Lactococcus lactis N8 fhuR基因的突变及其生物学功能的研究
嗜冷产甲烷菌及其在废水厌氧处理中的应用
表 #" 已命名的嗜冷产甲烷菌及其基本特征 $%&’ #" (%)*+ ,-./012,0343/ )*50%627*6- %6+ 50*31 &%-3/ /0%1%/5*13-53/分离时间 H&+$/,%I ,#-% 分离地点 H&+$/,%I !$/J% 外形特征 ! +!, ! -#. ! -/0 1+2!"+$+K#J （ 5 ）（ 5 ）（ 5 ） J"/2/J,%2 利用底物 生活 !B 范围 最适 !B 最适的 7/ P 生活的 7/ P +!,#-NL&/M$% !B 2/.K% 浓度 浓度 !B &NM&,/.J% O+2 7/ P J+.J%.,2/,#+. E!,#-N&NM&#&,%.J% 2/.K% O+2 7/ P &NM&#&,%.J% J+.J%.,2/,#+. （ --+$・Q > 3 ） （ --+$・Q > 3 ） 甲胺， 甲醇 AF ? ; )F ( ?F ? 366 ; 3666 ’66 ; 466
低， 在较高的温度下无法生存； 而兼性嗜冷微生物的 最适生长温度较高， 可耐受的温度范围较宽， 在中温 条件下仍可生长* 嗜冷微生物的量化分类指标一直存在着争议* 多数研究者参考最适生长温度 （ ! +!, ） 、 最低生长温 度 （ ! -#. ） 和最高生长温度 （ ! -/0 ） ( 个指标进行划分* 其中 1+2#,/
应 用 生 态 学 报! *##+ 年 ( 月! 第 "$ 卷! 第 ( 期! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! Y@357=7 2BMA54D BL .CCD37J S?BDBG>，Z7C& *##+ ， 56 （(） ： *"*+’*")*
乳酸菌生理功能的系统解析与代谢调控
吴重德等： 乳酸菌生理功能的系统解析与代谢调控 ． / 微生物学报（ 2012 死 亡，从 而 降 低 食 品 微 生 物 制 造的效率。因此，基 于 乳 酸 菌 为 主 体 的 食 品 微 生 物 制造过程中，需要： （ 1） 对乳酸菌的代谢能力进行重 构与优化； （ 2 ） 从 鲁 棒 性 （ Robustness） 和 对 营 养 环 境条件的适应性（ Fitness） 两方面调控和优化乳酸菌 的 生 产 性 能 ，以 实 现 目 标 代 谢 产 物 的 产 量 、产 率 和 生 产强度的提高。
1 基于基因组工程技术的乳酸菌生理 功能解析
以基因组序列 为 基 础 的 系 统 生 物 学 的 发 展，为 从 基 因 表 达 、蛋 白 质 组 的 时 序 变 化 、代 谢 物 含 量 及 代 谢流量比率等方面 全 局、深 度 解 析 工 业 微 生 物 在 合 成目标代谢产物 的 过 程 中，发 生 在 基 因、酶、生 化 反 应、代谢网络等层次 上 的 时 序 变 化 提 供 了 强 有 力 的 工 具 ，从 而 为 代 谢 途 径 的 重 构 与 优 化 、生 产 性 能 的 调 控 与 优 化 奠 定 了 坚 实 的 基 础［7］ 。 1. 1 乳酸菌全基因组测序研究进展及其在乳酸菌 生理功能解析中的应用
作为 食 品 微 生 物 制 造 的 主 体，乳 酸 菌 用 于 食 品 制造中首先要求细 胞 能 够 定 向、高 效 地 生 产 目 标 代 谢 产物，因此必须干扰或改变微生物原有的 调 控 体
表 1 乳酸菌在食品工业中的应用
Table 1 Applications of lactic acid bacteria
乳酸菌生理功能的系统解析与代谢调控
吴重德1，2 ，张娟1，2* ，刘立明1，2*
nisZ启动子结构与功能的研究
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含有 !"# + 启动子和 $%# , 结构基因的重组质粒 -.&/* 的构建 为了最大程度的保持 /"K 结构基因和 )%+ Z 启动子
的完整性， 我们采用 )%+ Z 启动子与 /"K 结构基因的翻译 融合。该 融 合 使 /"K 的 第 一 个 氨 基 酸 由 ?8E 改 变 为 同时使 )%+ Z 启动子的最后两个碱基由 00 变为 ##， [P4， ［$$］ 但这些改变不会影响 /"K 的活性 和 )%+ Z 启动子诱导
乳酸菌合成叶酸的研究进展
微生物学通报Oct. 20, 2015, 42(10): 1994−2001 Microbiology China© 2015 by Institute of Microbiology, CAS tongbao@DOI: 10.13344/j.microbiol.china.150001基金项目：国家自然科学基金项目(No. 31160309)*通讯作者：Tel ：86-871-65920759；：newstaar8@收稿日期：2015-01-01；接受日期：2015-04-27；优先数字出版日期()：2015-05-08专论与综述乳酸菌合成叶酸的研究进展何树芬 李晓然 柳陈坚*(昆明理工大学 生命科学与技术学院 云南 昆明 650500)摘 要：叶酸普遍存在于各类食物中，但由于叶酸的不稳定性以及饮食习惯的差异性，各国叶酸缺乏现象普遍存在。
叶酸是参与核酸合成及细胞分裂分化的重要物质，叶酸缺乏引起机体功能的混乱，由此引发癌症等一系列的疾病。
大部分乳酸菌是叶酸缺陷型菌株，但越来越多的研究表明其很多种类都具有叶酸合成能力。
本文主要概述产叶酸乳酸菌的分类，乳酸菌生物合成叶酸的机制，以及利用乳酸菌进行的叶酸基因工程研究进展。
关键词：乳酸菌，自然叶酸，合成叶酸，生物合成，植物乳杆菌Research progress of the folate synthesized by lacticacid bacteriaHE Shu-Fen LI Xiao-Ran LIU Chen-Jian *(College of Life Science and Technology , Kunming University of Science and Technology , Kunming , Yunnan 650500, China )Abstract: Folate are presented in all kinds of foods, but folate deficiency in human body still exist inevery country due to the difference of dietary habit and unstability of folate. Folate are the important material that participate in synthesis of nucleic acid and the cell division and differentiation. Folate deficiency lead to the disorders of body functions, thus lead to a serise disease such as cancer. Even though most lactic acid bacteria (LAB) are folate-defective strains, more and more studies indicated that a lot of strains among LAB have the capability to synthesize folate. This review summarized the progress on species of LAB with the capacity of synthesizing folate, their folate synthesis mechanism, and folate gene engineering carried by LAB.Keywords: Lactic acid bacteria, Folate, Folic acid, Biosynthesis, Lactobacillus plantarum 叶酸是一种由嘌呤、对氨基苯甲酸及多聚谷氨酸尾等3部分组成(图1)的水溶性B 族维生素，分布广泛，普遍存在于动植物和传统发酵食品中，但不稳定，在酸性环境及光照条件下易分解[1]。
ptsH基因过表达对乳酸乳球菌N8自身免疫耐受性及其生理代谢的影响
ptsH基因过表达对乳酸乳球菌N8自身免疫耐受性及其生理代谢的影响刘冠楠;轩辕铮铮;徐海津;白艳玲;张秀明;乔明强【期刊名称】《生物技术通讯》【年(卷),期】2016(027)005【摘要】目的:通过基因工程方法提高HPr蛋白编码基因ptsH在乳链菌肽(nisin)高产野生乳酸乳球菌株N8中的表达,揭示ptsH基因与乳酸乳球菌乳链菌肽耐受性等相关生物学功能的关系.方法:构建ptsH过表达质粒pLEV 16-ptsH并转化至N8,使其ptsH基因过量表达,进而对比分析ptsH过表达菌株与野生菌株在生长曲线、乳链菌肽耐受性、效价、Biolog等方面的差异.结果:N8-ptsH过表达菌株与N8菌株在菌落形态、大小、表面湿滑程度及生长曲线等方面没有明显差异;ptsH基因过表达使N8菌株的乳链菌肽耐受性提高了8.3％,2个乳链菌肽耐受性相关基因nisⅠ和nisF的表达量分别提高了15.45倍和近45倍;ptsH基因过表达略微减缓了N8菌株中乳链菌肽的产生,但乳链菌肽的最终产量略有提高;ptsH基因过表达菌株中PTS系统糖苷和磷酸化糖类的利用率比原始菌株显著提高.结论:ptsH基因主要与乳酸乳球菌的乳链菌肽耐受性有关.【总页数】6页(P601-606)【作者】刘冠楠;轩辕铮铮;徐海津;白艳玲;张秀明;乔明强【作者单位】南开大学分子微生物学与技术教育部重点实验室,天津300071;南开大学分子微生物学与技术教育部重点实验室,天津300071;南开大学分子微生物学与技术教育部重点实验室,天津300071;南开大学分子微生物学与技术教育部重点实验室,天津300071;南开大学分子微生物学与技术教育部重点实验室,天津300071;南开大学分子微生物学与技术教育部重点实验室,天津300071【正文语种】中文【中图分类】Q935【相关文献】1.生物膜形成对植物乳杆菌PG3-1耐受性及功能基因表达的影响 [J], 张国丽;杨陈文;余茜;陈安均;刘书亮;敖晓琳2.表达外源谷氨酸脱羧酶基因对重组乳酸乳球菌胁迫抗性的影响 [J], 陈琪;张亚敏;赵颖;梅林;傅瑞燕3.自身免疫性肝炎小鼠模型差异表达基因的筛查及柴胡皂苷D对部分差异表达基因表达的影响 [J], 陈浩; 郝健亨; 李振城; 徐慧超; 高艳; 苗宇船; 郝慧琴; 刘杨4.抑制TRAF6基因表达对自身免疫性肝炎大鼠肝组织NF-κB信号通路相关蛋白表达的影响 [J], 刘娜;张华敏;邓巧娟5.MSN4基因的过表达对酿酒酵母耐受性的影响研究 [J], 董胜胜;李潇;王鹏飞;付肖蒙;肖冬光;董健因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
天津科技大学微生物学历年期末真题整理
一、名词解释1. 芽孢：某些细菌在其生长发育后期，可在细胞内形成一个圆形、椭圆形或圆柱形的折光性很强的抗逆性休眠体，称为芽孢。
2. 烈性噬菌体：感染宿主细胞后，能引起宿主迅速裂解的噬菌体。
（或：在短时间内能连续完成吸附、侵入、增殖、成熟（装配）和裂解5个阶段而实现其繁殖的噬菌体。
）3. 化能异养型：能源和碳源都来自有机物的营养类型。
4. 巴氏消毒法：专用于牛奶、啤酒、酱油等不宜进行高温灭菌的液态风味食品或调料的低温消毒方法，此法可杀灭物料中无芽孢病原菌，又不影响其风味。
具体方法可分为：低温维持法（63℃，30分）和高温瞬时法（72℃，15秒）。
5. 呼吸：又称好氧呼吸，是一种最普遍的生物氧化方式。
即指底物按常规方式脱氢后，脱下的氢经完整的呼吸链（又称电子传递链）传递，最终被外源分子氧接受，产生水并释放出ATP形式的能量，是一种高效产能方式。
6. 营养缺陷型：某一野生型菌株因发生基因突变而丧失合成一种或几种生长因子、碱基或氨基酸的能力，因而无法在基本培养基上正常生长繁殖的变异类型，称为营养缺陷性。
7. Hfr菌株：即高频重组菌株。
在该菌株细胞中，F因子整合在核染色体组的特定位点，Hfr菌株与F–菌株接合后，发生基因重组的频率要比F+与F–接合后的频率高出数百倍。
8. 点突变：又称基因突变，是指一个基因内部遗传结构或DNA序列的任何改变，仅涉及一对或少数几对碱基的置换、缺失或插入，因其发生的范围很小，所以又称点突变。
9. 质粒：指一种独立于染色体之外的、能进行自主复制的双链闭合环状的DNA分子。
也有极少的质粒是线性的DNA分子。
10. 半抗原：只具有反应原性而缺乏免疫原性的抗原。
11. 发酵：指有机物氧化释放的氢（电子）最终传递给某种中间代谢产物，同时释放能量并产生各种不同的代谢产物的过程。
12. 抗代谢物：一类在化学结构上与微生物所必需的代谢物（即生长因子）很相似，可干扰微生物正常代谢活动的化学物质。
多形汉逊酵母研究进展_熊向华
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汉逊酵母的甲醇代谢 多形汉逊酵母属于甲醇营养 型 酵 母 ， 能 在 以 甲 醇 为 惟 一 碳
、 源和能源的培养基上生长。这类酵母还包括假丝酵母 （2’(@&’） 汉逊酵母 （3’(76(,8’） 、 毕赤酵母 （=&>+&’） 和球拟酵母 （A9;,8957&7 ） （D85=B39> 9M6CB48 ， 等 U)V。多形汉逊酵母只有 ! 个编码甲醇氧化酶 的基因， 其启动子是强诱导型启动子。与其他醇 氧 化 酶 不 EZa） 同的是， 该启动子对葡萄糖或甘油的阻 遏 不 敏 感 ， 在葡萄糖或甘 油限制或缺乏的条件下， 能够被甲醇诱导 U’V。 甲醇代谢途径需要甲醇氧化酶、 甲醛脱氢酶 （:9FDB58 C8=@N 、 过氧化氢酶 （<B5B>B48 ， 和二羟丙酮合成酶 CF9?83B48 ， \E^ ） I1Y） 等几种特殊的酶参与 （图 ! ） 。 （C6=@CF9M@B<85938 4@35=B48 ， ^S1G ） 这几种酶都贮存在过氧化物酶体 （L8F9M649D8 ） 中， 这样细胞可以 避免受到甲醇代谢产物如甲醛和过氧化氢的伤害。 EZa 是其中 最重要的酶， 催化甲醇氧化生成甲醛和 过 氧 化 氢 ， 其调控发生在 转 录 水 平 U*V； 而 I1Y 催 化 过 氧 化 氢 生 成 水 和 氧 分 子 ， 在去除过氧
霉目 W 酵母科 W 汉逊酵母属， 为单细胞低等真核生物。多形汉逊酵 母的营养体以单倍体形式存在，有 ’ 条染色体，大小为 "-#X%-% （I;G+*.% ， 即 1YII.++.0 ） 的基因组大小为 EK 。 多 形 汉 逊 酵 母
小檗碱对禽源大肠杆菌抑菌作用及耐药消除作用的转录组学分析
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小檗碱对禽源大肠杆菌抑菌作用及 耐药消除作用的转录组学分析
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氧氟沙星相对于大肠杆菌的 <:J 的变化&
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收 稿 日 期 0&%(!%%!%/ 基 金 项 目 国 家 自 然 科 学 基 金 "*%1/01(&#(河 北 省 重 点 研 发 计 划 项 目 "%(000/&%a# 作者简介张石磊"%AA0!#!男!河北邢台人!硕士生C!o研p究yr方igh向t©$畜博禽看疫网病. A发ll生R机igh制ts与R防es控er!vLe!d4.M$E$%H**%&A*00&"%(*',#4 # 通 信 作 者 张 ! 铁 "%A/)!#!男 !教 授 !硕 士 生 导 师 !研 究 方 向 $畜 禽 疫 病 发 生 机 制 与 防 控 !L!4M$E$Y7M-89$3%AAH"%(*',#4
最新 丝状真菌常见的筛选标记方法综述-精品
丝状真菌常见的筛选标记方法综述摘要：随着基因组时代的发展，主要丝状真菌基因组测序基本完成而被广泛应用于工业，农业，等领域。
然而丝状真菌的遗传转化效率极低，为了保证在大量非转化子背景下能筛选到目标转化子，恰当的筛选标记显得尤为重要。
目前，在丝状真菌的遗传转化过程中常用的筛选标记可分为两类:药物抗性筛选标记和营养缺陷型筛选标记。
但两者均具有一定的局限性，为此科研人员利用最新研究的基因组编辑技术对筛选标记加以修饰改造，以更好地用于遗传筛选。
本文综述了目前常用的遗传筛选系统的分子机制及运用基因组编辑技术改造的新型筛选标记理论，为丝状真菌在各领域更广泛的应用奠定基础。
关键词：丝状真菌; 筛选标记; 营养筛选; 抗性筛选; 基因组编辑 ;Abstract：With the booming of the genome era, the whole genome sequencing of important filamentous fungi has been basically completed and is widely used in the fields of industry, agriculture and medicine. However, the genetic transformation efficiency of filamentous fungi is extremely low. In order to ensure that positive transformants can be picked out from a large number of non-transformed colonies. Therefore appropriate selectable markers are particularly important. At present, the commonly used selectable markers in the genetic transformation of filamentous fungi can be divided into two categories: drug-resistance selectable markers and auxotrophic selectable markers. However, both of them have distinct limitations. For this reason, researchers use the latest genome editing technology to modify the selectable markers for better genetic selection. This article reviews the current genetic selection system and new screening marker theory modified by genome editing technology, which lays a foundation for a broader application prospect of filamentous fungi in various fields.Keyword：Filamentous fungi; Selectable marker; Auxotrophic selection; Drug-resistant selection; Genomic editing;丝状真菌(Filamentous fungi)是一类重要的真核微生物，广泛存在于自然界中，并在工业、农业和医药等领域发挥着重要作用。
重组NADH氧化酶对乳酸脱氢酶乳酸氧化活性的影响
重组NADH氧化酶对乳酸脱氢酶乳酸氧化活性的影响赵蕊;霍贵成【摘要】[目的]考察当存在其他利用NADH途径时,发酵型乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase,LDH)催化乳酸氧化能力的改变.[方法]PCR扩增乳酸乳球菌(Lactococcus lactis,ctis)中生成H2O的NADH氧化酶基因noxE,将其连接至表达载体并在大肠杆菌中过量表达；对亲和纯化的产物进行SDS-PAGE分析、光谱扫描和活性测定,考察纯化产物是否具有生物学活性；以2,4-二硝基苯肼法测定乳酸脱氢酶的乳酸氧化活性,考察添加NoxE重组蛋白对其活性的影响.[结果]重组NoxE蛋白是种黄素蛋白,具明显的生物学活性,说明noxE表达载体构建成功；添加NoxE后,LDH的乳酸氧化活性提高了3.84倍.[结论]在NADH经呼吸链代谢掉的生理条件下,LDH催化乳酸氧化的能力会明显提高.%[ Objective] To compare the lactate oxidation activity of lactate dehydrogenase (LDH) in the presence and absence of another NADH utilization pathway. [Method] The H2O-producing NADH oxidase gene (noxE) was cloned by PCR from Lactococcws lactis genome, ligated into the expression vector and expressed in E. coli. After affinity purification, the recombinant protein was analyzed by SDS-PAGE, UV-vis absorption spectrum and determination of enzyme activity. 2,4-Dinitrophenylhydrazine was used to evaluate the effect of NoxE addition on the lactate oxidation activity of LDH. [Result]NoxE was purified as a flavin protein with significant activity. When NoxE was added, the lactate oxidation activity of LDH was increased 3.84-fold. [ Conclusion]The lactate oxidation capacity of LDH will be significantlyincreased under physical conditions where NADH can be consumed via respiration chain.【期刊名称】《安徽农业科学》【年(卷),期】2013(041)005【总页数】3页(P1918-1919,1927)【关键词】乳酸菌;乳酸脱氢酶;NADH氧化酶【作者】赵蕊;霍贵成【作者单位】东北农业大学,乳品科学教育部重点实验室,黑龙江哈尔滨150030【正文语种】中文【中图分类】S188作为一种重要的工业微生物，L．lactis被广泛用于多种干酪、酪乳、酸奶油等乳制品的生产中，同时作为一种模式微生物，其乳酸代谢及调控长期以来也受到了广泛关注。
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第４１卷第５期 南开大学学报（自然科学版） ２００８年１ Ｏ月 Ａｃｔａ Ｓｃｉｅｎｔｉａｒｕｍ Ｎａｔｕｒａｌｉｕｍ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔａｔｉｓ Ｎａｎｋａｉｅｎｓｉｓ Ｖｏ１．４１ Ｎ＿Ｏ５
Ｏｃｔ．２００８
文章编号：０４６５—７９４２（２００８）０５—００３２—０５ Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓ Ｎ８ ｆｈｕＲ基因的突变
及其生物学功能的研究
吴震州， 姜德洲， 徐海津， 张秀明， 白艳玲， 乔明强 （南开大学生命科学学院，天津３０００７１） 摘要：利用人工Ｍｕ转座技术获得Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕ￥ｌａｃｔｉｓ Ｎ８菌株的ｆｈｕＲ基因插人突变株（Ｌ．１ａｃｔｉｓ Ｎ８： △ｆｈｕＲ）．对突变株和野生株进行了ｎｉｓｉｎ产量生物测定，ｎｉｓｉｎ荧光定量检测以及ｎｉｓｉｎ耐受性检测．结果表明 突变株的生长情况、ｎｉｓｉｎ总体产量、单个细胞ｎｉｓｉｎ表达量以及菌体对ｎｉｓｉｎ耐受性相对于野生株都明显降低． 在培养基中补加甲硫氨酸和半胱氨酸可使该突变株的生长状态、ｎｉｓｉｎ总体产量及菌体对ｎｉｓｉｎ的耐受性水平得 到不同程度的回复．乳酸菌Ｂｉｏｌｏｇ和生化鉴定的结果显示突变株在一些营养物质的利用上与野生株存在着重 大差异．这些结果表明ｆｈｕＲ基因在ｎｉｓｉｎ生物合成过程中具有重要作用．
关键词：乳酸乳球菌； “Ｒ；ｎｉｓｉｎ 中图分类号：Ｑ９３６ 文献标识码：Ａ
０ 引 言 乳链菌肽（ｎｉｓｉｎ）是乳酸乳球菌乳酸亚种（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓ ｓｕｂｓｐ．１ａｃｔｉｓ）某些菌株产生的一种由３４ 个氨基酸组成的小肽，分子式是Ｃ Ｈ 。。Ｎ Ｏ。 Ｓ ，平均分子量３ ５１０ Ｄａ．其活性体为二聚体或四聚体．单 体分子含有５种稀有氨基酸，分别是ＡＢＡ（氨基丁酸）、ＤＨＡ（脱氢丙氨酸）、ＤＨＢ（甲基脱氢丙氨酸）、 ＡＬＡ—Ｓ—ＡＬＡ（羊毛硫氨酸）、ＡＬＡ～Ｓ—ＡＢＡ（￣一甲基羊毛硫氨酸），由硫醚键形成５个环ｕｊ． 乳酸乳球菌中控制ｎｉｓｉｎ生物合成与调控的基因共有ｌ１个：ｎｉｓＡ／ＺＢＴＣＩＰＲＫＦＥＧ，由３个启动子 Ｐ ｓＡ／ｚ、ＰｎｉｓＲ和ＰｎｉｓＦ控制其转录 ］．其中参与菌体ｎｉｓｉｎ免疫耐受性机制的有ｎｉｓＩＦＥＧ．处于外膜 的脂蛋白ＮｉｓＩ可以螯合ｎｉｓｉｎ，阻止其插入膜中，还可阻碍高浓度的ｎｉｓｉｎ在膜表面聚集以形成穿膜的孔 洞ｌｌ４ ］．ＮｉｓＦ、ＮｉｓＥ和ＮｉｓＧ构成一个ＡＢＣ转运复合体，可以将进入质膜的ｎｉｓｉｎ分子重新转运到胞外． 此外，Ｋｒａｍｅｒ等人证明，与精氨酸降解相关的ａｒｃ操纵子、与砷耐受性相关的ｙｎｅ操纵子、与杆菌肽抗性 相关的ｙｓａ操纵子以及胞壁酸合成相关的ｄｌｔ和ｇａｌ操纵子等＿７ 都与ｎｉｓｉｎ免疫耐受性有关。 Ｍｕ转座突变技术作为一种有效的基因突变手段已成功的应用于铜绿假单胞菌、芽孢杆菌的基因研 究中【８ ．本文中的ｆｈｕＲ插入突变株Ｌ．１ａｃｔｉｓ Ｎ８：ＡｆｈｕＲ正是通过这种技术获得．对 ．１ａｃｔｉｓ Ｎ８： ￣ｆｈｕＲ进行的一系列生物学测定揭示了ｆｈｕＲ基因突变对ｎｉｓｉｎ活性及乳球菌生理代谢的影响．对研究 ｎｉｓｉｎ基因工程菌的生物学特性具有重要意义．
１材料与方法 １．１材料 ＮｉｓＺ生产菌Ｌ．１ａｃｔｉｓ Ｎ８，ｎｉｓｉｎ抑菌实验指示菌Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ ｌｕｔｅｕｓ Ａ１ ＮＣＩＭＢ８６１６６和Ｅ．ｃｏｌｉ ＤＨ５ａ为本实验室保存，菌株ＬＡＣ２７５（用于ｎｉｓｉｎ荧光检测）为赫尔辛基大学Ｐｅｒ博士实验室所有．培养 基为ＳＧＭ１７（Ｏ．５ 葡萄糖，０．５ 蔗糖，３７．２５ ｇ・Ｌ＿。Ｍ１７ ｂｒｏｔｈ）．ＭＩ７ ｂｒｏｔｈ购自Ｏｘｏｉｄ公司．Ｎｉｓｉｎ 标准样品购于Ｓｉｇｍａ公司．吐温一２０购于北京化学试剂公司．吐温一８Ｏ购于北京鼎国生物技术有限责任公 司，甲硫氨酸和半胱氨酸购于上海生工生物技术服务有限公司．Ｂｉｏｌｏｇ鉴定板ＧＰ２ ＭｉｃｒｏＰｌａｔｅ Ｍ购于美 国Ｂｉｏｌｏｇ公司．乳酸菌生化鉴定管购于青岛海博生物技术有限公司．红霉素购于上海生工生物技术服务
收稿日期：２００８—０７一Ｉ４ 基金项目：新世纪优秀人才支持计划（ＮｃＥＴ一０６一ｏ２１２）；科技部基础平台项目（２０Ｏ５ＤＫＡ２１２Ｏ８—２） 作者简介：吴震州（１９８Ｏ一），男，安徽铜陵人，博士研究生． 第５期 吴震州等：ｆａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃ￣ｓ Ｎ８ ｕＲ基因的突变及其生物学功能的研究 ・３３・ 有限公司，乳酸菌中工作浓度为５ ｇ・ｍＬ＿。． １．２ Ｌ．１ａｃｔｉｓ Ｎ８ Ｍｕ转座突变文库的建立 取１ Ｌ红霉素Ｍｕ转座复合物，用无菌去离子水稀释５倍，取１ Ｌ进行Ｌ．１ａｃｔｉｓ Ｎ８的电转化，筛选 红霉素抗性转化子，用红霉素Ｍｕ转座子ＤＮＡ特异引物ｅｒｙＭｕｌ，５＇－ＧＧＧＡＴＴＣＧＴＣＡＴＧＴＴＧＧＴ一３ ； ｅｒｙＭｕ２，５ ～ＧＴＧＧＴＡＴＧＧｃＧＧＧＴＡＡＧＴ一３ 对转化子进行ＰＣＲ检测． １．３ ｎｉｓｉｎ产量的生物测定 Ｎｉｓｉｎ活性的生物测定过程参照文献［１３］． １．４ Ｌ．１ａｃｔｉｓ Ｎ８：ＡｆｈｕＲ插入基因的克隆 Ｌ．［ａｃｔｉｓ Ｎ８：△ ｕＲ的基因组用ＦｖｕｌＩ酶切，与Ｓｉｎａｉ酶切的ｐＵＣ１８连接，转化Ｅ．ｃｏＨ ＤＨ５ａ，将筛 选到红霉素转化子用Ｍｕ转座子ＤＮＡ两端的测序引物Ｅｒｙｓｅｑｌ，５１＿ＴＴＣＣＡＡＧＡＡＧＣＴＡＡＡＧＡＧ一３ ； Ｅｒｙｓｅｑ２，５ 一ＧＧＣＡＴＧｃＡＴＣＧＡＴＡＧＡＴＣ一３ 对转座子ＤＮＡ两端的序列进行测序，结果在ＧｅｎｅＢａｎｋ中 进行比对． １．５ ｎｉｓｉｎ的荧光定量检测 荧光定量检测参照文献［１４］． １．６ Ｎｉｓｉｎ耐受性检测 配制含有一系列浓度ｎｉｓｉｎ的ＳＧＭ１７，按１％比例将３０℃静置过夜培养的乳球菌菌液接种到这些 ＳＧＭ１７中，注入无菌９６孔板中，密封３ｏ℃静置培养２４ ｈ后观察． １．７氨基酸补偿实验 将Ｌ．１ａｃｉｓ Ｎ８的ｆｈｕＲ突变株在含有１０ ｍｇ・Ｌ 甲硫氨酸、５０ ｍｇ・Ｌ－１半胱氨酸的ＳＧＭ１７液体培 养基中培养，测量其生长曲线，并进行１．３和１．６的检测． １．８ Ｂｉｏｌｏｇ鉴定 Ｂｉｏｌｏｇ鉴定方法参照ＧＰ２ ＭｉｃｒｏＰｌａｔｅＴＭ使用说明． １．９乳酸茵生化鉴定 鉴定方法参照乳酸菌生化鉴定管使用说明．
２ 结 果 ２．１ Ｌ．１ａｃｔｉｓ Ｎ８中的ｆｈｕＲ基因序列 通过对Ｌ．１ａｃｔｉｓ Ｎ８：ＡｆｈｕＲ Ｍｕ转座子ＤＮＡ侧翼序列进行测序，得到Ｌ．１ａｃｔｉｓ Ｎ８中的ｆｈｕＲ基因 编码区序列．该序列共９０６ ｂｐ，与Ｌ．１ａｃｔｉｓ ＩＬ１４０３相似性达９９ ． ２．２ Ｌ．１ａｃｔｉｓ Ｎ８：△ｆｈｕＲ和Ｌ．１ａｃｔｉｓ Ｎ８ 生长曲线的比较 ・ 在液体ＳＧＭ１７中添加１０ ｍｇ・Ｌ一。甲硫 ２ 氨酸、５Ｏ ｍｇ’Ｌ 半胱氨酸，与不添加氨基８ １．５
酸的ＳＧＭ１７同时培养Ｌ．１ａｃｔｉｓ Ｎ８：△ｆｈｕＲ 和Ｌ． ｃ Ｎ８（［Ｎ １）．从图中可以看出，Ｌ．ｕ
ｌａｃｔｉｓ Ｎ８：△ｆｈｕＲ在不添加甲硫氨酸和半胱 氨酸的ＳＧＭ１７中，生长受到了抑制，对数期 明显延长．而在ＳＧＭ１７中补加了这两种氨 基酸之后，生长状态恢复到了与野生型Ｌ ｌａｃｔｉｓ Ｎ８相近的水平． ２．３ ｎｉｓｉｎ产量的生物测定 图２显示了Ｌ．１ａｃｔｉｓ Ｎ８：△ｆｈｕＲ和Ｌ＿ ｌａｃｔｉｓ Ｎ８在ＳＧＭ１７和添加甲硫氨酸、半胱
Ｏ．５ Ｏ ｏ ２ ４ ６ ８ ｌＯ １２ １４ １６ １８ ２０ ２２ ２４ ２６ ２８ ３０ ３２ ３４ ３６ ３８
时间／ｂ
◆：Ｌ．１ａｃｔｉｓ Ｎ８；一：Ｌ．１ａｃｔｉｓ Ｎ８＋Ｍｅｔ＋Ｃｙｓ； ▲：Ｌｌａｃｔｉｓ Ｎ８：△知ｕＲ；●：Ｌ．１ａｃｔｉｓ Ｎ８：△ Ｒ＋Ｍｅｔ＋Ｃｙ 图１ Ｌ．１ａｃｔｉｓ Ｎ８：△ＳｈｕＲ ａｎｄ Ｌ．１ａｃｔｉｓ Ｎ８的生长曲线 Ｆｉｇ．１ Ｇｒｏｗｔｈ ｃｕｒｖｅ ｏｆ Ｌ．１ａｃｔｉｓ Ｎ８：ＡｆｈｕＲ和Ｌ．ａｃｔｉｓ Ｎ８ ・３４・ 南开大学学报（自然科学版） 第４１卷 氨酸的ＳＧＭ１７中进行培养后ｎｉｓｉｎ产量的差别．由图２可看出，Ｌ．１ａｃｔｉｓ Ｎ８：ＡｆｈｕＲ在不添加甲硫氨酸、 半胱氨酸时，ｎｉｓｉｎ产量与野生型Ｌ ｌａｃｔｉｓ Ｎ８有着很大差距，但添加了这两种氨基酸之后，ｎｉｓｉｎ产量恢复 到了与野生型相同的水平．同时，氨基酸的添加对Ｎ８的ｎｉｓｉｎ产量却几乎没有影响．
１：Ｌ．１ａｃｔｉｓ Ｎ８；２：Ｌ．１ａｃｔｉｓ Ｎ８＋Ｍｅｔ＋Ｃｙｓ； ３：Ｌ．１ａｃｔｉｓ Ｎ８：Ａ ｌ， “Ｒ＋Ｍｅｔ＋Ｃｙｓ； ４： 。ｌａｃｔｉｓＮ８ Ａ血 Ｒ 图２ Ｌ．１ａｃｔｉｓ Ｎ８：△ｆｈｕＲ和Ｌ．１ａｃｔｉｓ Ｎ８ ｎｉｓｉｎ产量 的生物测定 Ｆｉｇ。２ Ｎｉｓｉｎ ｂｉｏａｓｓａｙ ｏｆ Ｌ．１ａｃｔｉｓ Ｎ８：△ｆｈｕＲ ａｎｄ Ｌ．１ａｃｔ Ｎ８
量 蒌 ．警 翼
Ｒ 一０．９９３ 图３ Ｎｉｓｉｎ标准曲线 Ｆｉｇ．３ Ｎｉｓｉｎ ｓｔａｎｄａｒｄ ｃｕｒｖｅ
２．４ ｎｉｓｉｎ的荧光定量检测 荧光定量检测是目前国际上ｎｉｓｉｎ定量检测中最为灵敏、精确的一种方法．该方法可以检测出培养物 上清中１０ Ｐｇ・ｍＬ 的ｎｉｓｉｎ量＿１ ．荧光定量检测的标准曲线如图３．Ｍ１７ＧＴｗ的背景荧光强度为 （５２．６±０．５）ＲＦＵ． 荧光定量检测结果见表１．从表中可以看出，在几乎相同的ＯＤ值和细胞浓度的情况下，野生型Ｌ ｌａｃｔｉｓ Ｎ８的单个细胞ｎｉｓｉｎ表达量和总体ｎｉｓｉｎ产量是Ｌ．１ａｃｔｉｓ Ｎ８：ＡｆｈｕＲ的两倍左右．为取得相同菌浓 下的对比结果，本实验选取在培养液ＯＤ 。。值１．２左右进行测定，但此时的Ｌ．１ａｃｔｉｓ Ｎ８：ＡｆｈｕＲ生长已到 达恒定期，而Ｌ．１ａｃｔｉｓ Ｎ８尚在对数中后期．在另一项ｎｉｓｉｎ荧光定量检测中，对生长到达恒定期的Ｌ．１ａｃ— ｔｉｓ Ｎ８培养液进行了检测，此时菌液ＯＤ。∞值为１．８，细胞数为６．４×１０。，单个细胞ｎｉｓｉｎ产量为 （１．５５±０．０６）×１０ Ｐｇ・ｍＬ～，为突变株的３倍，总体ｎｉｓｉｎ产量（９．９Ｏ±０．４０）×１０ Ｐｇ・ｍＬ～．为突变 株的４倍． 表１ Ｌ．１ａｃｔｉｓ Ｎ８和Ｌ．１ａｃｔｉｓ Ｎ８：△ｆｈｕＲ荧光定量检测结果 Ｔａｂｌｅ １ Ｎｉｓｉｎ ＧＦ ｑｕａｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｂｉｏａｓｓａｙ ｒｅｓｕｌｔｓ ｏｆ Ｌ．／ａｃｔ／ｓ Ｎ８ ａｎｄ三．１ａｃｔｉｓ Ｎ８：Ａ
２．５ ｎｉｓｉｎ耐受性检测 产ｎｉｓｉｎ的乳球菌自身对于ｎｉｓｉｎ有着一定程度的耐受性，其耐受水平比Ｌ．１ａｃｔｉｓ ＩＬ１４０３等不产ｎｉｓｉｎ 的乳球菌以及绝大多数对ｎｉｓｉｎ敏感的革兰氏阳性菌高出几百甚至几千倍．在ｎｉｓｉｎ耐受性检测中，Ｌ．１ａｃ— ｔｉｓ Ｎ８表现出１ ５００ ＩＵ・ｍＬ叫的耐受性，相比之下 ．１ａｃｔｉｓ Ｎ８：△ Ｒ的耐受性只有３００ ＩＵ・ｍＬ～，但