07阿维菌素的生物合成研究进展与展望
伊维菌素制备工艺研究
化学鸟住够3終2021,Chemistry&Bioengineering-------------------------------------------------------H发画用doi：10.3969/j.issn.1672—5425.2021.03.010马志弟，胡晓敏，李晓露，等.伊维菌素制备工艺研究[J].化学与生物工程,2021,38(3):51-54.MA Z J,HU X M,LI X L,et al.Preparation process of Ivermectin]J].Chemistry&Bioengineering,2021,38(3):51-54.伊维菌素制备工艺研究马志,胡晓敏时，李晓露1,高月麒1,任风芝“，张雪霞“(1.华北制药集团新药研究开发有限责任公司微生物药物国家工程研究中心河北省工业微生物代谢工程技术研究中心，河北石家庄050015；2.华北制药集团爱诺有限公司，河北石家庄052165)摘要：以阿维菌素为原料、甲苯为溶剂，通过催化加氢反应得到伊维菌素粗粉，再通过重结聶纯化得到伊维菌素精粉，并优化了阿维菌素加氢反应条件及伊维菌素粗粉纯化工艺。
确定阿维菌素加氢反应条件为：料液比1：(3〜5)(g：mL)、催化剂用量1.0%〜1.5%；再通过控制晶种粒度和梯度降温过程，有效改善了晶体外观和产品质量，所得伊维菌素精粉纯度大于99%,质量符合USP标准。
该工艺简洁高效、质量可控，适用于伊维菌素的工业化生产。
关键词：阿维菌素；加氢反应；催化剂；结晶；伊维菌素中图分类号:TQ453.299文献标识码：A文章编号：1672-5425(2021)03-0051-04Preparation Process of IvermectinMA Zhijun1,HU Xiaomin2*,LI Xiaolu1,GAO Yueqi1,REN Fengzhi1*,ZHANG Xuexia1*(1.NCPC New Drug Research&Development Co.,Ltd.,National Engineering Research Centerof Microbial Medicine, Hebei Industry Microbial Metabolic Engineering&Technology Research Center, Shijiazhuang050015?China;2.NCPC Aino Co.Ltd*9Shijiazhuang052165^China) Abstract:U sing Avermectin as a raw material and toluene as a solvent,we obtained crude Ivermectin powder by a catalytic hydrogenation reaction,and then obtained refined Ivermectin powder by recrystallization purification.Moreover,we optimized the hydrogenation reaction conditions of Avermectin and purification process of crude Ivermectin powder・The hydrogenation reaction conditions of Avermectin can be determined as follows：the solid-liquid ratio of1!(3—5)(g!mL),and the catalyst dosage of1・0%—1.5%・By controlling the seed crystal size and the gradient cooling process?the crystal appearance and product quality are improved effectively,and the purity of the refined Ivermectin powder is more than99%，the quality meets the USP standard.The process is simple and efficient and the quality can be controlled,which is suitable for the industrial production of Ivermectin.Keywords:Avermectin；hydrogenation reaction；catalyst；crystallization；Ivermectin伊维菌素为阿维菌素的衍生物，属半合成的广谱抗寄生虫药，对体内外寄生虫特别是线虫和节肢动物均有良好驱杀作用。
我国生物农药发展历程及应用展望
生物农药是利用生物活体或生物代谢过程中产生的具有生物活性的物质，或者从生物体中提取的物质制成的制剂[1]，具有选择性高、对环境污染小、不易产生抗药性、可利用资源多等特点[2]，20世纪80年代以前被广泛用于农林作物病、虫、草、鼠等有害生物的防治。
随着化学工业的迅速发展，化学农药逐渐成为农林有害生物防治的主要手段，其在减少作物损失、保障粮食安全、抑制有害生物大面积发生和蔓延、改善生活环境卫生状况等方面发挥了重要作用。
然而，化学农药的滥用、误用等不当使用行为带来的环境污染、对非靶标生物的杀伤、生物多样性丧失、害虫抗药性增强、农药残留等诸多问题日益凸显。
基于绿色发展的需求，农业部提出《到2020年农药使用量零增长行动方案》，要求到2020年通过提高生物、物理防治覆盖率的绿色防控手段及统防统治等措施，实现化学农药使用总量零增长。
在可持续发展和生态文明建设的背景下，绿水青山就是金山银山的理念已深入人心。
新时期，重提发展生物农药，对实现化学农药使用量零增长、降低化学农药负面影响、改善生态环境都有重要意义。
本文回顾了我国生物农药的发展历史，综述了生物农药的发展现状和发展过程中遇到的问题，探讨了我国生物农药的应用前景，以期对解决生物农药发展中遇到的问题、进一步推动生物农药的发展提供参考。
1生物农药的发展历史1.1生物农药的定义生物农药目前在国际上没有统一的定义。
联合国粮食及农业组织和世界卫生组织将生物农药定义为源于自然界的、可以以类似于常规化学农药的方式配制和应用的、通常用于短期有害生物控制的物质，如微生物、植物源物质、化学信息素[3]。
美国国家环境保护局将生物农药定义为从天然材料（如动物、植物、细菌和某些矿物质等）中提取的农药，包括生物化学农药、微生物农药和转基因植物农药（Plant-Incorporated-Protectants ，PIPs ）[4]。
根据2019年8月农业农村部发布的《对十三届全国人大二次会议第6733号建议的答复》的阐释，我国的生物农药包括微生物农药、植物收稿日期：2022-02-24作者简介：袁杨（1993—），女，云南普洱人，硕士，主要研究方向为生态农业。
覃重军(多拉菌素)
覃重军
中国科学院上海生命科学研究院 植物生理生态研究所
合成生物学重点实验室
主要的生物兽药－－阿维菌素类抗生素
（2002年世界兽药产值113亿美元，我国180亿人民币）
第一代：阿维菌素 第二代：由阿维菌素衍生的依维菌素 第三代：多拉菌素（doramectin）是辉瑞公司在1995年利用 基因工程的方法阻断起始单元的合成，在突变株中补加 环己烷甲酸，在阿维菌素C25位上连接环己烷基,即25-环 己烷基阿维菌素B1a。多拉菌素被认为是新型阿维菌素 族中最好的驱虫药。
多拉菌素项目的主要创新点
在除虫链霉菌基因组了大片段DNA的体内克隆技术 •建立了以质粒为标记的基因组改组技术
在除虫链霉菌基因工程技术方面： •克隆了６个链霉菌抗生素生物合成的正调控基因 •利用合成生物学技术全合成了含有11个位点突变的aveC基因
6429-6438 6826-6827
6273-6288
Size of deletions
80 33
22
20 26 8
14 10
70
Status: with marker Yes Yes
Yes
kanr Yes Yes
Yes Yes
Yes
Status: removing marker Yes Yes
Yes
存在的问题
由于市场前景良好，国内企业仍无法购买多拉菌素菌株。 由于是基因工程构建的菌株，国内企业一般无法模仿。
2004年开始与浙江
海正药业集团公司 利用基因组工程技术改
（年产值30亿）合作
良除虫链霉菌
与海正药业集团公司的密切合作
沈美娟（高级实验师） 夏海洋（博士生） 党福军（研究助理） 徐晴雨（研究助理） 路志群（博士生） 陈威华（博士生） 张亮（硕士生） 胡敏杰（硕士生）
阿维菌素1
关于阿维菌素一、阿维菌素的理化性质、作用方式及特点原药精粉为白色或黄色结晶(含B1a≥90%)，蒸气压<200nPa，熔点150－155℃，21℃时溶解度在水中7.8微克/升、丙酮中100、甲苯中350、异丙醇 70，氯仿 25(g/L)常温下不易分解。
在25 ℃，pH 5-9的溶液中无分解现象。
本品是新型广谱、高效、低毒抗生素类抗寄生虫药，对体内外寄生虫特别是线虫和节肢动物均有良好的驱杀作用。
但对绦虫、吸虫及原生动物无效。
本品对害虫的驱杀作用在于增加虫体抑制性递质r-氨基丁酸的释放，以及打开谷氨酸控制的cl通道，增强神经膜对cl的通透性，从而阻断神经信号的传递，最终神经麻痹，使肌肉细胞失去收缩能力，而导致虫体死亡。
该产品特点1、杀虫谱广：目前报道阿维菌素杀虫谱有84种。
2、独特的杀虫机制。
3、低害性二、阿维菌素衍生物伊维菌素与阿维菌素相比, 伊维菌素的杀虫活性基本不变, 但对哺乳动物的机体组织有更强的渗透性和安全性, 持效期更长, 特别适用于一般口服驱虫剂难以到达的肌肉、器官和特殊组织中的寄生虫防治。
伊维菌素由于C22=C23双键加氢还原成饱和状态后, 具有较强的稳定性和抗氧化能力, 因而药效更加可靠。
同时, 伊维菌素的毒性只有阿维菌素B1的一半左右。
国标含量：0.4%（西安汉堡生物技术发展有限公司兽药字（2009）270059289）1% （无锡中顺生物技术有限公司兽药字（2009）100899290）多拉菌素多拉菌素是新大环内脂类抗生素阿维菌素的第3代衍生物, 它与伊维菌素的驱虫机制相同。
多拉菌素是利用突变生物合成方法在C25 位连接上环已基, 即得到25-环己基- 5-O-脱甲基-25-脱( 1-甲基丙酸) 阿维菌素B1。
多拉菌素伊维菌素类产品比较, 其抗寄生虫范围更广泛、效果更好, 而且预防寄生虫再感染的有效时间更长，是目前世界上效果最好、最有开发潜力的兽用抗寄生虫新药。
埃玛菌素埃玛菌素扩大了阿维菌素的杀虫谱并克服阿维菌素对鳞翅目害虫效果不好的特点。
天维菌素在杀虫杀螨方面的研究进展
天维菌素在杀虫杀螨方面的研究进展张魁，陈安良（浙江农林大学林业与生物技术学院/生物农药高效制备技术国家地方联合工程实验室，浙江杭州311300）摘要：天维菌素（）是通过对工程菌MHJ1101的发酵液进行提取分离得到的活性高、毒性低的新型十六元大环内脂类化合物，具有良好的杀虫杀螨作用。
其中，工程菌s MHJ1101是对阿维菌素和米尔贝霉素产生菌进行基因改造而得到的[1]。
基于此，详细论述天维菌素研究进展，产生、应用及作用机制等情况，提出了天维菌素以后的研究方向，并对其应用前景进行了展望，以期为天维菌素的抗性治理和科学合理使用提供有效参考。
关键词：天维菌素；杀虫剂；杀螨剂；作用机制等[7]再次从该工程菌发酵液中分离纯化得到了2种化合物，初步分析显示，这2种化合物有杀死成螨的潜力。
3天维菌素的应用2016年，曹雪等[8]进行了天维菌素对韭菜迟眼蕈蚊幼虫（）的室内毒力测定，结果表明，天维菌素的毒力较辛硫磷、毒死蜱以及米尔贝霉素低。
同年，杨波等[9]测定了天维菌素对几种常见害虫的室内毒力，结果显示，天维菌素对小菜蛾（P ）、棉铃虫（）的活性高于阿维菌素，对小菜蛾、棉铃虫、粘虫（）的活性明显优于米尔贝霉素，对松材线虫（）的活性高于米尔贝霉素和阿维菌素。
2017年，张绍勇等[2]测定了朱砂叶螨（）、柑橘红蜘蛛（）及二斑叶螨（）对天维菌素的敏感程度，研究发现，天维菌素对朱砂叶螨若螨和雌成螨的致死浓度分别为0.011mg/L 、0.11mg/L ，杀螨活性高于米尔贝霉素和阿维菌素，但杀卵活性较差；田间试验结果显示，2%天维菌素微乳剂的速效性较好，且有一定特效期，对朱砂叶螨、二斑叶螨、柑橘红蜘蛛这些常见害虫的防治效果明显。
翟俊等[10]进行了天维菌素A 、B 对二化螟的生测试验，结果显示，致死中浓度分别为1.099mg/L 和0.749mg/L ，说明天维菌素对二化螟的毒力较强；且阿维菌素及衍生物对大型溞和斑马鱼的急性毒性比天维菌素高得多。
伊维菌素的研究进展
博士， 硕士生导师 ， 主要从事药物缓释研究
场 的清理和规范 已迫在眉睫 。建议 如下 ： 一是 国家对 生物 安 全 实验室 ， 特别是 高级别 生物安全实验室 的建筑设计 、 施工 、 监理单位 ， 实行统一 的资质管理 ， 并根据其 工作业绩 、 工程 质 量 等实行 动态管理 ；二是完善 和加强对 生物安全 实验室 建 筑、 安装工 程的监理制度 ； 三是 由于生物安全实验室的建筑用 材专业性较强 ， 为避免行业暴 利 ， 建议 国家对专用 建材 、 设施 设备以及设计施工服务 收费等采用政府指导定价 ；四是对涉 及生物安全实验室的建设项 目要严格审批 ，对工艺设 计有关 部 门要组织专家进行重点审查 ，并要通过环保管理部门的环
作用。由于近年来 生物技术 与生物安全实验室的迅猛发展 ，
生 物 。该 药 于 １８ ９ ７年 开 始 由 美 国 的 Ｍｅ ｈ ｒ ｗｋＳｏｐ和 Ｄ ｈ ｅ ｏｍ 究， 已经 确 定 了 ＩＭ 类 药 物 的驱 虫 机 理 ， 且 用 多 种 畜 禽 做 Ｖ 并
过临床 实验 ， 结果 证明 Ｉ ＶＭ系列 产品具 有广谱 、 高效 、 安全 等特点 。２ ０世 纪 ８ ０年代后 期我 国成 功研制 出了伊维菌素 ， 并且按 照国家二类新 药完成 了药理及临床治疗观察。 本文就 目前国内外对伊维菌 素的研究进展进行 阐述 。
１ 伊 维 菌素 的性 质
制药公 司生产并用于人体盘尾丝虫病的治疗。 在此后十几年 的时间里 ，科学 家对此类 药物的作用 机理进行 了深入 的研 基 金 项 目 ：黑 龙 江 省 青 年 科 学 技 术 专项 资金 项 目 （ Ｃ ６ ０７ ， Ｑ ０ Ｃ ４ ） 黑龙 江 省 教 育 厅 项 目（ １０ ２ ， 龙 江 大 学 １５ ３ ７ ）黑 １ 青年科 学基金（ Ｌ ０ ６ ３ ， Ｑ ２ ０ ４ ） 黑龙 江大学博 士启动资金资助 作 者简介 ：孙庆 中 （ ９ ７ ） 男， １７ ～ ， 黑龙 江省绥化 市人 ， 讲师 ，
阿维菌素
市面上的吡虫啉主要有5%、10%、20%、 25%、30%、35%、60%、70%等，剂型 主要是可湿性粉剂、微乳剂、悬浮剂、乳 油、水分散粒剂等
戊唑醇
戊唑醇是一种高效、广谱、内吸性三唑类杀菌农药，具有保护、 治疗、铲除三大功能，杀菌谱广、持效期长。青岛浩瀚高科专家组与 新西兰技术专家研究发现：与所有的三唑类杀菌剂一样,戊唑醇能够抑 制真菌的麦角甾醇的生物合成。 戊唑醇在全世界范围内用作种子处理剂和叶面喷雾,杀菌谱广,不 仅活性高,而且持效期长。戊唑醇主要用于防治小麦、水稻、花生、蔬 菜、香蕉、苹果、梨以及玉米高粱等作物上的多种真菌病害,其在全球 50多个国家的60多种作物上取得登记并广泛应用。该品用于防治油菜 菌核病，不仅防效好，而且具有抗倒伏，增产作用明显等特点对病菌 的作用机制为抑制其细胞膜上麦角甾醇的去甲基化，使得病菌无法形 成细胞膜，从而杀死病菌。 该品属三唑类杀菌农药，是甾醇脱甲基抑制剂，是用于重要经济 作物的种子处理或叶面喷洒的高效杀菌剂，可有效地防治禾谷类作物 的多种锈病、白粉病、网斑病、根腐病、赤霉病，黑穗病及种传轮斑 病及早稻纹枯病等。
4.7 双草醚对水稻ALS抑制作用规律 合理用量下，5叶期以后双草醚对籼稻ALS基本无抑制。其对粳稻的ALS的抑制5d达到峰 值，随后逐渐减小，9d时基本无抑制。田间表现为，粳稻用药3d开始有黄化褪绿现象， 10d后开始恢复，返青。粳稻上这种短时的抑制对最终产量的形成没有影响。对于首次 使用双草醚的地区应做好解释说明工作。 综上所述，双草醚是一种高效的水田除草剂，对目前水田一些恶性杂草有特效。但是， 在实际应用上，还有诸范围的扩 大，农民对其特性的逐渐了解，用药技术会逐渐成熟。
3、防治梨木虱可在若虫发生初期至未被黏液完全覆盖前喷药，每代均匀喷药一次即可， 可用2％乳油3000-4000倍液或1.8％乳油2500-3500倍液均匀喷雾。 4、防治瓜果蔬菜及豆类红蜘蛛可用2％乳油3500-4500倍液、1.8％乳油3000-4000倍液 均匀喷雾。 五、注意事项： 1、该药无内吸作用，喷药时应注意喷洒均匀、细致周密。2、该药对红蜘蛛卵效果差， 建议复配杀卵剂。3、不能与碱性农药混用。4、夏季中午时间不要喷药。5、储存本产 品应远离高温和火源。6、收获前20天停止施药。7、避免药剂与皮肤接触或溅入眼睛， 如遇此情况立即用清水冲洗，并请医生诊治。
农药阿维菌素毒理学机制及中毒治疗
农药阿维菌素毒理学机制及中毒治疗李婷;龙虎;温海林;隗汶校;李坤明;刘忠俊【摘要】阿维菌素是一种抗寄生虫类抗生素,它主要通过影响虫类的神经系统功能而起到高效的杀灭作用.随着阿维菌素的广泛应用,其引起人体的中毒反应屡见报道.如何安全有效地使用阿维菌素类农药及对其中毒的防治越来越引起人们的关注.目前阿维菌素毒理学的研究主要集中在对昆虫的毒作用,而对哺乳动物的毒作用缺少系统性的研究及描述.现对阿维菌素类化合物的化学性质、哺乳动物毒性作用机制及中毒症状与治疗予以介绍.【期刊名称】《医学综述》【年(卷),期】2010(016)010【总页数】3页(P1554-1556)【关键词】阿维菌素;毒性;症状;治疗【作者】李婷;龙虎;温海林;隗汶校;李坤明;刘忠俊【作者单位】四川大学华西基础医学与法医学院,成都610041;四川大学华西口腔医学院,成都610041;四川大学华西口腔医学院,成都610041;四川大学华西公共卫生学院,成都610041;四川大学华西口腔医学院,成都610041;四川大学华西口腔医学院,成都610041【正文语种】中文【中图分类】R595.4阿维菌素（avermectins,AVM）又名齐螨素、爱福丁、害极灭、农家乐等,是一种全新的抗生素类生物杀螨虫剂,对害虫有触杀和胃毒作用,可用于防治梨木虱、苹果叶螨、桃小食心虫等。
由于其具有优良的驱虫活性及广谱的抗寄生虫作用而被广泛应用,是当前生物农药市场中最受欢迎和具激烈竞争性的新产品。
现从化学结构、毒性及作用机制、中毒症状和治疗等方面对其进行阐述。
1 化学性质AVM类化合物是一种新型、高效、广谱、安全的抗寄生虫类抗生素。
原药为白色或黄白色结晶粉末,常温下不易分解。
它是一组由十六元环内酯与一个二糖（齐墩果糖）所生成的苷,在十六元环内酯周围还有一个含 2个六元环的螺缩酮系六氢苯并喃环系。
根据 C-5取代的不同分为“A”、“B”组分;根据 C-22和 C-23之间单双键的差异分为“1”、“2”组分;根据 C-25位上取代基的不同分为“a”、“b”组分。
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第17卷 第3期 2007年3月阿维菌素的生物合成研究进展与展望*陈 芝 宋 渊 文 莹 李季伦**中国农业大学生物学院微生物系,北京100094
2006207219收稿,2006208218收修改稿 *国家重点基础研究发展计划资助项目(批准号:2003CB114205) **通信作者,E2mail:lijilun@cau.edu.cn
摘要 阿维链霉菌(Streptomycesavermitilis)由于可以产生杀虫抗生素)))阿维菌素而备受研究者的青睐.多年来该菌得到了全面系统的研究,其基因组序列也已测定.文中综述了阿维链霉菌中阿维菌素生物合成代谢途径方面的研究,并对后续研究进行展望.
关键词 阿维链霉菌 阿维菌素 次级代谢 生物合成 基因工程 组合生物合成
1 阿维链霉菌及其基因组信息阿维菌素的产生菌)))阿维链霉菌(Strepto2mycesavermitilis)是1975年日本北里研究所从日本静岗县的一个土壤样品中分离得到的.阿维链霉菌自发现以来,以日本北里大学和北里研究所以及美国Merk公司为主的研究小组分别对它开展了深入研究,形成了一个重要的抗生素研究领域.与其他链霉菌一样,阿维链霉菌不仅具有复杂的形态分化,也具有合成多种次级代谢产物的能力,由它产生的阿维菌素在医药、农业及畜牧业上有着重要的商业价值.目前对阿维链霉菌的研究主要集中在阿维菌素的生物合成领域[1)5].链霉菌中天蓝色链霉菌(Streptomycescoelicol2or)A3(2)[6]、阿维链霉菌MA24680[7]和Strepto2mycesdiversa的基因组序列已被测定,此外还有一些链霉菌(S.noursei,S.ambofaciens,S.peucetius和S.scabies)的基因组正在测定中(http://www.genomesonline.org/search.cgi).对它们的基因组序列的比较将为这些微生物的研究提供有价值的信息.阿维链霉菌的线状染色体大小为9025608bp,G+C含量为70.7%,至少包含7577个开放阅读框(ORF),编码区占基因组的86.2%.ORF平均大小为1034bp.阿维链霉菌还含有一个线性质粒SAP1,大小为94287bp,G+C含量为69.2%,含有96个ORF,编码区占质粒的79.0%.在阿维链霉菌的基因组中,大多数必需基因都位于一个高度保守的6.5Mb的内部区域.染色体上靠近端粒的位置有两个保守性低的亚端粒区(subtelomericre2gions).有趣的是,50%以上的与次级代谢合成有关的基因(包括阿维菌素的生物合成基因)都位于亚端粒区,而在亚端粒区没有发现已知的必需基因.此外,亚端粒区含有基因组中大部分的转座因子[7].这些基因位于亚端粒区可能与阿维链霉菌的
遗传不稳定性有关,在对阿维链霉菌培养过程中我们经常得到一些形态分化的突变株(光秃型突变株和白色突变株等),有些突变株同时丧失了合成阿维菌素的能力.在阿维链霉菌的线状染色体上有30个基因簇与次级代谢合成有关,共有271个基因,占基因组的6.6%.它们广泛地分布于染色体上,但有一半位于染色体的末端.在质粒SAP1上没有发现与次级代谢有关的基因簇[7,8].在30个与次级代谢有关
的基因簇中,有4个与黑色素的合成有关,其中两个负责酪氨酸酶及其辅酶的合成,另外两个分别与由尿黑酸生成的赭色色素和聚酮结构的黑色素的合成有关;合成类胡萝卜素和铁载体的基因簇分别由7个和5个基因组成;此外,有8个基因簇与非核
290糖体肽类化合物的合成有关,还有4个基因簇与萜类化合物的合成有关.在30个次级代谢的基因簇中,有9个基因簇含有Ñ型PKS基因(polyketidesynthase),2个基因簇含有Ò型PKS基因.目前已有3个Ñ型PKS合成的化合物被鉴定,它们分别是阿维菌素、寡霉素以及菲律宾菌素(filipin)的衍生物)pentaene[8].阿维链霉菌和其他链霉菌的基因组计划必将极大地推动对链霉菌形态分化和次级代谢的研究,最终揭示链霉菌复杂的调控网络.2 阿维菌素的生物合成基因簇阿维菌素是由阿维链霉菌产生的一组结构相似的十六元环大环内酯类抗生素.阿维菌素的天然发酵产物共有8个组分:A1a,A1b,A2a,A2b,B1a,B1b,B2a和B2b,它们的区别主要在于C25,C222,23和C226位所连接的基团不同(图1).Cane等通过在阿维菌素合成过程中掺入相应的13C标记的化
合物,表明阿维菌素的大环内酯是由7个乙酸盐,5个丙酸盐和1个带有支链的脂肪酸首尾聚合而成[9]./a0组分的22甲基丁酰基(C252C28)和/b0
组分的异丁酰基(C252C27)分别由L2异亮氨酸和L2缬氨酸衍生而成[10].齐墩果糖由葡萄糖直接转化而来[11].阿维菌素中C25,C23c和C23d位上的甲氧
基均来自L2甲硫氨酸.
图1 阿维菌素及伊维菌素结构图 Ikeda等利用标记底物结合分析突变株累积中间产物的策略,已基本阐明阿维菌素生物合成的全过程[1],并对阿维菌素合成的全基因簇序列进行了功能分析[2].该基因簇全长82kb,共有18个开放阅读框(图2).基因簇内部的60kb片段含有4个大的阅读框(aveA12aveA2)和(aveA32aveA4),共同编码多功能的PKS,该聚酮合酶由12个模块组成,共有55个活性位点,负责1个支链脂肪酸、7个乙酸盐和5个丙酸盐的聚合反应.每个合酶单位(SU)都由缩合酶(KS)2酰基转移酶(AT)2酰基载体蛋白(ACP)组成,有些SU还含有酮基还原酶(KR)和脱水酶(DH)活性位点.每个SU负责一步掺入前体如乙酸或丙酸的聚合反应及B2酮基的还原程度,最后所形成的聚酮体在位于PKS末端的硫酯酶(TE)的作用下成环内酯化.aveC和aveE基因位于aveA12aveA2和aveA32aveA4基因之间,与聚酮体的修饰
291 第17卷 第3期 2007年3月有关[12];在基因簇的右侧邻近aveA4基因的上游,是一套涉及合成和转移齐墩果二糖的8个基因(aveBI)aveBVIII);紧邻aveA1的上游(左方)是编码C52O2甲基转移酶的aveD基因,该基因负责将甲基转给阿维菌素B的C25位的2OH从而形成阿维菌素A.aveF紧邻aveD的下游,两者转录方向一致,可能属于同一转录单位[1].aveF编码C52酮基还原酶,催化C25位的酮基还原成羟基.aveR位于aveF的下游(但转录方向相反),它可能是阿维菌素生物合成全基因簇的正调控基因[2].aveR突变株不
能合成任何阿维菌素,也不能转化阿维菌素糖苷配基,对该基因序列分析表明具有H2T2H结构,但是aveR如何调控阿维菌素生物合成有待于进一步研究.
图2 阿维菌素生物合成基因簇[2]3 阿维链霉菌的基因工程改造阿维菌素的生物合成途径已基本阐明,相关合成基因已被克隆和测序,阿维链霉菌的基因组序列也已清楚.这为利用基因工程手段改造阿维菌素生物合成基因簇从而对发酵产物进行有效的控制,以及合成新的阿维菌素衍生物及提高阿维菌素的产量提供了可能.目前对阿维链霉菌中代谢途径的改造主要集中在以下几个方面.
3.1 菌株高产性能的提高阿维菌素是重要的杀虫抗生素,提高阿维菌素的产量具有重要的意义.在链霉菌中,次级代谢产物的生物合成是一个复杂的过程,受到不同水平的调控[13].抗生素的生物合成除受途径专一调节基因
(pathway2specificregulatorygene)控制之外[14],还受多效调控基因(pleiotropicregulatorygenes)的控制,如abaA,abaB,afsQ1和afsQ2等[15],其次
还受到其他调控因子,如ppGpp,A因子和磷酸盐等的调控[16)18].
Lee等利用Southern杂交在阿维链霉菌中检测到了与S.lividans中afsR2基因的同源基因,将多
拷贝的afsR2基因分别转入阿维链霉菌野生型菌株和高产菌株中,阿维菌素的生物合成分别提高了2.3倍和1.5倍[19].Hwang等曾直接将一段包含编码膜蛋白orfX的克隆片段(8.10kb)转入野生型阿维链霉菌,刺激了阿维菌素的生物合成,可使阿维菌素的合成提高近3.5倍[20].对位于aveR基因上
游的aveR1,aveR2基因进行全部或部分缺失,可使阿维菌素的产量提高3倍多[21].王晓芳等[22]对阿维链霉菌野生型菌株和高产菌株中aveR1,aveR2基因分别进行基因缺失,野生型菌株阿维菌素的合成提高了3倍多,但高产菌株产量基本没有提高,可能是高产菌株经历了多次的诱变,其调节基因可能发生了改变.这些结果表明虽然常规诱变育种是菌种选育的有效手段,但是利用基因工程手段也有可能进一步提高菌株的生产能力.Xiong等利用PCR介导的基因中断技术对bkdF基因进行阻断,获得的突变株不再合成阿维菌素,只产生寡霉素,而且寡霉素的产量由原来的0.1mg/mL提高到2.3mg/mL[23].这可能是由于阿维菌素和寡霉素都具有聚酮体结构,拥有共同的底物,阿维菌素合成被阻断导致了代谢流流向了寡霉素的合成.
292 第17卷 第3期 2007年3月3.2 菌株发酵性能的提高阿维菌素的发酵是一个好氧的生物过程,一般对氧的需求比较敏感.由于氧在水中的低溶解性,在大规模深层发酵中,溶氧常成限制因素.文莹等通过将透明颤菌血红蛋白(VHb)基因置于硫链丝菌素诱导的启动子PtipA之下,转入阿维链霉菌,经摇瓶实验证实,表达的VHb蛋白在氧限条件下会明显促进阿维链霉菌的生长和阿维菌素的合成,而且在发酵液中溶氧状况越差,VHb蛋白的效果越显著[24].3.3 无效组分及有毒产物合成的阻断Ikeda小组阐明了阿维菌素的生物合成途径,在明确阿维菌素生物合成途径的基础上,结合传统诱变构建了一系列仅产有效组分的基因工程菌株.经传统诱变获得了仅产4个/B0组分的突变株K2034(aveD)和仅产4个/a0组分的突变株K2021(X)[10],前者是aveD基因(负责编码将B组分转化为A组分的C52O2甲基转移酶)发生了突变,使得菌株只能累积B组分[25];后者是X基因发生了突变.目前X基因尚未得到克隆,但不位于阿维菌素生物合成基因簇中,此基因的突变导致突变株只能合成仅产/a0组分的阿维菌素,推测这个基因可能为支链氨基酸脱氢酶.对这两株突变株进行原生质体融合,得到了仅产B1a和B2a两个组分的重组菌株K2038(aveDX)[10].再对重组菌株K2038内的aveC基因进行点突变,得到仅产单一组分B2a的基因工程菌K2099(aveDXaveC)[1].阿维链霉菌不仅产生阿维菌素,还产生寡霉素.寡霉素是哺乳动物氧化磷酸化的抑制剂,对哺乳动物有很高的毒性.Ikeda等用Tn4560对阿维链霉菌进行转座诱变得到不产寡霉素的突变株,利用转座子上的遗传标记将寡霉素的生物合成基因克隆到温敏质粒上,对上述所构建的有效组分的基因工程菌进行基因取代,得到不产寡霉素仅产阿维菌素有效组分的基因工程菌[1].我们实验室自20世纪90年代以来开展了对阿维菌素合成的研究,初期主要利用常规诱变手段提高阿维菌素产量,近年来也开展了对阿维链霉菌的基因工程改造.通过对aveD基因的插入失活,阻断了C52O2甲基转移酶的合成,与aveD共转录的aveF的表达也被阻断,因此获得了直接合成C52O2阿维菌素B的基因工程菌[26].C52O2阿维菌素B可