单分子测序技术在靶基因组测序及表观遗传学的应用 第三代测
测序技术的发展历程及技术的应用技术发展历程
测序技术的发展历程及技术的应用技术发展历程自从20世纪50年代确定了DNA的双螺旋结构并发现了基因DNA的作用以来，科学家们一直在致力于发展各种技术来更好地研究DNA和其重要作用。
自1977年Sanger首次提出了变性杂交和DNA测序技术以来，测序技术在不断地发展和完善，至今已经取得了重大的突破，使得分子生物学的研究得到了极大的促进和发展。
一、测序技术的发展历程1、手工测序：20世纪70年代到80年代初期，手工测序技术得到了广泛应用。
这种方法需要大量的时间和精力，需要对DNA进行多次克隆、限制酶切、PCR扩增等多道工序。
最终通过手工分离和去掉杂质、对碱基进行标记并辨认，并在薄层板上进行图解才能得到结果。
这种测序方法的操作繁琐、费时耗力、误差率高且成本高，因此已经很少被使用。
2、自动测序技术：1986年首次推出的自动测序技术使DNA分析得到了快速和高效的提高，实现了高通量DNA测序、准确性和速度的提高。
自动测序技术分为三代，其中第一代的荧光检测原理是通过一系列的DNA随机断裂、PCG扩增、限制酶切割后片段的比较、计算和分析，从而得到整个DNA序列以及荧光信号。
第二代的技术在测序引物上进行了改进，采用了大量的小片段序列。
第三代技术则采用了Nanopore技术，这种技术能够通过单个、具有节点的蛋白质孔使带电物质（如DNA分子）通过，从而能够得到更直观和高保真的测序结果。
这些人工智能的算法已经使整个测序的过程变得快速、简便和可靠。
二、测序技术的应用1、基因组测序：高通量基因组测序已经成为现代分子生物学研究的创新平台。
通过通过基因组测序，可以对物种的基因组结构，基因有序性和功能进行全面、细致的分析。
利用高通量测序技术可以高效地分析人类、动物和植物的基因结构和特征，被广泛应用于药物研发、肿瘤分型和精准医疗等多个领域。
2、转录组测序：转录组测序是平衡表达和微小表达谱分析的重要工具。
分析细胞RNA的构成，造成的差异性和相似性，从而可以深入了解基因表达和细胞信号通路的影响以及转录因子和DNA的相互作用。
表观遗传学测序__总结
表观遗传学测序__总结Bioinformatics Analysis of Next-Generation Sequencing Data – Epigenome and Chromatin Interactome要点：Enhancers are marked by multiple modificationsCharacteristic histone methylation patterns at active genes涉及的相关技术：NGSEpigeneticsCHIP-Seq3CNGS(Next-Generation Sequencing)的原理：最近市⾯上出现了很多新⼀代测序仪产品，例如美国Ｒｏｃｈｅ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｓｃｉｅｎｃｅ公司的４５４基因组测序仪、美国Ｉｌｌｕｍｉｎａ公司和英国Ｓｏｌｅｘａ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ公司合作开发的Ｉｌｌｕｍｉｎａ测序仪、美国Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ公司的ＳＯＬｉＤ测序仪、Ｄｏｖｅｒ／Ｈａｒｖａｒｄ公司的Ｐｏｌｏｎａｔｏｒ测序仪以及美国Ｈｅｌｉｃｏｓ公司的ＨｅｌｉＳｃｏｐｅ单分⼦测序仪。
所有这些新型测序仪都使⽤了⼀种新的测序策略——循环芯⽚测序法（ｃｙｃｌｉｃ－ａｒｒａｙ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ），也可将其称为“新⼀代测序技术或者第⼆代测序技术”。
所谓循环芯⽚测序法，简⾔之就是对布满ＤＮＡ样品的芯⽚重复进⾏基于ＤＮＡ的聚合酶反应（模板变性、引物退⽕杂交及延伸）以及荧光序列读取反应。
２００５年，有两篇论⽂曾对这种⽅法做出过详细介绍。
与传统测序法相⽐，循环芯⽚测序法具有操作更简易、费⽤更低廉的优势，于是很快就获得了⼴泛的应⽤。
传统的Ｓａｎｇｅｒ测序法及新⼀代ＤＮＡ测序技术⼯作流程图 （ａ）⾼通量鸟枪Ｓａｎｇｅｒ测序法。
⾸先基因组ＤＮＡ被随机切割成⼩⽚段分⼦，接着众多⼩⽚段ＤＮＡ被克隆⼊质粒载体，随后转化到⼤肠杆菌中。
最后培养⼤肠杆菌提取质粒，进⾏测序。
二代和三代测序原理及技术详解
二代和三代测序原理及技术详解二代测序（Second Generation Sequencing）和三代测序（Third Generation Sequencing）是现代生物学中常用的两种高通量测序技术。
二代测序技术主要包括Illumina测序技术和Ion Torrent测序技术，而三代测序技术则由PacBio和Oxford Nanopore等公司开发。
本文将详细介绍二代和三代测序的原理和技术。
二代测序技术采用了不同的原理，但其基本步骤相似。
首先，DNA 或RNA样本需要经过一系列的前处理步骤，如DNA片段化、连接测序指示子、PCR扩增等。
然后，将样品片段化的DNA或RNA分子固定到测序平台上，通过荧光标记的碱基依次加入到模板上，并经过图像采集系统进行扫描和记录。
最后，根据荧光信号的强度和位置确定每个碱基的序列，并通过计算机算法进行基因组的重建和分析。
Illumina测序技术是目前应用最广泛的二代测序技术之一。
其基本原理是通过将DNA片段固定到测序芯片上的特定位置上，然后通过反复的循环扩增和碱基加入的方式进行测序。
在每个循环中，只能加入一种荧光标记的碱基，并记录荧光信号，之后通过去除荧光信号并进行图像分析来确定碱基的序列。
Illumina测序技术具有高通量、高准确性和较低的测序成本，并广泛应用于基因组学、转录组学和表观遗传学等领域。
Ion Torrent测序技术是另一种常用的二代测序技术。
其原理基于DNA聚合酶催化链延伸反应，该反应会释放出质子，通过测量质子释放的情况来确定碱基的序列。
Ion T orrent测序技术具有高通量和较低的测序成本，但由于其测序误差率较高，主要应用于低复杂度的基因组测序和个体检测等领域。
与二代测序技术相比，三代测序技术具有更长的读长和更高的速度。
PacBio是其中一种代表性的三代测序技术。
PacBio测序技术基于单分子实时测序（Single-Molecule Real-Time Sequencing）原理，通过将DNA聚合酶与荧光标记的碱基一起加入到DNA模板上，通过测量聚合酶引发的荧光信号来确定碱基的序列。
单分子测序PacBio技术和应用解决方案
单分子测序PacBio技术和应用解决方案一、技术原理SMRT：single molecular real time SequencingPacBio RS，RS表示Real time Sequencing关键之一：DNA聚合酶基本原理：DNA聚合酶和模板结合，4色荧光标记4种碱基，经过Watson配对后不同的碱基加入，会发出不同光，根据光的波长与峰值可判断进入的碱基类型。
和其他基本测序技术一样，在反应管中进行的是大规模平行的多分子反应，怎样在其中进行单分子反应检测？周围有大量的荧光标记的游离碱基，怎样将反应信号与周围游离碱基的强大荧光背景区别出来？通过一个物理现象解释：ZMW（zero-mode waveguides，零模波导孔）。
例如微波炉壁上可看到有很多密集的小孔。
小孔直径有考究，如果直径大于微波波长，能量就会穿透面板泄露。
如果孔径小于波长，能量不会辐射外部，起保护作用。
在一个反应管（SMRTCell：单分子实时反应孔）中有许多这样的圆形纳米小孔，即ZMW（零模波导孔），外径100多纳米，比检测激光波长小（数百纳米），激光从底部打上去后不能穿透小孔进入上方溶液区，能量被限制在一个小范围（体积20X 10-21L）里，正好足够覆盖需要检测的部分，使得信号仅来自这个小反应区域，孔外过多游离核苷酸单体依然留在黑暗中，将背景降到最低。
单个ZMW底部固定有一个结合了模板DNA的聚合酶，当加入测序反应试剂后，每个碱基配对合成后会发出相应的光并被检测。
一个SMRTCell中有15万个ZMW，每个孔中有一个单分子DNA链在高速合成，如众星闪烁。
原始检测数据的结果，每合成一个碱基即显示为一个脉冲峰，每分钟>100个碱基的速度，配上高分辨率的光学检测系统，就能实时检进行检测。
关键点之二：荧光标记位点。
这是影响测序长度的非常关键的因素。
二代测序都标记在5…端甲基上，在合成过程中，荧光标记物保留在DNA链上，随DNA链的延伸会产生三维空间阻力导致DNA链延长到一定程度后会出现错读。
三代测序技术原理及流程
三代测序技术原理及流程下载温馨提示:该文档是我店铺精心编制而成，希望大家下载以后，能够帮助大家解决实际的问题。
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pacbio 简书
pacbio 简书PacBio是一家生物技术公司，其核心技术是第三代单分子实时DNA测序技术。
PacBio公司的全称是Pacific Biosciences of California，成立于2004年，总部位于美国加利福尼亚州门洛帕克（Menlo Park）。
PacBio公司的创始人是Stephen Turner和Joseph Jacobson。
PacBio公司的第三代单分子实时DNA测序技术第三代单分子实时DNA测序技术是指直接将DNA单分子放在测序仪上进行测序，不需要进行PCR扩增和文库构建等复杂的前处理步骤。
这种技术可以避免PCR扩增过程中的偏差和错误，可以直接读取单个DNA分子的信息，因此能够获得更准确、更完整的DNA序列信息。
PacBio公司的第三代单分子实时DNA测序技术的原理是利用Zero-Mode Waveguide（ZMW）孔技术，该技术可以将单个DNA分子限制在一个非常小的空间内，使其在光学激发下发出荧光信号，从而实现DNA序列信息的读取。
PacBio公司的测序仪可以读取每个ZMW孔中的荧光信号，从而实现对单个DNA分子的读取。
PacBio公司的第三代单分子实时DNA测序技术的优点是可以获得长读长、高准确度的DNA序列信息。
相比于第二代测序技术，PacBio 公司的测序仪可以获得几十kb甚至上百kb的长读长，可以避免DNA 序列中的重复区域和高GC区域等难以测序的区域，从而获得更完整的DNA序列信息。
此外，PacBio公司的测序仪可以根据荧光信号的强度和时间信息来判断DNA碱基的类型和位置，因此可以获得更高的准确度。
PacBio测序技术的应用PacBio测序技术可以应用于基因组学、转录组学、表观基因组学等领域。
在基因组学领域，PacBio测序技术可以获得更完整的基因组序列信息，可以发现新的基因和功能区域，可以研究基因组结构和进化等问题。
在转录组学领域，PacBio测序技术可以获得更准确的转录本信息，可以发现新的剪接形式和非编码RNA等信息，可以研究基因调控和信号通路等问题。
基因测序设备的技术进步考核试卷
B. Visium
C. MERFISH
D. seqFISH
三、填空题（本题共10小题，每小题2分，共20分，请将正确答案填到题目空白处）
1.第一代基因测序技术中，Sanger测序的原理是______。
答案：
2.第二代基因测序技术中，Illumina测序平台采用的测序方法是______。
答案：
3.第三代测序技术中，PacBio SMRT技术的特点是______。
A.样本的DNA浓度
B.测序试剂的稳定性
C.设备的运行状态
D.数据分析软件的版本
9.以下哪些技术可以用于检测DNA中的结构变异？（）
A. PacBio SMRT技术
B. Oxford Nanopore技术
C. Illumina HiSeq技术
D. array CGH技术
10.以下哪些技术适用于宏基因组测序？（）
三、填空题
1.双脱氧终止法
2.边合成边测序法（或SBS技术）
3.读取长度长，错误率较高，实时测序
4.蛋白质通道
5.重叠
6. RNA-Seq
7. Methyl-Seq
8. CRISPR相关蛋白9（或CRISPR associated protein 9）
9.测序
10. Gene prediction tools（或基因预测工具）
D. Sanger测序
16.以下哪种技术的发展显著降低了基因测序的成本？（
A. Sanger测序
B.第二代测序技术
C.第三代测序技术
D.第四代测序技术
表观遗传学数据分析的方法及应用
表观遗传学数据分析的方法及应用表观遗传学，是指非DNA序列的遗传信息传递，其在细胞分化、组织发育和疾病发生等方面具有重要作用。
相比于基因组学和转录组学等分子生物学技术，表观遗传学的研究范畴更为广泛，方法也更加多样化。
其中，表观遗传学数据分析是研究表观遗传学的重要方法之一。
本文将深入探讨表观遗传学数据分析的方法及应用。
一、表观遗传学数据的获取表观遗传学研究需要获取一系列与表观遗传标记相关的数据。
主要包括以下几种数据类型：1. 甲基化数据：常用的方法有甲基化敏感的微阵列、全基因组测序（WGBS）、全基因组双重甲基化特异酶切位点测序（RRBS）等。
2. 染色质结构数据：包括组蛋白修饰（如H3K4me3、H3K27ac 等）、染色质可及性（如DNase-seq、ATAC-seq等）等。
3. 三维染色质结构数据：主要包括Hi-C数据。
以上数据是表观遗传学研究的重要数据来源。
通过这些数据可以进一步分析和解析表观遗传学的相关功能。
二、表观遗传学数据分析方法表观遗传学数据分析涉及较多的统计学和机器学习算法。
具体的分析方法如下：1.峰（peak）分析：可通过一些软件（MACS、Homer等）找出在染色质上出现高亮信号的区域。
峰分析技术主要适用于基因组DNA上的特定修饰，如H3K4me3。
2.基因注释：主要通过将位置信息与已知基因或转录本进行比对，找出该修饰位点或峰覆盖的基因或转录本区域。
这可以通过一些软件（如Homer）实现。
3.基因集富集分析：富集分析用于确定富集了哪些基因或转录本。
主要通过对研究群体中发生的修饰进行比对，并将它们与数据库中的已知生物过程、分子功能和通路进行比对。
GSEA（Gene Set Enrichment Analysis）是其中一个常用的基因集富集分析方法。
4.靶基因分析：通过基因组学技术识别相关的刻画元件，例如转录因子结合位点，然后使用所获得的细胞系的表观遗传数据来确定一组与特定情境、健康或疾病相关的基因。
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8Gene Express基因快讯2011年第2期对未知基因组测序。 以单分子测序系统PacBio RS为代表的第三代测序技术，是一种模拟天然DNA复制过程的测序技术，不仅融合了天然DNA复制高效准确的特点，而且是世界上唯一可以在不影响聚合酶活性的前提下实时观察DNA合成的测序技术。由于聚合酶的平均反应速度可达1个碱基每秒以上，因而其测序速度比Sanger测序快了几万倍。参与三代测序技术研发的Korlach与Turner，于2009年2月在《Science》杂志上发表了一篇介绍PacBio单分子DNA测序技术的文章，代表了首个第三代测序技术的“原理验证”[2]。其
后，他们又利用SMRT技术，直接测定了DNA的甲基化，这一发表在2011年5月《Nature Methods》上的研究成果，相对于目前流行的第二代测序技术显然又前进了一大步[3]。PacBio RS单分子测序系统目前的读长超过1kb，比第
二代测序要长得多，且不需要常规的PCR扩增过程，错误率也大大降低，聚合酶动力学的直接观察赋予了PacBio RS系统在测序之外的更多应用（表1）。
第一代测序技术第二代测序技术第三代测序技术技术类别直接测序深度测序单分子实时测序
文库构建片段化的基因组DNA克隆到质粒载体上并转化大肠杆菌无需克隆，片段化的基因组DNA在两侧连上接头序列并通过接头与反应基质（磁珠、微珠或芯片）相连无需克隆，片段化的基因组DNA在两侧进行末端修复并连上接头序列
PCR扩增以通用引物对质粒DNA进行PCR扩增以通用引物(与接头序列匹配的寡核苷酸序列)对反应基质上的DNA进行大规模的并行PCR扩增
无需PCR扩增，带接头的DNA与聚合酶结合，然后模拟天然的DNA合成过程
单分子测序技术在靶基因组测序及表观遗传学的应用第三代测序技术
DNA测序技术的变革DNA测序技术，不仅为基因组计划揭开了基因密码的神秘面纱，同时在诸如肿瘤及遗传性疾病治疗的医药行业、材料科学行业、石油替代物研发的生物燃料行业、产能更高的种植业和畜牧业等领域都有着重要的应用价值。测序技术最早可以追溯到20世纪50年代，即1954年出现的关于Whitfeld发明化学降解测序法的早期测序技术报导。但从严格意义上讲，直到1977年Sanger等的双脱氧
核苷酸末端终止法和Gilbert等的化学降解法的诞生，才标志着第一代测序技术的确立。尽管在完成从噬菌体基因组到人类基因组草图绘制等大量测序工作中，第一代测序技术充分展示了可靠、准确等优点，但其对于电泳分离技术的依赖及成本高、耗时长等局限性也日益显现，试想绘制一张人类基因组图谱需耗费数年时间显然无法满足临床科研的紧迫需要。进入21世纪，诞生的第二代测序技术（NGS, next generation sequencing），不仅保持了第一代测序的高准确度，而且大大降低了测序成本并极大地提高了测序速度，可将完成一张人类基因组图谱的时间缩短到一周左右的时间，因而在2007年高票当选《Nature Methods》生物领域最有影响力技术[1]。第二代测序技术最大的缺点在
于测序读长过短，其产生的大量短测序结果，犹如一堆拼图碎片，往往难以进行拼接以获取测序基因组全貌，多数情况下仍须结合第一代测序技术来进行序列的重新测序和结果拼接。可见，牺牲了读长的高速二代测序技术更适合对已知序列基因组的重新测序，显然不适用于9
Gene Express基因快讯2011年第2期荧光标记方式
荧光标记连接到核苷酸碱基上，大分子荧光染料会干扰DNA聚合酶活性
荧光标记连到核苷酸碱基，大分子荧光染料干扰DNA聚合酶活性，背景噪音高荧光标记连到核苷磷酸链并在合成DNA链后自动脱
落，不影响DNA聚合酶活性
测序和检测
以测序引物进行延伸反应,产生以不同荧光标记dNTP终止的长度不一产物，毛细管电泳检测使用可逆终止子（带荧光标记的dNTP）边合成边测序，激光扫描检测边合成边检测荧光脉冲信号的到达和持续时间，反映的聚合酶动力学信息最终转化为实时的序列信息
测序读长800 bp左右100-400bp>1000bp
应用特定区域测序已知基因组测序全基因表达图谱、SNP、 小 RNA、 ChIP、 DNA甲基化等分析，二代测序数据拼接，酶动力学观测等
表1. 一代、二代和三代测序技术的对比情况
PacBio RS系统的技术创新天然的DNA复制是一个相当微观且高速的过程。Pacific Biosciences（以下简称PacBio）公司在克服了酶学、表面化学和检测光学等一系列技术难题的基础上，研发出了单分子测序系统PacBio RS，它可在不影响DNA聚合酶活性的前提下实时地观察DNA合成。首先，实时观察DNA聚合酶需要解决的酶学难题是如何维持DNA聚合酶的高活性。因为传统的核苷酸标记方法是将荧光标记连接到核苷酸的碱基上，也就是掺入DNA链中。由于DNA聚合酶的直径只有15nm，大分子的荧光染料掺入DNA链会干扰DNA聚合酶的活性，造成聚合反应提前终止，影响了测序反应进程。PacBio RS系统采用了一种新型的核苷酸标记方法，即在核苷酸的磷酸链上进行荧光标记，这样一旦核苷酸掺入到新生DNA链中，DNA聚合酶将磷酸基团及其所带的荧光标记一并切除以形成天然DNA链。此后，脱落下来的荧光信号迅速衰减至基线并开始下一轮的合成反应。此标记方法不仅不会影响DNA聚合酶活性，同时游离的荧光信号迅速衰减以降低背景噪音，有利于提高检测过程的信噪比。其次，实时观察DNA聚合酶需要克服的表面化学难题是如何实现单个DNA聚合酶分子在基质表面的锚定和DNA合成反应。PacBio RS系统的测序是在专利的SMRT Cell中进行的，每个Cell中都有一个矩阵，上面有大约150,000个纳米级的ZMW（zero-mode waveguide，零模波导孔）。ZMW是一个直径为几十纳米的小孔，在每个ZMW中，利用专利技术将带有单条DNA样品链的单个DNA聚合酶分子锚定在底部玻璃的表面。随后核苷酸涌入ZMW中，并在阵列表面扩散。当DNA聚合酶检测到正确的核苷酸时，便将其掺入新生链中进行DNA合成反应。每个SMRT Cell能够平行检测至少50,000个单分子测序反应。再次，实时观察DNA聚合酶需要破解的检测光学难
题是如何能在DNA合成期间检测到单个核苷酸的掺入。试想当显微镜实时记录DNA链上的荧光时，周围众多的荧光标记核苷酸会形成非常强大的荧光背景噪音，影响了单分子荧光的检测和记录。PacBio RS系统采用纳米级直径的ZMW，可阻止波长约为600nm的可见激光完全透过ZMW，造成可见激光在进入ZMW后迅速衰减，保证了只有底部30nm被照亮（图1）。单个ZMW中，锚定在其底部的单个DNA聚合酶分子可检测扩散在其周围的荧光标记核苷酸，正确的核苷酸掺入新生链的过程需要几毫秒，而单纯的核苷酸扩散只需要几微秒。这种时间差使掺入的核苷酸产生了类似于脉冲信号的高强度信号，该信号随后被转换成相对应的碱基类型。因此，ZMW有能力在荧光标记核苷酸的背景下检测到单个核苷酸的掺入事件。至于检测信号的记录，PacBio RS系统使用一个大孔径物镜和四个单光子照相机来收集单个ZMW中荧光所发射的光脉冲，实时开展、监控并分析单分子生化反应；并使用一套优化的算法，将光学系统所捕获的信息翻译成ACGT碱基。一旦测序开始，实时的数据就传送到初步分析流水线，生成核苷酸信息和质量值。
基于以上酶学、表面化学和检测光学三种技术的完美融合，使PacBio RS系统在较短的时间内实现对长片段DNA的测序。另外，PacBio RS系统不仅提供全套的测序试剂和仪器配置方案，还自带有一级、二级数据分析软件，可与用户的生物信息学平台实现无缝整合，轻松实现测序数据浏览、数据过滤和比对、诸如单核苷酸多态性（SNP）等稀有突变的可视化筛查等数据分析操作。凭借较少的试剂消耗、简单的样本制备过程，低于一天的检测时间（从样本制备到测序）等一系列技术优势，使PacBio 公司被美国麻省理工学院（MIT）的《Technology Review》杂志评为2010年度全球50家最具创新力的企业之一。
PacBio RS系统在靶基因组测序中的应用PacBio RS系统在微生物、植物、动物的靶基因组测序中的应用，可以以一个最简单的微生物基因组为例，因为典型的微生物基因组一般为200-500万碱基，而通常一个PacBio RS系统的SMRT Cell可产生90Mb、读长为35,000的测序数据。采用平均读长为2700bp及5%大于6000bp的读长，PacBio RS系统可测通一个微生物基因组。此外，
图1. ZMW的检测光路图10
Gene Express基因快讯2011年第2期由于PacBio RS系统的读长较长，在覆盖率较低的情况下也能保证基因序列拼接完全。目前一些短读长技术推荐的基因组覆盖率一般需要100X，若采用PacBio RS系统则覆盖率可降低到30X以下或更低。另外，要完成对病原微生物DNA的快速测序，实现临床研究、农业生物技术、食品安全和生物防御等领域的应用，PacBio RS系统还具有一系列的技术优势：1） 极长的读取长度：可保证长结构变异的识别和完整全基因组的检测，而对基因结构的认识也可促进基因功能的理解；2） 准确性高：精确的单分子分辨率与长读长特点相结合，适合于基因序列拼接；3） 没有GC偏好：由于GC偏好会影响新基因的识别和对剪接异构体形式和表达水平的判断，如果没有GC偏好则可确保任一物种的基因序列的准确测序和拼接，及长重复序列测试；4） 快速出结果：无需扩增步骤的快速样品制备，可快速获得测序和分析结果；5） 更精细的测序：可根据初步测序结果及时优化实验设计方案；6） 动力学信息：可用于研究链特异的碱基修饰，包括潜在的毒力分析[5]；
7） 样品制备简单：无需扩增步骤的快速样品制备PACBIO RS 系统可提供多种SMRT测序方案，如标准测序、环形比对测序、频闪测序（测序方案的具体介绍参见基因快讯2011年第一期《单分子测序技术带给基因组学研究及转化医学的革新》一文），每种方法都利用了长片段读取的优势并结合SMRT bell模板形式（模板处理后形成的一个类似哑铃的结构）和单DNA聚合酶原理。根据基因组测序和序列拼接特点，PacBio RS系统给出了一套将长读长测序与环形比对测序相结合的高准确性基因组测序方案（图2）：A) 首先，采用高准确性的单分子环形比对结果修正单个长读长序列的错误；B) 修正的长读长结果可导入序列拼接运算法则ALLORA；C)拼接的重叠区可通过重测序和最初的环形比对结果来去除以形成高准确性的拼接序列。
实例1. 病原微生物序列拼接（E. coli De novo Assembly）2011年5月，肠集聚型大肠杆菌(O104:H4)的剧毒性志贺毒素引发的疾病，造成近4,000人严重腹泻和50人死亡。仅四分之一的病例出现溶血性尿毒症症状，且三分之二的死亡病例均出现此类症状。来自BGI、德国Gottingen大学及美国/丹麦研究团队的研究者采用了多种微生物测序的方式来研究此次分离到的致病大肠杆菌菌株，也获得了初步拼接的测序结果 [22]。美国马里兰医药大学（The