瞬时表达
玉米叶肉原生质体瞬时表达系统建立与优化
玉米叶肉原生质体瞬时表达系统建立与优化随着生物技术的不断发展，表达外源蛋白是生物制药领域和农业领域的重要研究内容。
原生质体瞬时表达系统是一种常用的蛋白表达技术，具有快速、简便、高效的特点。
本文将介绍玉米叶肉原生质体瞬时表达系统的建立与优化，希望能为相关研究提供一定的参考和借鉴。
一、玉米叶肉原生质体瞬时表达系统的建立1. 选材：选择适合原生质体注射的玉米品种，并进行对照实验，筛选出最适合的玉米品种。
2. 原生质体制备：对选定的玉米品种进行原生质体制备，采用酶解法或离心法，获得高质量的原生质体。
3. 质体注射：将目的基因载体注入原生质体，使目的基因载体与原生质体结合，形成重组质体。
4. 基因表达：经过一定时间的培养和处理，检测基因在质体内的表达情况，确定表达效果，并选取表达效果最好的基因进行优化。
二、玉米叶肉原生质体瞬时表达系统的优化1. 基因载体优化：对基因表达载体进行优化，如引入启动子、终止子、选择合适的启动子/终止子对基因进行调控。
2. 质体注射条件优化：探索最佳的质体注射条件，包括注射液的配制、渗透压、注射压力等因素。
3. 外源基因选择与优化：在选择外源基因时，考虑目的基因的大小、结构、稳定性等因素，进而优化外源基因的表达效果。
4. 生长调控剂的应用：在培养过程中添加适当的生长调控剂，如植物生长激素、营养液等，提高外源基因的表达。
5. 基因表达效果的检测与分析：通过蛋白质免疫印迹、荧光定量PCR等方法对外源基因的表达效果进行检测与分析，找出影响表达的关键环节。
三、玉米叶肉原生质体瞬时表达系统的应用前景1. 生物制药领域：玉米叶肉原生质体瞬时表达系统可用于大规模生产多肽类药物、抗体和疫苗等生物制药产品。
2. 农业领域：利用该系统表达抗病、抗虫、抗旱等相关基因，为农业生产提供技术支持。
3. 基因功能研究：该系统可用于外源基因的功能分析和相关途径研究。
总结：玉米叶肉原生质体瞬时表达系统的建立与优化对于蛋白表达和生物制药领域具有重要意义。
农杆菌介导的瞬时表达系统
农杆菌介导的瞬时表达系统一．溶液配制乙酰丁香酮AS 0.1M，取0.101gAS溶于5mLDMSO中，在工作台上用灭过菌的0.45μM滤膜过滤,分装入无菌小管，-20℃冰冻保存；MES 1M 调pH=5.6，过滤除菌；MgCl2 1M 过滤后灭菌；Kan 终浓度100mg/ml，过滤除菌。
(AS ，MES均购自泰安齐旺试剂公司)YEB过夜培养液(30ml)MES AS Kan 10mM20μM50μg/ mL300μl6μl15μl悬浮培养液(50ml)MES 10mM 500μl AS 200μM 100μl MgCl2 10mM 500μl YEB培养基(pH 7.2)酵母膏牛肉膏蛋白胨蔗糖MgSO4·7H2O 1g/L5g/L5g/L5g/L 493mg/L二．操作步骤1. 挑起单个农杆菌菌落，接种3mL YEB培养基（含抗生素）在200r/min，28℃摇床培养过夜，储存时间比较长的菌液可多活化两次；2. 接种2mL过夜培养的50mL的YEB液体培养基（含抗生素，10mM MES和20μM乙酰丁香酮），28℃摇床培养2-4h；3. 将上述过夜培养菌液在4℃，8000g下离心6min，收集菌体；4. 用渗透培养液重新悬浮沉淀的农杆菌细胞。
调节浓度OD600至0.5-1.0（一般需要100-150mL渗透培养液），置室温培养至少3小时，无需振荡；5. 对需要渗透处理的烟草植株无一定大小要求，一般4-5叶期，已经生长一个月左右的本生烟比较合适。
一般渗透处理下部2-3个比较大的叶片。
用针头在需要渗透处理的叶片背面非常细微地扎一细小的浅微孔，然后用3mL的无针头的注射器吸取2-3mL悬浮有农杆菌的渗透培养液，从针孔处将培养液轻微的注入叶片内。
注意用一手指从叶片下面拖住叶片，将注射器平平地堵住针孔，不让液体从叶片边缘挤压出来。
注射区域接近叶片边缘即可或根据自己的实验目的决定；6. 将处理过的烟草放回温室，照常管理。
番茄Pti基因瞬时表达与互作检测
番茄Pti基因瞬时表达与互作检测刘莹;冯国栋;张政;周宇;王洋;牛向丽【摘要】丁香假单胞菌所导致的细菌性斑点病是影响番茄产量和品质的重要病害,而番茄色氨酸苏氨酸激酶(Pto)是植物识别、防御这一病原菌的重要抗性蛋白.文章通过克隆番茄Pti(Pto interaction protein)基因Pti4、Pti5和Pti6,分别构建植物表达载体,利用农杆菌介导方法在烟草叶片中进行瞬时表达和western blot-ting 检测,并进一步利用免疫共沉淀技术,在植物体系中检测了它们与番茄Pto蛋白的相互作用.实验结果表明,利用所构建Pti4、Pti5和Pti6基因植物表达载体,在烟草中获得了预期大小Pti4、Pti5和Pti 6蛋白,并在植物体系中验证了它们与Pto蛋白的相互作用.该工作为深入研究Pti基因在番茄分子免疫途径的功能奠定了基础.【期刊名称】《合肥工业大学学报（自然科学版）》【年(卷),期】2018(041)012【总页数】6页(P1700-1704,1723)【关键词】植物抗病;植物表达载体;western印迹;免疫共沉淀;蛋白质相互作用【作者】刘莹;冯国栋;张政;周宇;王洋;牛向丽【作者单位】合肥工业大学食品科学与工程学院,安徽合肥 230009;合肥工业大学食品科学与工程学院,安徽合肥 230009;合肥工业大学食品科学与工程学院,安徽合肥 230009;合肥工业大学食品科学与工程学院,安徽合肥 230009;合肥工业大学食品科学与工程学院,安徽合肥 230009;合肥工业大学食品科学与工程学院,安徽合肥230009【正文语种】中文【中图分类】Q943.2;S511.030 引言番茄是重要的经济作物,但每年均会因病虫害造成减产。
番茄细菌性斑点病是影响番茄产量和品质的重要病害,主要危害番茄叶、茎、花、叶柄和果实,感染时产生深褐色至黑色不规则斑点[1]。
自1933年首次报道以来,番茄细菌性斑点病在全球26个国家均有发现,我国也于1998年发现。
农杆菌介导的油菜子叶瞬时表达
农杆菌介导的油菜子叶瞬时表达谭小力;诸葛锐军;李冠英;卢长明;王政;张志燕【摘要】A method for transient expression based on Agrobacterium infiltration into cotyledons of Brassica napus L. cv Ningyou 16 was developed with the Green Florescent Protein (GFP) as a marker gene. GFP expression vector pB2GW7. 0-gfp was constructed and transferred into agrobacterium. The addition of P19 protein improved the transient expression level of GFP in cotyledon. Reverse transcription assay showed that GFP was expressed after 4-8 days of agrobacterium infiltration. Confocal microscopical analysis revealed that epidermal cells and guard cells could be transformed by agrobacterium-based transformation method. The entire process only took 20 days from sowing seed to protein analysis. Therefore, this new method is simple and rapid. It has a potential application in dissection genes expression and function in Brassica napus.%实验以甘蓝型油菜宁油16为材料,绿色荧光蛋白(GFP)为报告基因,建立了农杆菌介导的油菜子叶瞬时表达系统.我们构建了GFP表达载体pB2GW7.0-gfp,并成功转化农杆菌.实验中通过添加P19来提高GFP在油菜子叶中的瞬时表达量.并提取了注射有P19和pB2GW7.0-gfp农杆菌混合液的油菜子叶RNA,经RT-PCR鉴定,发现在4 ～8 d GFP均能表达.激光共聚焦显微镜分析表明农杆菌介导的油菜子叶瞬时表达系统能够转化油菜子叶的表皮细胞和保卫细胞.甘蓝型油菜子叶瞬时表达方法简便、快速、可靠,从种子播种到获得荧光蛋白表达,全过程只需要20d.表明在研究油菜基因的表达和功能方面有潜在的应用前景.【期刊名称】《生物学杂志》【年(卷),期】2012(029)006【总页数】4页(P93-96)【关键词】甘蓝型油菜;子叶;农杆菌;瞬时表达【作者】谭小力;诸葛锐军;李冠英;卢长明;王政;张志燕【作者单位】江苏大学生命科学研究院,镇江212013;江苏大学生命科学研究院,镇江212013;江苏大学生命科学研究院,镇江212013;中国农业科学院油料作物研究所,武汉430062;江苏大学生命科学研究院,镇江212013;江苏大学生命科学研究院,镇江212013【正文语种】中文【中图分类】Q786油菜在世界各地广泛种植，在油料作物中其产量仅次于大豆与棕榈，位居第三。
棉花GhCCR4基因的瞬时表达研究
Ａｂ ｔ ｃ：Ｉ ｈ ｓｐ ｐ ｒ ｔ ｅ ｒ ｌ ｆＧｈ Ｒ４ ｉ ｏ ｔｎ ｆ ｅ ｅ ｅｏ ｍｅ ｔ ｓｅ ａ ｎ ｄ Ｂｅ ａ ｓ ｈ ｅ ｅ ａ ｉｇ ｏ ａ ｓ ｅ ｉ ｓｒ ｔ ｎ ｔ ｉ ａ ｅ ， ｈ ｏ ｅ ｏ ＣＣ ｎ ｃ ｔ ｂ ｒｄ ｖ ｌ ｐ ｎ ａ ｏ ｉ ｗａ ｘ ｍｉ ｅ ． ｃ ｕ ｅ ｔ ｅ ｇ ｎ ｒｔ ｆｔ ｎ ｇ ｎ ｃ ｎ ｒ
ｔｉｅ ｅ ａ ｆ ｎｈ ｓ （ Ａ） ｖ ｌｓ ｒ ｐ ｌ ｄ Ｔ ｅｏ ｔ ｌ ｏ ｄｔ ｎ ｏ ｏ ａｄ ｎ ｃｕ ｅｈ ｌ ｍ ｒｓｕｅ ａｎ ｄｗｈ ｎ０ｄ ｙｏ ｔｅ ｉ ０ＤＰ ｏ ｕ ｅ ｅａ ｐｉ ． ｈ ｐｉ ｎ ｉｏ ｓｆｒ ｍｂ ｒ ｍｅ ｔｎ ｌｄ ｅｉ ｐ ｅｓ ｒｓ ａ ｓ ｗｅ ｅ ｍａ ｃ ｉ ｂ ｉ ｕ
Ｑ Ｎ Ｃ ａ ， Ｉ ａ —ａ ， ＡＮ Ｌｎ Ｉ ｈ ｏ Ｎ ｉ ｎ ， Ａ Ｈ ｎ －ｉ ， ０Ｍｅｇ ＨＡ ｉｏｙ ｎ Ｆ ｉｇ Ｚ ｙ ｎ
（ ｓｔｔｏ Ｎｕｌ ｒ ｎ ｉｌ ｉ ｌ ｅｈ ｏｏｉ ， ｎｉ ｇＡ ａｅ Ａ ｒ ｕｔ ａ Ｓｉ ｃｓＵ Ｉ ｔｕｅ ｆ ｃ ａ ｄ ｏｏ ｃ ｃｎ ｌｇｅ Ｘｉ ａ ｃｄｍｙｏ ｇ ｃｌ ｒｌ ｃ ｎ ｅ， ｍｍｑ ０ ９， ｈ ａ ｎｉ ｅ ａ Ｂ ｇ ａＴ ｓ ｊｎ ｆ ｉ ｕ ｅ ｉ ３ ０ Ｃ ｉ ） ８ １ ｎ
犬瘟热病毒N蛋白基因真核表达质粒的构建与瞬时表达
关键词 ： 犬瘟热病毒 ； 白基 因； Ｎ蛋 真核表达载体 ； 瞬时表 达
中图分类号 ：８２ ６ ５ ￥５ ．５ 文献标 识码 ： Ａ 文章编号 ：０ １ ４ ３ （０２Ｊ３—０６ ０ １０ — ３０ ２ １ ０ ５ ０— ５
Ｃｏ ｓｒ ｔｏ ｎ ａ ｉｎ ｐ ｅ ｓｏ ｆＥｕ ａ ｙ ｔｃ Ｅｘ ｅ ｓｏ ａ ｍ ｉ ｎ ｔｕｃｉ ｎ ａ ｄ Ｔｒ ｎｓｅ ｔＥｘ ｒ ｓ ｉｎ ｏ ｋ ｒ ｏ ｉ ｐｒ ｓｉｎ Ｐｌ ｓ ｄ
新 疆农 业科 学 ２ １ ，９ ３ ：６ ５ ４ ０ ２ ４ （ ） ５０— ６
Ｘｎｉｎ ｇ ｃｌ ｒｌ ｃｅｃ ｓ ｉ ａ ｇＡ ｒ ｕｔ ａ Ｓ ｉ ｅ ｊ ｉ ｕ ｎ
ｄｉ１．０ ８ ｊｉ ｎ １０ — ３０ ２ １ ．３ ０５ ｏ：０ ６４ ／．ｓ ．０ １ ４ ３ ．０ ２ ０ ．２ ｓ
犬瘟热病毒 Ｎ蛋 ห้องสมุดไป่ตู้基 因真核表达 质粒的构建与瞬时表达
简子健 ， 马素 贞， 申卫红 ， 翟少华 ， 森 赵
（ 新疆农业大学动物 医学学院， 乌鲁木齐 ８ ０ ５ ） ３ ０２
摘
要 ：目的 】 【 构建犬 细小 病毒 （ Ｐ ） Ｐ 因真核 表达质 粒 ， Ｃ Ｖ Ｖ ２基 为研 究核 酸疫 苗奠 定基 础。【 方法 】 考 参
１ ７ ｐ的 Ｃ Ｖ Ｎ蛋 白基因片段 ， ２ｂ ５ Ｄ 并构建了真核表达质粒 ｐＤ Ａ ． （＋）一Ｃ Ｖ Ｎ， 瞬时表达 的小 白鼠肝 ｃＮ ３ １ Ｄ 从
脏 总 Ｒ Ａ中可扩增到 目的条带。【 Ｎ 结论】 构建了犬瘟热病毒 Ｎ蛋 白基因真核表达质粒 ， 小白 鼠体 内进 行 并在
ｆｒＮ ｏｅｎ Ｇｅ ｅｏ ｎｎ ｓｅ ｅ ｒ ｓ（ ０ Ｐｒ ｔｉ ｎ ｆＣａ ｉｅＤｉｔｍｐ ｒＶｉｕ ＣＤＶ）
大豆原生质体瞬时表达体系的建立及大豆隐花色素的亚细胞定位
中文摘要大豆原生质体瞬时表达体系的建立及大豆隐花色素的亚细胞定位隐花色素是植物体内的一类重要的蓝光受体，能够介导光信号调控植物的去黄化、开花、避荫反应等多种生长发育过程。
隐花色素在模式植物拟南芥中得到了较好的研究，而在大豆等主要作物中的研究较少。
原生质体瞬时表达体系能够快速、高效地实现目标蛋白的亚细胞定位分析。
本文希望利用大豆原生质瞬时表达体系对大豆隐花色素在黑暗和蓝光下的亚细胞定位进行分析，为大豆隐花色素的功能预测提供信息。
由于尚无大豆原生质体转化方法的报道，本文尝试利用酶解法裂解大豆叶片细胞壁获得了原生质体，并用PEG介导的方法成功将外源载体转入大豆叶片原生质体并表达。
进一步对酶解液组成、PEG分子量、叶片时期、质粒浓度和转化时间等影响因素进行分析，确定了大豆叶片原生质体提取和转化的最佳条件，建立了高效的大豆叶片原生质体瞬时转化体系，转化效率达50 %以上。
通过该体系将大豆7个隐花色素(GmCRYs)转入大豆叶片原生质体并观察了其在黑暗和蓝光下的亚细胞定位情况。
具体结果如下：1）最佳叶片时期：出土10天的真叶或刚展开的第一片三出复叶。
2）最佳裂解酶成分：1.0 %纤维素酶，0.2~0.4 %果胶酶。
3）最佳PEG分子量：4000。
4）最佳质粒浓度：大于或等于1 μg/μL。
5）最佳转化时间：15分钟。
6）大豆隐花色素的亚细胞定位：GmCRY1a、GmCRY1b、GmCRY1c和GmCRY1d在黑暗下分布于细胞核和细胞质中，见蓝光后迅速在细胞质中形成类似光小体的结构。
GmCRY2a、GmCRY2b和GmCRY2c持续定位在细胞核中，见蓝光后没有观察到明显的光小体结构形成。
关键词：大豆，隐花色素，原生质体，亚细胞定位AbstractEstablishment of the Protoplasts Transient Gene Expression System and the Subcellular Localization of Cryptochromes in SoybeanCryptochromes are a kind of blue light receptors which mediate the regulation of growth and development in plants by mediating various light responses including de-etiolation of seedlings, flowering time, shade avoidance response, and so on. Many secret of cryptochromes have been revealed in Arabidopsis, however, it is little known about the cryptochromes in soybean. The transient gene expression system using protoplasts has provided a rapid and highly efficient way for the subcellular localization.We want to investigate the subcellular localization of soybean cryptochromes in darkness and under blue light using soybean protoplasts and provide information on the function of cryptochromes in soybean. There is little report about soybean protoplasts transformation, however, we have successfully isolated the protoplasts by enzymatic digestion of mesophyll cells from soybean and transformed the expression vector to the protoplasts for subsequent transient expression, which is mediated by PEG. Moreover, we optimized the main influencing factors including the suitable enzyme digestion system, the molecular weight of PEG, the different growth stages of leaves, the plasmids concentrations and the incubation time, and developed an efficient transient gene expression system using soybean mesophyll protoplasts whose transformation efficiency is over 50 %. We studied the subcellular localization of cryptochromes in soybean in darkness and under blue light using this system. The main results are showed as follows:1)The best growth stages of leaves: the 10-day-old unifoliolates afteremergence and the first trifoliolates which is just unfolding.2)The best enzyme digestion system: Celluase 1.0 %, Pectolase Y-230.2~0.4 %.3)The best molecular weight of PEG: 4000.4)The best plasmids concentrations: greater than or equal to 1 μg/μL.5)The best incubation time: 15 min.6)The subcellular localization of cryptochromes in soybean: The GmCRY1a、GmCRY1b、GmCRY1c and GmCRY1d are located in the nucleus and thecytoplasm of cells in darkness，and formed photobody-like structure incytoplasm while transferred to blue light. The GmCRY2a、GmCRY2b andGmCRY2c are always present in the nucleus, and it is difficult to observe thephotobody formation of the GmCRY2a、GmCRY2b and GmCRY2c.Keywords:Soybean, Cryptochromes, Protoplast, Subcellular localization中英文对照表英文缩写英文全称中文CRY Cryptochrome 隐花色素PHY Phytochrome 光敏色素Phot Phototropin 向光素PEG polyethylene glycol 聚乙二醇FAD Flavin Adenine Dinucleotide 黄素腺嘌呤二核苷酸SPA Suppressor of Phytochrome A 光敏色素A抑制子COP Constitutive Photomorphogenic 持续性光形态建成CIB cryptochrome-interactingbasic-helix-loop-helix 隐花色素互作bHLH转录因子BIC Blue-light Inhibitor of Cryptochromes 隐花色素的蓝光抑制子YFP Yellow Fluorescent Protein 黄色荧光蛋白DAE Days After Emergence 出土后天数目录第1章 绪论 (1)1.1 隐花色素 (1)1.1.1 隐花色素的发现 (1)1.1.2 隐花色素的结构 (2)1.1.3 隐花色素的功能 (3)1.1.4 植物隐花色素的光激活及光信号传递机制 (8)1.2 植物原生质体的基因瞬时表达体系 (12)1.2.1 原生质体的分离 (12)1.2.2 原生质体的转化 (13)1.2.3 原生质体的培养 (14)1.3 研究目的与意义 (15)第2章 材料与方法 (16)2.1 试验材料 (16)2.2 主要试剂的配制 (17)2.3 大豆原生质体瞬时表达体系的建立 (19)2.3.1 pA7-YFP质粒的扩繁与提取 (19)2.3.2 大豆叶片原生质体的提取 (22)2.3.3 大豆叶片原生质体的转化 (23)2.4 大豆隐花色素的亚细胞定位观察 (26)2.4.1 大豆隐花色素进化树及蛋白序列分析 (26)2.4.2 pA7-GmCRYs-YFP载体的构建 (26)2.4.3 pA7-GmCRYs-YFP载体转化大豆叶片原生质体 (29)2.4.4 大豆隐花色素亚细胞定位的观察 (29)第3章 结果与分析 (30)3.1 大豆原生质体的提取与转化 (30)3.1.1 大豆叶片裂解酶浓度的选择 (30)3.1.2 PEG分子量对大豆叶片原生质转化的影响 (31)3.1.3 叶片生长时期对大豆叶片原生质体化的影响 (31)3.1.4 质粒浓度对大豆叶片原生质转化的影响 (32)3.1.5 PEG处理时间对大豆叶片原生质转化的影响 (33)3.2 大豆隐花色素色素的序列分析及亚细胞定位 (33)3.2.1 隐花色素的蛋白序列比对和进化树分析 (33)3.2.2 大豆隐花色素（GmCRYs）的亚细胞定位 (35)第4章 讨论 (39)4.1 大豆叶片原生质体的转化 (39)4.2 大豆隐花色素的亚细胞定位 (40)第5章 结论 (43)参考文献 (44)作者简介 (53)致 谢 (54)第1章绪论1.1 隐花色素植物不能像动物一样移动，面对时刻变化的周边环境，它们只能通过调控自身生长来适应环境。
基于绿色荧光蛋白瞬时表达的植物亚细胞定位方法_于一帆
江苏农业科学 2014 年第 42 卷第 12 期
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统，由于没有细胞壁等特点，它可以排除细胞之间的相互影 响，单独考察 1 个细胞的全能性。原生质体是 1 个均一性程 度很好的群体，并且在短时间内就能获得大量原生质体。原 生质体是 1 个理想的试验系统，由于不受植物细胞壁的限制， 其质膜经一定处理可以摄取外源物质（ 如细胞器、病毒、DNA 等） ，是遗传转化的理想受体系统［11］。研究表明，不同植物材 料所得到的原生质体可以保持原组织的生理生化特性，可以 取代植物组织作为理想的试验材料。 1． 1 PEG － Ca2 + 介导转化法
lus： vol． 707［M］． New York： Wiley，1990．
Байду номын сангаас
［9］Stülke J，Hillen W． Ｒegulation of Carbon catabolism in Bacillus spe-
［6］Ye Ｒ Q，Kim J H，Kim B G，et al． High evel secretory production of
脂质体介导转化法是将质粒 DNA 包裹在脂质体中，然后 与原生质体接触融合而把外源 DNA 带入原生质体的 1 种方 法。脂质体是 1 种由磷脂、胆固醇、脂肪酸等脂类分子组成的 球形膜囊结构，可将 DNA、ＲNA 等大分子物质包在脂质体内， 免受细胞内核酸酶的降解。脂质体可做成单层、双层或多层。 脂质体进入原生质体主要发生在脂质体与原生质体共培养的 起始 2 h，共培养 90 min 后，加入一定浓度的 PEG 能提高脂质 体、原生质体融合的频率。 1． 4 植物病毒载体介导法
基于绿色荧光蛋白瞬时表达的植物亚细胞定位方法
于一帆，朱小彬，葛会敏，陈 云
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对改变的基因分类
• 茉莉酸甲酯（MeJa）处理后的基因改变有 两种可能，一种是受MeJa诱导后基因表达 改变，但是不影响生物碱的合成，另外一 种就是基因改变引起了生物碱的积累。 • 为了基因分类，选取了两种蛋白启动子的 表达量作为标准，对预测基因进行实验研 究。 • PMT（腐胺-N-甲基转移酶）和PAL（L-苯丙 酸氨基水解酶）
何为cDNA-AFLP
• cDNA-AFLP技术结合了RT-PCR和AFLP技术， 其基本原理：以纯化的mRNA为模板，反转 录合成cDNA。用识别序列分别为6-bp和4bp的两种限制性内切酶酶切双链cDNA，酶 切片段与人工接头连接后，利用与接头序 列互补的引物进行预扩增和选择性扩增， 扩增产物通过聚丙烯酰胺凝胶电泳显示． • 常用的分析差异表达基因的方法 ，准确反 映基因间表达量的差别 。
三、研究需要
• 随着通过分析基因组规模数据集获得许 多新的 候选基因，例如微阵列转录模式或蛋白质-蛋白质 的互作研究，并且只有少量的能够用于转基因研 究。因此就需要有新的方法来迅速测定基因的功 能和鉴定新基因 。
• 瞬时表达分析不适合复杂的生物体研究，但是植 物原生质体瞬时表达分析在研究广泛的分子机制 ，包括信号传导和新陈代谢通道，以及转录的网 络调控是很有用的。
何为瞬时表达(Transient expression)
• 瞬时表达：外源基因进入受体细胞后，未整合进 受体细胞基因组而立即转录，出现基因产物 。
• 是一种快速的研究基因表达、蛋白质亚细胞定位 及基因间互作的一种重要手段，与传统的转基因 相比，瞬时表达不需要整合到染色体上，因此具 有简单、快速、周期短、准确等优点 。瞬时表达 不受基因的位置效应和基因沉默的影响，表达效 率较稳定，转化率高。同时，瞬时表达不产生可 遗传的子代，生物安全性高。
图示（R平方为相似度）
烟草茉莉酸信号途径研究
• 技术路线
一、茉莉酸处理结果分析
二、 发生改变的基因分类
三、确定基因研究参考指标 四、实验验证参考指标 五、筛选可能的诱导基因 六、过表达研究获得的基因
何为BY-2细胞
• • • • • • • • • • • 烟草BY2细胞(Nicotiana tabacum L．ev Bright Yellow 2。BY2)是一个非常重要且用途广泛的细胞系。它由Kato 等于1972分离得到．在现有已建立的成熟植物细胞系 中被认为是植物细胞中的Hela细胞。BY2细胞可以比较 容易的转化外源基因，且转基因细胞团和悬浮培养细 胞都较易得到。此外，该细胞系具有高度的同一性，并且 生长迅速，经阿非迪霉素(aphidicholin)处理后，可以获得 具有高度同周期性的细胞．1周内可以增加80～100倍。 因此．BY2细胞已经成为研究细胞周期的模式系统，这 使得该细胞系成为分子生物学和细胞生物学研究的良好 材料。
过表达转染BY-2细胞
• 将两个新发现的基因克隆进过表达载体， 后导入农杆菌，侵染受过MeJa诱导过转基 因BY-2细胞系。作为对照，只带有新霉素磷 酸转移酶标记基因的载体pDE1001和经过瞬 时表达分析验证过，不影响PMT活性的基因 T172 ORF的载体。结果显示， NtORC1 和 NtJAP1 的过表达会导致转基因组织的过早 褐化。
二、Then reaLeabharlann on for this problem
• 1、基因的种类繁多，通过试验来区分的难 度大。 • 2、被认为是“黄金标准”的稳定转基因技 术解决了部分基因的功能研究问题，但是 受到遗传扰动这一致命的影响。培养大批 量的转基因植株工作繁重。 • 3、通过正常的生物活动如插入突变沉默和 基因异位表达往往不能得到预期的表型。
自动化操作平台
自动化操作系统
载体质粒对比分析
• 在任何实验方案中，能够准确又简单的克 隆出所有必需的DNA片段是很重要的，目的 是为了对大型基因组进行系统的功能分析 • 本文设计将绿色荧光蛋白和萤火虫荧光素 酶 ，分别连接大的双向T-DNA质粒和最小的 骨架质粒，转入拟南芥和烟草BY-2原生质体 进行瞬时表达。结果表明最小质粒的表达 效率高。确定实验用的载体质粒为大肠杆 菌最小质粒
结果图
原因分析
• 1、活化的植物防御响应在转基因植物中的 适应性已经显示降低了。 • 2、这项观察可用生物碱（或其他次生代谢 分子）的积累来解释，生物碱的积累对多 数细胞类型是有毒性的，包括产生它们的 烟草细胞(Goossens et al., 2003a)。尽管 NtORC1和NtJAP1过表达不会导致强烈的生 长抑制，可是它会导致增强对胁迫的敏感 性通过大片胼胝体变成褐色来显示出来。
步做研究相似功能的基因协同性准备）
获得的基因
一次筛选及结果
• 每组做四个重复，实验均有一个内参。即是 PMTpro::fLUC::35Ster+一个基因（ 35Spro::GCS::35Ster）+35Spro::rLUC::35Ster • 或者PALpro::fLUC::35Ster+一个基因（ 35Spro::GCS::35Ster）+35Spro::rLUC::35Ster。 • 共转染。用GUS作对照。第一天是转染，第二天 进行细胞溶解和荧光素酶分析。 • 最终发现NtORC1 和NtJAP1 和MC307导致PMT启动 子的活性增加，但是不影响PAL启动子活性。
• 4、利用自动化的TEAs ,成功的破解了烟草尼 古丁生物合成的激活通道，发现了两个转 录调控因子， NtORC1 和NtJAP1 。序列分析 表明两者都属于AP-2家族 ，含有ORCA转录 因子来调节长春花中萜类吲哚生物碱的合 成。
个人心得
• 通过本文献的学习，基本了解了瞬时表达 应用于基因功能筛选的原理及思路设计流 程。 • 懂得了一个良好的实验需要缜密的实验设 计和充分的实验验证。
Why chose these two proteins as the standard?
• PMT 在尼古丁生物合成的第一步，是一个 关键的催化作用酶。他的含量决定的尼古 丁合成的强度。
• PAL是酚类复合物合成的核心酶，他的含量 决定尼古丁的含量。
初步验证两个参考标准
• 分别克隆PMT 和PAL的上游和ORF，在他们的下 游连接上报告基因fLUC，构建表达载体 GCS::fLUC::35Ster。验证原生质体是否像细胞一 样受MeJa诱导。 • 分别将两种两种载体转化烟草BY-2原生质体做 瞬时表达分析，八个重复的平均 MeJa诱导前后 的结果如下：
结果图
二次筛选
• 通过超过十次的二次转染，统计数据与GUS 比较，分析结果表明， NtORC1 和NtJAP1 分 别是对照的2.9-10.3倍和1.4-2.9倍。而 MC307则未被证实。如下图（P值为差异值 ）
协同效应研究
• 通过共转染，研究了新发现的两个转录调 控因子NtORC1 和NtJAP1 的协同效应。结果 如下图
尼古丁生物合成调控功能因子的筛 选
• 1、查阅文献，了解相关研究后，通过代谢 物分析和cDNA-AFLP技术，研究茉莉酸甲酯 处理烟草BY-2细胞后基因的变化情况。 • 结果是：茉莉酸甲酯处理几个小时，细胞 新陈代谢系统完全改变，许多生物碱 ，尼 古丁，新烟碱，新烟草碱迅速积累，许多 基因的表达模式改变，多数为上调。
酶活测定结果
分析
• 上图显示，尽管fLUC和rLUC的酶活数目不同 ，但是有相同的趋势，他们的关联系数R =0.932。HEAT map 显示相同的样品之间 fLUC酶活性就存在很大的差异。他们之间的 平均标准误为6.9%，但是根据统计学关联 差异度，如果以rLUC的酶活数目为内部调控 做标准化，这种标准误就降低到了2.6%。 • 这就说明，在瞬时表达分析时，加入内部 调控报告基因，能够大大降低误差。
烟草细胞中茉莉酸信号通路自 动化和标准化的瞬时表达分析 探究
汇报人：***
综述
一、基因研究现状
尽管基因序列信息和基因组分析已近 大大提升了人们的研究空间，但是对 大多说基因的具体功能仍不是很清楚。 即使是在模式作物中，至少有三分之 一的基因功能是未知的。大多数基因 是依靠序列同源性和转录物类型进行 分类的，并且最多有十分之一的基因 是通过分子生物学和遗传学进行更深 的研究。基因功能研究受到挑战。
转化效率研究
• 分别以拟南芥PSB-L细胞原生质体和烟草BY2细胞原生质体为转录体，用10 μg带有 35Spro::eGFP::35Ster最小载体DNA做瞬时表 达分析，20h后，荧光蛋白量达到30%。如 果想提高含量，需要长时间的孵育。fLUC需 要超过一天。
质粒DNA的用量标准验证
• 因为质粒DNA的总量是瞬时表达实验的一个 限制因子。设计了带有35Spro::rLUC::35Ster 的最小质粒，转染拟南芥和烟草BY-2.来测 定0.5–10 μg之间，rLUC的活性。BY-2显示的 是一个对数关系曲线(R2=0.9943; n=8)，拟南 芥显示的是一个指数关系(R2 =0.9941; n =4) 。根据瞬时表达的要求原生质体数目为104 到105 原生质体数，选择了BY-2的使用量为 1μg。
类别 PMT（1-2h） PAL (2-4h) 未处理 36×10-3 156×10-3
MeJa诱导（50μM）
61×10-3 239×10-3
1.7倍 1.5倍
选择可能的诱导基因
• 通过cDNA-AFLP 标记研究6h MeJa诱导后编码
蛋白但功能未知的基因，挑选已经有预测的可能 参与转录过程的基因。共得到17条。如下图 RF。全部替代克隆进同一种 载体p2GW7（值得注意，这样做是为了进一
请老师，同学指点
谢谢
本文要点
• • • • • • 实验用的载体选择方法 原生质体PEG自动化转染 双荧光素酶转录读出标准化分析 原生质体转化效率分析 尼古丁生物合成途径中潜在调控因子筛选 NtORC1 和NtJAP1 转入BY-2 影响分析