课程将介绍基因克隆与表达的基本概念、原理和技术， 并探讨其在生物科学研究和应用中的重要性。
未知基因克隆策略及进展PPT49页
未知基因克隆策略及进展
11、战争满足了，或曾经满足过人的 好斗的 本能， 但它同 时还满 足了人 对掠夺 ，破坏 以及残 酷的纪 律和专 制力的 欲望。 ——查·埃利奥 特 12、不应把纪律仅仅看成教育的手段 。纪律 是教育 过程的 结果， 首先是 学生集 体表现 在一切 生活领 域—— 生产、 日常生 活、学 校、文 化等领 域中努 力的结 果。— —马卡 连柯(名 言网)
13、遵守纪律的风气的培养，只有领 导者本 身在这 方面以 身作则 才能收 到成效 。—— 马卡连 柯 14、劳动者的组织性、纪律性、坚毅 精神以 及同全 世界劳 动者的 团结一 致，是 取得最 后胜利 的保证 。—— 列宁 摘自名言网
15、机会是不守纪律的。——雨果
66、节制使快乐增加并使享受加强。 ——德 谟克利 特 67、今天应做的事没有做，明天再早也 是耽误 了。——裴斯 泰洛齐 68、决定一个人的一生，以及整个命运 的，只 是一瞬 之间。 ——歌 德 9、懒人无法享受休息之乐。——拉布 克 70、浪费时间是一桩大罪过。——卢梭
92第九讲_Lecture_2_窃取基因的秘密：基因克隆策略_讲义
基因克隆是指在体外将外源基因插入载体，并引入细胞进行扩增，即进行基因的无性繁殖过程。
基因克隆是基因工程的目标之一。
其中基因的体外重组是基因克隆的中心环节。
这节课我们主要学习如何进行基因的体外重组。
基因克隆的第一步是获得目的基因，即获得insert, 外源插入DNA片段。
获得目的基因有四种途径，分别是从基因组获得目的基因、从基因文库或cDNA文库获得目的基因、通过PCR获得目的基因以及通过人工合成获得目的基因。
获得的目的基因片段根据它们的来源，（图1）有的是黏性末端，有的是平齐末端，它们与载体的连接可采用不同的策略，如直接与载体连接，或采取其他不同的连接方式。
图 1 克隆策略概述若获得的目的基因片段具有黏性末端，可选用与其具有同样黏性末端的载体，通过DNA连接酶直接相连。
（图2 A）例如外源DNA插入片段具有EcoRI酶切位点，可选用多克隆位点上具有Eco RI酶切位点的载体如pUC18。
插入片段和载体用Eco RI酶切后，可直接将外源DNA插入到载体的lac z基因内。
（图2 B）对于左右两侧引物各含酶切位点的PCR产物的体外重组，可选用与之相同酶切位点的载体分子直接相连。
（图2 C）在构建基因组文库时，通常对基因组DNA采用Sau3AI作部分消化，选用具有常见的Bam HI切点的载体，由于Sau3AI和Bam HI为同尾酶，即酶的来源不同，识别位点不同，但可产生同样的黏性末端。
二者消化DNA后可直接相连。
图 2 A.使用pUC18载体直接克隆；B.PCR产物直接克隆；C.将Sau3A片段导入BamHⅠ位点对于平齐末端的DNA插入片段，（图3）可给其两端加上linker, 即衔接物。
衔接物一般为10bp长，通过DNA合成仪直接合成。
中间6bp为一酶切位点，两端2bp为保护性碱基。
衔接物通过DNA连接酶与插入片段连接后，再用相应的酶切，形成黏性末端。
图 3 Linker的使用（图4）也可直接给平齐末端的DNA插入片段连上adaptor, 即接头分子，使其直接具备某一限制性内切酶的黏性末端。
基因克隆的基本理论及实验技术ppt课件
基因克隆的基本理论及实验技术
基因克隆的基本概念及理论知识 第二课时: 基因克隆的操作过程及注意事项
第三课时: 实验操作过程演示(录像)
第一课
基因克隆的基本概念及理论知识
基因克隆的定义：
1. 工具书上： 插入有同一个基因或DNA片段的重组质粒的一个群体，这个群体 是由一个重组质粒增殖而来，通过基因克隆技术可获得某个基因或
PCR扩增 5’ 3’ 3’ 5’ 启动子区序列
基因的编码区及启动子区序列必须通过 连接到质粒上构建成重组表达载体，然 后进行目的片段扩增及功能研究。
什么是质粒（Plasmid）？
质粒是染色体外能够进行自主复制的遗传单位，包括真核生物的细 胞器和细菌细胞中染色体以外的脱氧核糖核酸(DNA)分子。现在习惯上用 来专指细菌、酵母菌和放线菌等生物中染色体以外的DNA分子。在基因 工程中质粒常被用做基因的载体。许多细菌除了染色体外，还有大量很 小的环状DNA分子，这就是质粒(plasmid)。
4969 bp
AMP+
真核表达载体
PCMV
EGFP
pCMV-EGFP
4749 bp
Neo/Kan-R SV40 polyA
目的蛋白表达载体中的表达盒
启动子（Promoter） 基因编码蛋白序列（CDS） 转录终止信号区（CDS）
基因克隆是将DNA或基因组的DNA片段嵌入 克隆载体，再将载体植入培养的宿主细胞，
质粒的重要特征
（1） 是染色质外的环形双链DNA分子； （2）能自主复制，是能独立复制的复制子；
（3）质粒对宿主生存并不是必需的；
（4）质粒上常带有耐抗生素基因； （5）质粒DNA上有多个酶切位点。
限制性核酸内切酶
基因克隆的基本概念及理论知识 第二课时: 基因克隆的操作过程及注意事项
第三课时: 实验操作过程演示(录像)
第一课
基因克隆的基本概念及理论知识
基因克隆的定义：
1. 工具书上： 插入有同一个基因或DNA片段的重组质粒的一个群体，这个群体 是由一个重组质粒增殖而来，通过基因克隆技术可获得某个基因或
PCR扩增 5’ 3’ 3’ 5’ 启动子区序列
基因的编码区及启动子区序列必须通过 连接到质粒上构建成重组表达载体，然 后进行目的片段扩增及功能研究。
什么是质粒（Plasmid）？
质粒是染色体外能够进行自主复制的遗传单位，包括真核生物的细 胞器和细菌细胞中染色体以外的脱氧核糖核酸(DNA)分子。现在习惯上用 来专指细菌、酵母菌和放线菌等生物中染色体以外的DNA分子。在基因 工程中质粒常被用做基因的载体。许多细菌除了染色体外，还有大量很 小的环状DNA分子，这就是质粒(plasmid)。
4969 bp
AMP+
真核表达载体
PCMV
EGFP
pCMV-EGFP
4749 bp
Neo/Kan-R SV40 polyA
目的蛋白表达载体中的表达盒
启动子（Promoter） 基因编码蛋白序列（CDS） 转录终止信号区（CDS）
基因克隆是将DNA或基因组的DNA片段嵌入 克隆载体，再将载体植入培养的宿主细胞，
质粒的重要特征
（1） 是染色质外的环形双链DNA分子； （2）能自主复制，是能独立复制的复制子；
（3）质粒对宿主生存并不是必需的；
（4）质粒上常带有耐抗生素基因； （5）质粒DNA上有多个酶切位点。
限制性核酸内切酶
基因克隆原理及实验介绍36页PPT
▪
27、只有把抱怨环境的心情，化为上进的力量，才是成功的保证。——罗曼·罗兰
▪
28、知之者不如好之者，好之者不如乐之者。——孔子
▪
29、勇猛、大胆和坚定的决心能够抵得上武器的精良。——达·芬奇
▪
30、意志是一个强壮的盲人，倚靠在明眼的跛子肩上。——叔本华
Байду номын сангаас谢谢！
36
39、没有不老的誓言，没有不变的承 诺，踏 上旅途 ，义无 反顾。 40、对时间的价值没有没有深切认识 的人， 决不会 坚韧勤 勉。
▪
26、要使整个人生都过得舒适、愉快，这是不可能的，因为人类必须具备一种能应付逆境的态度。——卢梭
基因克隆原理及实验介绍
36、“不可能”这个字(法语是一个字 )，只 在愚人 的字典 中找得 到。--拿 破仑。 37、不要生气要争气，不要看破要突 破，不 要嫉妒 要欣赏 ，不要 托延要 积极， 不要心 动要行 动。 38、勤奋，机会，乐观是成功的三要 素。(注 意：传 统观念 认为勤 奋和机 会是成 功的要 素，但 是经过 统计学 和成功 人士的 分析得 出，乐 观是成 功的第 三要素 。
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《基因工程概论》
第一章 导 论
第二章 基因操作的工具酶
第三章 基因克隆的载体
第四章 基因克隆的策略
第五章 克隆基因的表达
第六章 基因工程的基本技术
第四章
引 言
基因克隆的策略
第一节 目的基因的获得
第二节 重组体的构建及细菌转化 第三节 重组克隆的筛选和鉴定
引
言
基因克隆的本质是把某一目标DNA片段通过无性 的方式进行扩增和表达，而这一过程往往是通过载体 和寄主细胞来实现的。
一般而言，基因克隆包括四部分工作：1、目标 DNA片段的获得；2、克隆载体的构建；3、寄主细胞 的转化；4、重组体克隆的选择和鉴定。
目前，以大肠杆菌为寄主，以质粒和噬菌体等为 载体的基因克隆体系已经相当的成熟，本章将以这种 克隆模式为主体对基因克隆的策略展开讨论和分析。
大肠杆菌作为寄主进行DNA克隆的实验方案
DNA片段 的获得 限制性内 切酶消化 机械切割 双链cDNA 的合成 化学法 直接合成
载体构建
同聚物 加尾
粘性末端 连接
平末端 连接
加接头造成 粘性末端
细菌转化
重组噬菌体 DNA转染
重组质粒 的转化
体外包装 进行转导
重组体 的鉴定
表型鉴定
核酸杂交
免疫学分析
酶切鉴定
第四章
引 言
基因克隆的策略
第一节 目的基因的获得
1、化学法直接合成基因
基因的组装过程
方法1
ligase
方法1
Klenow fragments
MCS
第一节 目的DNA片段的获得rary）是指汇集了某一生物基因组 DNA全部序列 因组本身的大小和克隆DNA1981年Ish-Horowics 和Burke设计的特殊的 基因组克隆方案，选用 MboI或Sau3A进行基因 组DNA的酶切。不仅是 因为它们是4碱基识别 位点的酶，而且它们和 BamHI是同尾酶。
HindIII cos Sal I
倍于最低重组克隆数的克隆。
1975年，L. Clarke和J./ln(1-f)。其中，N代 表实际克隆数；p代表在重组群体中出现特定基因的几率（一 般的期望值都为99%）；f代表限制性片段的平均大小与相应 生物体基因组大小的比值。
克隆片段 2×106（细菌） 的平均 大小（bp） 理论数 实际数 5×103 10× 103 20× 103 40× 103 400 200 100 50 1831 919 458 278 基因组的大小（bp） 2×107 （真菌） 3×109 （动物） 理论数 实际数 理论数 实际数 4000 2000 1000 500 18 418 9 208 4 603 2 300 600 000 27 631 109 300 000 1 381 550 150 000 690 774 75 000 354 386
126 542 81 162 453
1978 1979 1981 1982 1982 1984
1、化学法直接合成基因
磷酸二酯法寡核苷酸片段的合成
首先，将一个5′端保护了的核苷酸和另一个3 ′端保护了的核 苷酸通过缩合反应形成一个带有磷酸二酯键的脱氧二核苷酸分子。 为了定向形成5 ′- 3 ′磷酸二酯键，通常用化学物质将不参加反应 的基团保护起来 基因 视紫红质 前脑菲肽 ATP酶 溶菌酶 RNA酶T1 RNA酶Ａ 大小（bp） 合成年代 1057 77 1985 170 1985 385 1985 324 1985 375 1986 1987
人胰岛素 转运RNA -干扰素 肠促胰液肽 克隆的，所以基因组大小除 以克隆片段大小得到的只是克隆数的理论值，从统计学的角度 分析，从这个理论克隆数中克隆到特定基因片段的几率只有 50%。当克隆数增加到这一理论值的2倍时，克隆到特定DNA 片段的几率就上升到75%。所以为了达到一种合理的度通常要大的多。所以必须通过一定的程序将 寡核苷酸片段连接起来构建成一个完整的基因。这种将多个寡 核苷酸片段装配成完整基因的过程称为基因的组装。
基因组装常用的有两种方法：一种方法是先将寡核苷酸 片段激活，带上5′磷酸基团，然后与相应的互补寡核苷酸片段 退火形成带有粘性末端的双链寡核苷酸片段，最后通过连接酶 将这些寡核苷酸片段逐个连接起来成为完整的基因。第二种 方法是将两条具有3 ′端互补的寡核苷酸单链进行退火，所产 生的单链区段可在Klenow酶的聚合作用下很快得到互补的延伸， 这样就可以得到一段连接好的双链寡核苷酸片段，以此类推便 可得到合成的基因片段。
反应结束后可以通过酸或碱的脱保护作用将保护基团去掉， 这样一个5 ′保护了的合成的二核苷酸分子就又能和一个3 ′端保护 了的单核苷酸分子进行第二次缩合反应形成一个三核苷酸的分子。 如此反复进行缩合反应，就可以合成一条特定的寡核苷酸片段。
1、化学法直接合成基因
基因的组装过程
通过化学合成的寡核苷酸片段只能达到150-200bp的长度，
第二节 重组体的构建及细菌转化 第三节 重组克隆的筛选和鉴定
第一节 目的DNA片段的获得
1、化学法直接合成基因 2、从基因组中钓取目的基因 3、从cDNA中钓取目的基因 4、通过PCR直接扩增出目的基因
1、化学法直接合成基因
所谓基因就是具有特定生物学功能的一段核苷酸序列，所以 只要掌握了其分子结构，完全可以在实验室进行人工合成。 1977年，K. Itakura利用化学途径首次合成了编码脑激素的 基因（生长激素释放因子基因），并在大肠杆菌中实现了成功的 表达。从此，化学合成基因得到了很大的发展迅速。
第一章 导 论
第二章 基因操作的工具酶
第三章 基因克隆的载体
第四章 基因克隆的策略
第五章 克隆基因的表达
第六章 基因工程的基本技术
第四章
引 言
基因克隆的策略
第一节 目的基因的获得
第二节 重组体的构建及细菌转化 第三节 重组克隆的筛选和鉴定
引
言
基因克隆的本质是把某一目标DNA片段通过无性 的方式进行扩增和表达，而这一过程往往是通过载体 和寄主细胞来实现的。
一般而言，基因克隆包括四部分工作：1、目标 DNA片段的获得；2、克隆载体的构建；3、寄主细胞 的转化；4、重组体克隆的选择和鉴定。
目前，以大肠杆菌为寄主，以质粒和噬菌体等为 载体的基因克隆体系已经相当的成熟，本章将以这种 克隆模式为主体对基因克隆的策略展开讨论和分析。
大肠杆菌作为寄主进行DNA克隆的实验方案
DNA片段 的获得 限制性内 切酶消化 机械切割 双链cDNA 的合成 化学法 直接合成
载体构建
同聚物 加尾
粘性末端 连接
平末端 连接
加接头造成 粘性末端
细菌转化
重组噬菌体 DNA转染
重组质粒 的转化
体外包装 进行转导
重组体 的鉴定
表型鉴定
核酸杂交
免疫学分析
酶切鉴定
第四章
引 言
基因克隆的策略
第一节 目的基因的获得
1、化学法直接合成基因
基因的组装过程
方法1
ligase
方法1
Klenow fragments
MCS
第一节 目的DNA片段的获得rary）是指汇集了某一生物基因组 DNA全部序列 因组本身的大小和克隆DNA1981年Ish-Horowics 和Burke设计的特殊的 基因组克隆方案，选用 MboI或Sau3A进行基因 组DNA的酶切。不仅是 因为它们是4碱基识别 位点的酶，而且它们和 BamHI是同尾酶。
HindIII cos Sal I
倍于最低重组克隆数的克隆。
1975年，L. Clarke和J./ln(1-f)。其中，N代 表实际克隆数；p代表在重组群体中出现特定基因的几率（一 般的期望值都为99%）；f代表限制性片段的平均大小与相应 生物体基因组大小的比值。
克隆片段 2×106（细菌） 的平均 大小（bp） 理论数 实际数 5×103 10× 103 20× 103 40× 103 400 200 100 50 1831 919 458 278 基因组的大小（bp） 2×107 （真菌） 3×109 （动物） 理论数 实际数 理论数 实际数 4000 2000 1000 500 18 418 9 208 4 603 2 300 600 000 27 631 109 300 000 1 381 550 150 000 690 774 75 000 354 386
126 542 81 162 453
1978 1979 1981 1982 1982 1984
1、化学法直接合成基因
磷酸二酯法寡核苷酸片段的合成
首先，将一个5′端保护了的核苷酸和另一个3 ′端保护了的核 苷酸通过缩合反应形成一个带有磷酸二酯键的脱氧二核苷酸分子。 为了定向形成5 ′- 3 ′磷酸二酯键，通常用化学物质将不参加反应 的基团保护起来 基因 视紫红质 前脑菲肽 ATP酶 溶菌酶 RNA酶T1 RNA酶Ａ 大小（bp） 合成年代 1057 77 1985 170 1985 385 1985 324 1985 375 1986 1987
人胰岛素 转运RNA -干扰素 肠促胰液肽 克隆的，所以基因组大小除 以克隆片段大小得到的只是克隆数的理论值，从统计学的角度 分析，从这个理论克隆数中克隆到特定基因片段的几率只有 50%。当克隆数增加到这一理论值的2倍时，克隆到特定DNA 片段的几率就上升到75%。所以为了达到一种合理的度通常要大的多。所以必须通过一定的程序将 寡核苷酸片段连接起来构建成一个完整的基因。这种将多个寡 核苷酸片段装配成完整基因的过程称为基因的组装。
基因组装常用的有两种方法：一种方法是先将寡核苷酸 片段激活，带上5′磷酸基团，然后与相应的互补寡核苷酸片段 退火形成带有粘性末端的双链寡核苷酸片段，最后通过连接酶 将这些寡核苷酸片段逐个连接起来成为完整的基因。第二种 方法是将两条具有3 ′端互补的寡核苷酸单链进行退火，所产 生的单链区段可在Klenow酶的聚合作用下很快得到互补的延伸， 这样就可以得到一段连接好的双链寡核苷酸片段，以此类推便 可得到合成的基因片段。
反应结束后可以通过酸或碱的脱保护作用将保护基团去掉， 这样一个5 ′保护了的合成的二核苷酸分子就又能和一个3 ′端保护 了的单核苷酸分子进行第二次缩合反应形成一个三核苷酸的分子。 如此反复进行缩合反应，就可以合成一条特定的寡核苷酸片段。
1、化学法直接合成基因
基因的组装过程
通过化学合成的寡核苷酸片段只能达到150-200bp的长度，
第二节 重组体的构建及细菌转化 第三节 重组克隆的筛选和鉴定
第一节 目的DNA片段的获得
1、化学法直接合成基因 2、从基因组中钓取目的基因 3、从cDNA中钓取目的基因 4、通过PCR直接扩增出目的基因
1、化学法直接合成基因
所谓基因就是具有特定生物学功能的一段核苷酸序列，所以 只要掌握了其分子结构，完全可以在实验室进行人工合成。 1977年，K. Itakura利用化学途径首次合成了编码脑激素的 基因（生长激素释放因子基因），并在大肠杆菌中实现了成功的 表达。从此，化学合成基因得到了很大的发展迅速。