血小板抗原血清学的检验方法及临床意义
流式细胞术(Flow Cytometry,FCM)检测血小板功能及其临床应用
流式细胞术（Flow Cytometry，FCM）检测血小板功能及其临床应用血小板功能的检测包括测定血小板粘附、聚集和活化的能力。
然而，在血小板相关疾病的诊断中，检测血小板功能的方法常常是有争议的。
这通常是由于方法本身的原因造成的［1］，譬如，静脉阻滞、抗凝剂选择、离心，甚至标本处理不当等因素，都可导致医源性血小板激活，影响临床诊断的价值。
这就要求建立一种灵敏、精确、快速、简便，最好可用于临床常规检测血小板功能测定方法。
关键词：血小板临床应用流式细胞术血小板功能的检测包括测定血小板粘附、聚集和活化的能力。
然而，在血小板相关疾病的诊断中，检测血小板功能的方法常常是有争议的。
这通常是由于方法本身的原因造成的［1］，譬如，静脉阻滞、抗凝剂选择、离心，甚至标本处理不当等因素，都可导致医源性血小板激活，影响临床诊断的价值。
这就要求建立一种灵敏、精确、快速、简便，最好可用于临床常规检测血小板功能测定方法。
由于血小板的活化程度可由血小板膜糖蛋白表达水平的高低来判断，近年来，文献报道利用流式细胞术，特别是全血法流式细胞术，检测血小板膜糖蛋白的表达［2］。
该技术能灵敏、特异地检测血液中活化血小板，并评价其功能。
现就全血法流式细胞术检测血小板功能的方法及临床应用现状和潜力进行综述。
一、全血法流式细胞术1.方法学：流式细胞仪能快速测定大量个体细胞的特性。
样品中欲分析的细胞预先进行荧光标记，然后由压缩氮经硅管送达标本室，再以5 000～10 000个细胞/秒的速率逐个射入光敏感区。
在适当波长的激发光作用下，被特殊染色的细胞发射出一定量的荧光脉冲讯号。
探测器收集每个细胞的荧光讯号和光散射，然后传入计算机进行分析。
传统的流式细胞术检测血小板膜糖蛋白的表达，常用的样本是经洗涤的血小板或富含血小板的血浆。
由于血小板极易活化激惹，样本经离心、洗涤等步骤，容易人为地导致体外血小板激活，影响临床诊断价值。
为此，Shatti等［2］引入了全血法流式细胞术。
血清学检测临床分析
2.3开展母婴血小板血型及多种血液病(ITP、SLE)的研究：可早期预测、预防NAITP及早期流产的发生，达到优生优育的目的[2]。
2.4适合性血小板输血治疗，提高血小板成分输血相容性，达到安全有效的输血目的。SEPSA已对几万份标本进行了血小板抗体检查，有助于解决血小板成分输注治疗及血小板免疫性疾病的诊断和治疗上的迫切问题。SEPSA方法简易、快速、敏感、特异性强，应用范围广，特别在血小板交叉配合试验中是一种较为有效的方法。它不需要特殊的仪器设备，适合我国国情，正在全国各医院血库、临床实验室推广应用，已有不少应用成果发表。虽然已建立多种血小板抗原抗体血清学检测技术，但任何一种方法总有不足之处，不会是完美无缺，另外还有一个检测阈以及技术人员的掌握熟练程度等影响因素。目前谁也不敢说哪种方法能达到100％的正确率，任何一种方法学都有其一定的限制性，应相互互补。根据不同的检测要求及自身试验条件(如经费、设备、时间、标本量)等选择相应有效的一种或几种检测方法，并善于灵活应用各种方法，才能得出一个正确的结论。随着时代不断前进，科学不断进步，各种检测新技术不断发展，方法学的研究也在改进提高。
1.5特异的单克隆抗体对血小板抗原固定试验(MAIPA)
特异的单克隆抗体对血小板抗原固定试验(MAIPA)是1987年Kiefel等人发明的一项应用最广泛的血清学技术。原理是在血小板上先结合人的同种抗体，然后再结合鼠抗人血小板抗体，裂解血小板后，把裂解产物移至包被的羊抗鼠IgG的平底板内，通过辣根过氧化物酶标记羊抗人IgG检测人的血小板同种抗体。这项技术具有下列优点：敏感性强，在血清中被污染的抗体也可检出。由于MAIPA试验具有高度敏感性，使得像Br(HPA－5)这样在血小板膜上数量很小的抗原也能得到表达。另外，当怀疑患儿可能是胎儿及新生儿同种免疫血小板减少症时，采用MAIPA技术对双亲进行配型，可以检测出许多低频率的同种异体抗原。其缺点是在未知抗体检测时必须使用一组单克隆抗体，而又不能对所有糖蛋白具有活性。因此，如果人抗体与单克隆抗体和同一个抗原决定簇反应，就会引起假阴性结果。
3-血小板血型系统与检测技术
特制血小板
移除大部分血浆的PLT---儿童、ABO不相容
洗涤PLT---有IgA抗体的患者
以引起血小板的破坏，也可影响血小板的生成。
• ITP患者的治疗 基于ITP的基本发病机制，临床上对ITP患者作血 小板输注不仅没有疗效，而且有可能因血小板表面各 类血型抗原的同种免疫作用，导致输血后紫癜等输血 反应。 为此，临床上通常应用皮质激素等免疫抑制剂和 脾切除术作为 ITP 的主要治疗方法，并通过大量血浆 置换及大剂量静脉射免疫球蛋白等治疗，达到降低血 小板抗体效价、减缓血小板破坏、升高血小板计数和 纠正出血症状的目的 国内报道应用长春生物碱类药物偶联单采血小 板，给难治型ITP患者输注，获得较好的效果。
原因：胎儿和母亲间的血小板血型不合
症状：内脏和中枢神经系统出血，脑水肿，婴儿出生时
(12~24小时)有严重、广泛的瘀点和瘀斑。或出生时 正常,于二、三天后出现血小板减少症 诊断：母体血小板抗体检测，抗原检定 患儿血小板抗体(表面、游离)检测
预后：死亡率13%
• NAITP的治疗措施
主要是给患儿输入与母体血清中同种 抗体无反应性的血小板，也可以对患儿 进行换血治疗，纠正患儿的血小板减少。 对新生儿的治疗一般选用静脉内注射免 疫球蛋白。
注： 血小板计数单位为µ l,体表面积单位为m2 输前立即计数；输后1小时；输后24小时计数；输入 的血小板总量
• 诊断标准：
输注血小板后1小时CCI<7500 输注血小板后24小时CCI<4500
血小板回收率（PPR）的计算公式
（输血后血小板计数-输血前血小板计数） ×血容量
输注血小板总数（×1011） ×100%
血小板抗体检测意义之欧阳引擎创编
血小板抗体检测意义欧阳引擎（2021.01.01）因血小板抗体引起的临床问题和疾病已引起全社会的严重关注，成为临床亟待解决的问题。
血小板抗体检测（或筛选）包括白细胞特异性和组织相容性抗体和血小板特异性和组织相容性抗体。
白细胞、血小板抗体是引起临床非溶血性发热性输血反应的最主要原因，非溶血性发热性输血反应是临床很常见的输血不良反应，文献报道输注红细胞为2～6%，输注血小板为20～30%，多次输血患者高达27％～63％，而非溶血性发热性输血反应与血小板抗体密切相关，是影响临床安全输血的严重因素。
血小板抗体的检测对于预防和减少非溶血性发热性输血反应非常有意义。
（一）输注红细胞悬液：1.血小板抗体检测阳性患者的非溶血性发热反应明显高于血小板抗体检测阴性患者；血小板抗体检测阳性患者经干预后非溶血性发热反应明显下降。
2. 干预措施：1）建议使用去白的红细胞（血库型或床旁型白细胞滤器） 2）建议使用洗涤的红细胞3）使用药物(二) 输注血浆：1）输血性急性肺损伤(transfusion related acute lung injury，TRALI)：文献报道，输血后发生的一系列严重呼吸窘迫病,其80%病例输入的血液中含有血小抗体。
研究已经证实：血小板抗体是引起TRALI的重要因素之一。
上海市血液中心杨颖教授认为中国免疫性TRALI发病虽少，但严重型较多。
2）不同国家TRALI发生\死亡率UK SHOT 德国丹麦法国加拿大1996-2003 1995 – 2002 1999 – 2002 1994 –19982000 –2003例数 139 101 6 34 21发生率% 7 3 7 0-15 0-5死亡率%9 NR NR 20 9检测患者、供者血液的血小板抗体是可行的、必要的，目的是进一步保证输血安全。
（三）输注血小板临床血小板输注无效发生率为30%～70%，其中免疫因素引起的血小板输注无效约为20%。
血小板抗体是临床引起免疫性血小板输注无效的最主要原因，文献报道20～80%多次输血的患者出现免疫性血小板输注无效，血小板输注无效会导致昂贵的血液和医疗资源的极大浪费，同时给患者造成较大的经济损失和身体损害。
血小板抗体检测 宣传
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血小板抗体检测工程〔固相凝集法〕
一、根本原理：
二、血小板抗体检测的临床应用
(一)在临床辅助诊断中的作用
1、特发性血小板减少性紫癜〔ITP〕：ITP的临床病症很重要，但仍为排解性诊断。
如结合血小板抗体检测，则对ITP确实诊有重要价值。
2、血液系统疾病辅助诊断：对白血病、再生障碍性贫血、骨髓异常增生综合症、溶血性贫血、新生儿血小板减少症有辅助诊断意义。
3、孕期流产风险评估：血小板抗体筛查可对孕期流产风险做出评估，尤其适用于有屡次妊娠史、习惯性流产史以及不孕不育情况查因。
〔二〕在临床输血医治中的应用
1、预防红细胞输注中非溶血性发热反响：血小板抗体阳性患者输注红细胞悬液后发生非溶血性发热反响明显高于阴性者，对于血小板抗体阳性采取干预措施后非溶血性发热反响明显降低，极大提高了输血的平安性。
2、预防血小板输注无效：血小板抗体是引起免疫性血小板输注无效最重要的原因，特别是屡次输血后出现的血小板输注无效。
检测血小板抗体对提高血小板医治效率和保证输血平安有重要意义。
三、血小板抗体检查的筛查对象
1、血液肿瘤科病人：评价患者体内血小板抗体水平，辅助诊断血液系统疾病：如白血病、再障、溶血性贫血、血小板减少性疾病、骨髓异常增生综合症。
2、需医治性输注血小板患者：特别是需屡次输注血小板患者，建议提前筛查血小板抗体，预防血小板输注无效。
3、妇产科孕检：评价孕期流产风险，尤其适用于有屡次流产史患者查因。
四、血小板抗体在临床病例中的验证
.。
血小板血型的检测
PTP的病因尚未明确，有数种假说。
抗体致敏形成的血小板抗原抗体复合物与自身 正常血小板结合导致血小板破坏 可溶性血小板吸附于正常血小板上，与血小板 抗体反应后导致血小板的破坏
血小板抗体与自身和外源性血小板交叉反应
HPA-1a是引起该病的主要抗原。我国绝大部分人 为HPA-1a抗原阳性。 实验室检查：血小板计数降低、骨髓巨核细胞增 生活跃、血清学检查血小板抗体存在但效价和病 情无关。
1. 2. 3.
血小板血型抗体
血小板抗体也可以分为两类
一类主要是针对人类组织相容性抗原(HLA)I类抗原 的抗体，即血小板相关抗体（PAIgG） 一类是针对GP抗原(血小板膜糖蛋白，携带HPA分子） 的血小板特异性抗体，称为PBIgG
两次或以上血小板输注无效且无明显非免疫因素导致
↓
检测患者血清中是否存在HLA抗体
血小板血型的检测
血小板血型检测
查
正确检测出血清中血小板抗体及其特异性对获得有 效的血小板输注是至管重要的。 目前的检测方法多种： 免疫荧光、ELISA、SPISA、 Micro-column gel、SEPSA等。
1、血小板黏附免疫荧光试验
本病输血小板无效，甚至有加重病情的危险，肾上腺皮质 激素不能缩短病程，但是，有可能改善出血症状。 主要治疗措施为血浆置换或换血，换血浆优于换全血。在 输血后血小板显著减少和发生严重出血症状时，应立刻做 血浆置换，一次交换65%～85%的血浆量，平均在1～5天后 出血症状减退，血小板数目上升。 尽可能避免或减少输注血小板及含血小板的血液制品。
大多数PTP为针对HPA—la的同种抗体所致2002 年英国报道了第2例表现为抗HPA一5a相关PTP。
血清学检测方法
血清学检测方法
血清学检测就像一把神奇的钥匙，能打开身体秘密的大门。
那血清学检测到底咋回事呢？其实步骤并不复杂。
先采集血液样本，就像从神秘宝藏中取出一块宝石。
然后对血液进行处理，分析其中的各种成分。
这过程可得小心，不然就像在走钢丝，一不留神就可能出错。
注意事项也不少呢！比如样本采集要规范，不然结果可能就不靠谱啦！这就好比做饭，材料不好，做出来的菜能好吃吗？检测环境也得干净整洁，不然各种杂质干扰，结果能准吗？
血清学检测安全不？那必须安全呀！只要操作规范，就跟走在平坦大路上一样，没啥风险。
稳定性也杠杠的，只要条件合适，结果就像定海神针，稳稳当当。
血清学检测的应用场景可多啦！可以用来诊断疾病，就像侦探在破案，找出身体里的“坏家伙”。
还能监测治疗效果，看看病情是不是在好转。
优势也很明显呀！快速出结果，不用等得花儿都谢了。
准确性也比较高，能给医生和患者一颗定心丸。
说说实际案例吧！有个人不舒服去医院，医生就给他做了血清学检
测。
结果很快出来了，找到了病因，对症下药，没多久就好啦！这效果，简直太赞了。
血清学检测就是这么牛，能帮我们了解身体状况，为健康保驾护航。
血清学诊断的用途
血清学诊断的用途
血清学诊断是通过检测和分析血清中的生物标志物来诊断和监测疾病的方法。
血清学诊断在医学领域具有广泛的应用，可以用于以下几个方面：
1.感染性疾病的诊断：血清学诊断可以用于检测血清中的抗
体或抗原来确定感染性疾病的存在。
例如，通过检测抗体可以确诊病毒感染（如HIV、乙肝、流感等）、细菌感染（如梅毒、结核病、肺炎等）和寄生虫感染（如疟疾、弓形虫病等）。
2.自身免疫疾病的诊断：自身免疫疾病是由免疫系统错误地
攻击自身组织引起的疾病。
血清学诊断可以通过检测特定的自身抗体，如抗核抗体、抗体核糖体等，来确定自身免疫疾病的存在，如系统性红斑狼疮、类风湿关节炎等。
3.肿瘤标记物检测：血清学诊断对于某些肿瘤的早期筛查和
监测也非常重要。
检测血清中的特定肿瘤标记物，如癌胚抗原（CEA）、前列腺特异抗原（PSA）等，可以用于肿瘤诊断、筛查和疾病进展的监测。
4.药物监测：血清学诊断可以用于监测药物治疗的效果和安
全性。
检测血清中的药物浓度可以帮助医生确定药物剂量是否适当，是否需要调整治疗方案。
常见的例子包括抗抑郁药物、抗癫痫药物等的监测。
5.过敏性疾病的诊断：血清学诊断可以通过检测血清中的特
定免疫球蛋白E（IgE）抗体来确定过敏性疾病的存在，如过敏性鼻炎、哮喘等。
血清学诊断是一种快速、敏感、特异的检测方法，可以在疾病的早期阶段进行诊断和治疗监测，帮助医生准确诊断疾病、制定治疗方案，并评估治疗效果。
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血小板抗原血清学的检验方法及临床意义
血小板血型抗原是一种通过同种免疫抗体检测而来的血小板表面抗原，一种为血小板特异性
抗原和血小板非特异性抗原。
血清学定型方法要求抗血清对待抗原要有活性。
目前，在许多
实验室中，抗体检测相关抗原的表型定型方法是较实用的血清学方法[1]。
使用整个血小板进
行实验比较易于操作。
但是，当HLA类抗原在血小板定型时出现强表达时，要用氯喹或酸进
行预处理，去除血小板上的HLA抗原。
此方法操作简易、方便、特异性和敏感性较强，下面
以简易致敏红细胞血小板血清学试验为例介绍血清学检测方法。
1.原理
SEPSA试验在U型孔微量反应板上进行，将血小板抗原固定在U型孔壁上，与被检血清反应
后洗净，以抗IgG(或抗IgM)细胞指示反应结果。
如果血小板上结合了抗血小板抗体，则致敏
在指示细胞上的抗IgG(抗IgM)与血小板抗体结合，指示细胞向孔底移动被阻滞，广泛覆盖在
固定的血小板单层上，为阳性结果[2]。
如果血小板上无抗体，则指示细胞向孔底移动不受阻，聚集在孔底中央，呈扣状，为阴性结果。
2.操作
2.1直接测定法：即测定血小板表面结合的血小板抗体。
受检者血小板固定于反应孔底。
各
孔加入25μl抗IgG致敏红细胞。
反应板置于湿盒内，室温静置3h以上或次日观察结果。
2.2间接测定法：即测定受检血清中的血小板抗体。
弃去受检者血小板孔内的生理盐水，各
孔加入pH7.2、0.05%吐温-PBS 25μl。
各孔加入受检血清25μl，并加入LISS(低离子溶液)、
pH6.7、25μl，置湿盒37℃孵育30min，再用pH7.2、0.05%吐温-PBS洗涤5次。
各孔加入
pH7.2、0.05%吐温-PBS，25μl及抗IgG指示细胞25μl，室温湿盒静置3 h以上或次日观察结果[3]。
2.3交叉配血试验：用以选择配合的血小板供体。
将所需筛选的献血者血小板分别再反应板
孔中固定后，把受检者血清25μl加入各孔中，并加入LISS(低离子溶液)，pH6.7、25μl,置湿盒37℃孵育30min，然后用pH7。
2、0.05%吐温-PBS洗涤5次，各孔加入pH 7.2、0.05%吐温-PBS，25μl及抗IgG指示细胞25μl，室温湿盒静置3 h以上或次日观察结果。
也可以反应1 h，2 000r/min离心10 min，观察结果。
选择反应阴性的血小板为献血者，给受者输注。
2.4质量控制：每份试验均作阴、阳性对照以进行质量控制，在间接测定法中，以正常人AB
血清为阴性对照，已知阴性血清为阳性对照；在直接测定法中，以正常人血小板为阴性对照，已知阳性血小板为阳性对照，被检血小板必须重复测定2个孔。
3.方法学评价与注意事项
SEPSA方法简易、快速、敏感、特异性强，应用范围广，特别在血小板交叉配合试验中是一
种较为有效的方法。
它不需要特殊的仪器设备，适合我国国情，正在全国各医院血库、临床
实验室推广应用。
检查前将被检血。
清4 000 r/min(2 800g)离心10 min，以去除沉淀。
被检标本不能使用血浆。
被检血清不需要灭能。
为了防止静电干扰，宜在室温湿润状态下操作。
4.临床意义
SABC(Strept Avidin-Biotin Complex)法是一种显示组织和细胞中抗原分布的简便而敏感的免疫
组化染色方法，是众多免疫组织化学方法的一种。
SABC是一种行之有效的检测血小板相关抗体的方法，SABC能同时检测泔血小板表面相关抗体或抗原和血清游离的相关抗体，方法简单，微量，快速，敏感性，特异性，重复性好，便于推广，为血小板硪少症提供了可靠的辅助诊
断指标。
SABC法实验只需取患者的血清，需分离血小板.且血清可在-20℃保存,方法快捷方便，因此SABC法实验重复性好。
阳性率较高且特异性强，可以检测出血中的多种抗体。
采取相
应的抗原阴性的供体血小板.即配合型输血等不同的处理措施。
可预防和减少血小板免疫性输血反应，避免反复输血患者引起同种免疫反应而导致血小板输注无效。
对病人的治疗和预后有重要的临床意义。
血小板具有一个十分复杂的免疫结构，血小板抗原抗体系统主要包括同种抗原抗体和自身抗原抗体，而这里所述的相关抗体还包括血中各类免疫球蛋白和血小板内含有的免疫球蛋白在血小板表面和血小板总免疫球蛋白量上的反映。
因此是一种血小板抗体的总体评价，也包含了机体其他因素引起的免疫反应对血小板的影响。
参考文献
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