DNAstar-editseq入门篇
常用分子生物学工具汇总【最新版】
常用分子生物学工具汇总书目资料库管理系统1、ReferenceManager v11.0【说明】ReferenceManager是一个专门设计来管理书目参考文献的资料库程序。
任何需要收集参考文献做研究之用或需要制作书目的人都可以使用Reference Manager更轻易地管理资料。
Reference Manager受到全球学术机构以及商业、研究机构的研究人员、图书馆员和学生广泛地使用。
【功能】a、快速地从草稿中准备格式化的内文引用文献和参考书目b、建立并维护部门的研究资料库c、追踪再版馆藏d、为研究人员或图书馆赞助者管理新知通报服务e、从不同的参考文献来源(如:联机、光碟、网际网络资料服务)收集参考文献f、为学生建立指定阅读清单g、建立教职员出版品清单h、编目特殊馆藏2、Endnote7.0【说明】Endnote由ThomsonCorporation下属的Thomson ResearchSoft开发，是SCI的官方软件，具备直接连接上千个数据库、边书写论文边插入参考文献、管理数十万条参考文献等的功能。
其所占系统资源容量小，基本不会发生因Endnote数据库过大而电脑死机的现象。
【功能】a、在线搜索文献:直接从网络搜索相关文献并导入到Endnote的文献库内b、建立文献库和图片库:收藏，管理和搜索个人文献和图片、表格c、定制文稿:直接在Word中格式化引文和图形，利用文稿模板直接书写合乎杂志社要求的文章。
d、引文编排:可以自动帮助我们编辑参考文献的格式序列获得和同源性比对1、NCBI-Genbank【说明】GenBank是美国国家生物技术信息中心(NCBI)建立的DNA序列数据库，从公共资源中获取序列数据，主要是科研人员直接提供或来源于大规模基因组测序计划( Benson等，1998)。
为保证数据尽可能的完全，GenBank 与EMBL(欧洲分子生物学实验室)、DDBJ建立了相互交换数据的合作关系。
基因工程研究常用软件简介
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vecto r 图
Redasoft Visual Cloning 2000 作 者：Redasoft
Vector NTI® Module Generate new recombinant moleculesion cloning with molecule construction and design capabilities Use VectorLink™ annotation-specific hyperlinks to the right Invitrogen reagents for cloning experiments Run BLAST searches of the NCBI or LabShare™ databases, view the results graphically, and download the hits with the click of a button Seamless BLAST searching of the Invitrogen Ultimate™ ORF clone collection to obtain the most completely characterized, sequence-verified forms of desired clones Support for Microsoft® Roaming User Profiles allows you to access to your own data from multiple computers on the network
Vector NTI® Module 1
荧光定量PCR实验使用方法
第一部分一、基本步骤：1、目的基因（DNA和mRNA）的查找和比对；2、引物、探针的设计；3、引物探针的合成；4、反应体系的配制；5、反应条件的设定；6、反应体系和条件的优化；7、荧光曲线和数据分析；8、标准品的制备；二、技术关键：1、目的基因（DNA和mRNA）的查找和比对；从/网点的genbank中下载所需要的序列。
下载的方式有两种：一为打开某个序列后，直接点击“save”，保存格式为“.txt”文件。
保存的名称中要包括序列的物种、序列的亚型、序列的注册号。
然后，再打开DNAstar软件中的Editseq软件，点击“file”菜单中的“import”，打开后点击“save”，保存为“.seq”文件。
另一种直接用DNAstar 软件中的Editseq软件，点击“file”菜单中的“open entrez sequence”，导入后保存为“.seq”文件，保存的名称中要包括序列的物种、序列的亚型、序列的注册号。
然后要对所有的序列进行排序。
用DNAstar软件中的Seqman软件，点击“sequence”菜单中的“add”，选择要比较的“.seq”的所有文件，点击“add”或“add all”，然后点击“Done”导入要比较的序列，再点击“assemble”进行比较。
横线的上列为一致性序列，所有红色的碱基是不同的序列，一致的序列用黑色碱基表示。
有时要设定比较序列的开始与结尾。
有时因为参数设置的原因，可能分为几组(contig)，若想全部放在一组中进行比较，就调整“project”菜单下的“parameter”，在“assembling”内的“minimum math percentage”默认设置为80，可调低即可。
再选择几个组，点击“contig”菜单下的“reassemble contig”即可。
选择高低的原则是在保证所分析的序列在一个“contig”内的前提下，尽量提高“minimum math percentage”的值。
系统发生树详解
系统发生树构建的步骤一般有下面几步:I,对文件10.8\protein sequence 的序列进行多序列比对,一般用clustalx/w软件完成.这里我们用软件BioEdit内置的clustalw来做多序列比对;II,对clustalw产生的多序列比对文件进行修剪,去掉比对后相似序列中没有对应的序列，前后全部对齐;III,将修剪后的多序列比对文件转换成系统发生软件所需的文件格式并保存.这里我们是采用mega来做系统发生树的,所以须将修剪后的多序列比对文件转成.meg的文件格式;IV,用系统发生软件构树(采用多种方法UPGMA,N-J, Maximum likelihood等);具体做法如下:①将protein sequence 的序列文件导入到BioEdit中做多序列比对,这里有好几种做法: a,将所有的序列文件全部保存在一个txt文件中,然后用BioEdit打开;(该方法比较麻烦) b,用DNASTAR中的Editseq工具将所有文件打开,然后用File菜单中Export all as one…按钮将所有的单蛋白质序列文件保存成一个多蛋白质序列文件,文件格式为.fastac,直接用BioEdit中File>new alignment>import>sequences alignment file(这里需要注意的是在导入序列文件时要将导入文件的类型选为All Files否则BioEdit将默认显示phy, gb, aln等文件而看不到其他文件);(推荐)导入后如图:alignment，如下图：比对后产生文件,其序列如下:③对clustalw产生的多序列比对文件进行修剪, 去掉比对后相似序列中没有对应的序列，前后全部对齐,可以直接用BioEdit的edit mode来做也可以用mega5>align>edit/buildalignment来做这里采用后者;format来导出文件,其文件内容如图:④用mega5建树.File>open a file打开已经转好的文件然后phylogeny下的不同方法UPGMA, N-J, Maximum likelihood得到各种树选择您感兴趣的基因，进行多物种的基因组搜索，将获得的序列进行基因序列特征分析，并构建多序列比对和系统发生树，请阐明选择基因的目的、试验步骤和进行结果分析。
玉米象的形态和分子特征鉴定
玉米象的形态和分子特征鉴定作者：邹茗惠许薇薛琪琪朱志伟李媛媛赵金红来源：《安徽农业科学》2021年第20期摘要 [目的]通过形态和分子特征鉴定玉米象。
[方法]从采集到的大米样本中分离出玉米象，分别在高速度数码显微系统和扫描电镜下观察其外部形态和细微形态并进行拍照鉴定。
同时提取DNA对cox1和ITS基因进行测序和分析。
[结果]玉米象的体躯由头、胸、腹3部分组成，胸部由3个胸节组成，有胸足3对，体表散布密集的刻点。
明显的鉴别特征有头部的额和颊延伸成象鼻状的喙，触角呈膝状弯曲，共见8个小节，口器位于细长喙的端部，上唇基本退化，代之为口上片，下颚须和下唇须退化而僵直，外咽片消失。
雄虫外生殖器隐藏于腹部，来源于第9腹节，阳茎背面扁平，有2条平行的纵凹沟，雌虫Y形骨片尖。
经克隆PCR扩增得到cox1、ITS基因片段大小分别为441、1 445 bp，与已报道的玉米象cox1基因同源性分别为99.7%～100%，ITS基因为99.0%～99.3%。
[结论]根据高速度数码显微系统和电镜下玉米象的形态特征，结合cox1和ITS基因序列分析，可为玉米象的鉴定和生物学分类提供依据，也可为防治玉米象对储粮的危害奠定基础。
关键词玉米象;外部形态;分子特征中图分类号 S 379.5 文献标识码 A文章编号 0517-6611（2021）20-0113-07doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2021.20.029開放科学（资源服务）标识码（OSID）：Morphology Observation and Molecular Characteristics of the Sitophilus zeamaisZOU Ming-hui，XU Wei，XUE Qi-qi et al （Department of Medical Parasitology，Wannan Medical College，Wuhu，Anhui 241002）Abstract [Objective]To identify Sitophilus zeamais according to morphology and molecular characteristics.[Method]Sitophilus zeamais were collected from the rice，then observed under an high speed digital microscope system and scanning electron microscope.PCR and walking sequencing were used to obtain cox1 and ITS sequences of the DNA samples extracted from Sitophiluszeamais.[Result]The body of Sitophilus zeamais was composed of three parts： head，chest and abdomen.The chest was composed of three thoracic ganglia，which had three pairs of feet.The distinguishing features were as follows： the forehead and cheek of the head extend into an elephant nose-like beak，the antennae bend knee-like，a total of 8 sections can be seen，the mouth organ is located at the end of the slender beak，the upper lip was basically degenerated，replaced by the upper lip，the mandibular and lower lip whiskers were degenerated and rigid，and the external pharynx slice disappears.The male genitalia was hidden in the abdomen and originates from the 9th abdominal ganglion.The dorsal surface of the male was flat with two parallel longitudinal grooves.The length of ITS and cox1 from the Sitophilus zeamais were 1 445 bp and 441 bp，pared with reported Sitophilus zeamais，the homology of cox1 and ITS gene were 99.7%-100% and 99.0%-99.3%，respectively.[Conclusion]The Sitophilus zeamais was identified according to the morphological characteristics under high speed digital microscope system and scanning electron microscope，and the molecular characteristics based on cox1 and ITS genes.It provides a basis for identification and biological classification of Sitophilus zeamais，and also lays a foundation for controlling the harm of Sitophilus zeamais to grain storage.Key words Sitophilus zeamais;Morphology observation;Molecular characteristics基金项目安徽省自然科学基金面上项目（1608085MC77）;安徽省高校优秀青年人才支持计划重点项目（gxyqZD2016171）。
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引物设计具体步骤
引物设计一、引物设计简介引物设计是以一小段单链DNA或RNA，作为DNA复制的起始点，在核酸合成反应时，作为每个多核苷酸链进行延伸的起点而起作用的多核苷酸链。
我们根据根据蛋白的基因序列及所选取的目的片段，设计引物。
二、引物设计的一般原则（一）抗原性：引物设计在完整的Domain区域或者抗原表位集中区域；（二）PCR产物长度：PCR产物长度不应过长，最佳长度为500bp左右。
；（三）长度：15-30bp，其有效长度[Ln＝2(G+C)+(A+T)]一般不大于38，否则PCR 的最适延伸温度会超过Taq酶的最佳作用温度(74℃)，从而降低产物的特异性；（四）GC含量：应在40％-60％之间，PCR扩增中的复性温度一般是较低Tm 值引物的Tm值减去5℃；（五）碱基分布的随机性：应避免连续出现4个以上的单一碱基。
尤其是不应在其3’端出现超过3个的连续G或C，否则会使引物在G+C富集序列区错误引发；（六）互补、错配、二级结构：引物自身不能含有自身互补序列，否则会形成发夹样二级结构。
两个引物之间不应有多于4个互补或同源碱基，不然会形成引物二聚体，尤应避免3’端的互补重叠；（七）引物的3’端很大程度上影响Taq酶的延伸效应，应尽量避免3’端发生错配。
而且尽可能地避免选用T，尤应避免连续出现2个以上的T；（八）特异性：与非特异扩增序列的同源性应小于70％，或少于连续8个的互补碱基。
三、常用软件DNAman5，Primer Preimer5，DNAStar/EditSeq、Snapgene四、信息检索常用数据库（一）uniprot（二）ncbi五、引物设计流程以蛋白Actin Beta的Met1-Phe375为例，说明引物设计具体流程：（一）根据蛋白名称或uniprot等信息，点开uniprot数据库；（二）在uniprot数据库中最左侧的菜单栏中，点击“sequence”，找到氨基酸序列；注：若此蛋白有多个isoform，一般以isoform1的序列为准设计引物（三）在“sequence databases”中找到这个蛋白对应的NM号；注：每一个isoform对应唯一一个NM号（四）点击NM号，进入NCBI数据库，找到对应的CD S序列，图中棕色部分即为此蛋白的碱基序列，根据研究需要，截取对应片段长度，如氨基酸片段为1-375，则碱基序列为1-1125；（五）打开Primer Preimer5引物设计软件，输入选取的碱基序列，点击“Primer”示anti-sense；再点击“Edit Primers”进行编辑；（七）当信息栏显示的发夹结构、二聚体、错配等信息为“None”时，初步认为此引物为最佳选择；（八）进入NCBI数据库，点击“BLAST”，选择“Primer-BLAST”，再次分析确认此引物是否为最佳引物。
半滑舌鳎Dorsalin-1-like基因的克隆与表达
6
3
333.3 ± 14.3
体质量/g mean body weight
1479.2 ± 280.8
170.3 ± 16.9
取样信息 sampling information
取样时间 sampling time 取样数量/ind sampling number
表 2 早期发育阶段半滑舌鳎样品信息 Tab. 2 Cynoglossus semilaevis samples in the early developmental stages
中国水产科学 2013 年 11 月, 20(6): 1123−1131 Journal of Fishery Sciences of China
DOI: 10.3724/SP.J.1118.2013.01123
研究论文
半滑舌鳎 Dorsalin-1-like 基因的克隆与表达
马骞, 庄志猛, 柳淑芳, 唐启升
样品 sample 雌鱼 female 雄鱼 male
表 1 半滑舌鳎成鱼样品信息 Tab. 1 Mature Cynoglossus semilaevis samples
数量/尾 numbers of individuals
年龄/a age
体长/mm body length
6
3
583.0 ± 61.3
最新研究表明, 骨骼的发育受到植物性神经系 统的控制, 即脊椎动物神经系统的发育与骨骼的发 育密切相关[7]。由此可见, BMP 家族成员作为多功 能的生长因子, 可能通过调节神经系统等多种组织 器官的发育进而调控骨骼的发育。其中, BMP 家族 中的 Dorsalin-1 在调控胚胎发育过程中神经系统的 发育中具有重要作用[8]。例如, Dorsalin-1 在鸡背神 经管中的表达能够在原肠胚期诱导神经嵴细胞的 形成[9−10]。然而, 有关 Dorsalin-1 参与调控骨骼发育 的研究鲜有报道。因此, 本研究选取 Dorsalin-1 基 因作为研究对象, 克隆半滑舌鳎 Dorsalin-1-like cDNA 序列、分析其组织表达分布特征, 并进一步 检测 Dorsalin-1-like mRNA 在早期发育阶段(卵期、 仔鱼期、稚鱼期和幼鱼期)的表达水平变化, 以期揭 示 Dorsalin-1-like 基因在调控半滑舌鳎早期神经系
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首先是editseq的一些简单介绍
EditSeq 是能够迅速、正确地输入，并且修改DNA 或蛋白质序列工具。每个EditSeq 文件
都可以分为三个可编辑的部分，上边的一部分为序列文件，中间的一部分里是评论，底部是
序列的注释。
EditSeq 能读取大部分的序列格式——包括FASTA，GenBank，ABI、GCG 和ASCII 格式。
你可以使用菜单命令或拖拽方式输入序列文件。另外， 序列也许通过使用键盘输入，或者
从其他地方复制、粘贴得到。经Entrez 或BLAST 检索得到的序列可以直接从因特网或企
业内部互联网服务器下载。序列被打开后，EditSeq 能使用标准或者指定的遗传密码进行翻
译，或者反翻译，寻找开放读框，还可以进行阅读校对。另外， EditSeq能以GenBank，FASTA
和GCG 格式输出序列。
首先从开始菜单打开主程序，选择DNAStar-editseq
然后进入主程序
点选File-open可打开所需分析序列
如想打开序列1，那么双击1.seq
进入序列，界面如下
首先对于此DNA序列，我们很可能想分析其ORF，那么点选search-find ORF
在弹出的对话框中点选find next后，黑体标明的即是其第一个ORF
也可继续点击Find Next 直到你把ORF 选定在所需位置，如继续点击find next后，得到第
二个ORF
得到例）即得到ORF之后肯 得到我们所需肯定想获得其需的蛋白序列其蛋白序列，列，是不是很点击Goodi方便 ies-translate DDNA（此处以以第一个OR RF为
除可方便查找ORF，利用search-find还可方便的对所需一段碱基进行定位，有时相当方便，
如需在序列中查找attca这几个碱基所在位置，可进行find命令
初次查找结果如图所示
还可对特定位置序列进行定位，利用search-go to position命令，与上方法雷同，此处不一一
赘述
除了search功能，另一个比较好用的功能是goodies菜单，除上述介绍的translate DNA功能
外，利用其reverse complement进行选定序列的反向互补转化，有时很有用
在一新窗口出现转化结果，如图所示（也有reverse功能，方法类似，不赘述）
Goodies-DNA statistics功能也很好玩，试试
统计利用对测计结果如图所用speech-Proo测序单中碱基所示
of-Read Seq基 ），单击quence可校正击后软件就开正测序单序列开始朗诵列中的错读（（老板经常性性提醒我去一 个个
对于序列的修改直接手工即可，文件输出保存就不用我说了吧，editseq就先介绍这么多，
接下来简单介绍下megalign的简单用法，只介绍一些简单用法，详见另一贴