两种纳豆激酶活性测定方法对比及相关性分析

作者简介：杨明俊（１９７９－），男（汉），硕士研究生，研究方向：微生物药物学。

＊通讯作者杨明俊１，杨晓彤１，＊，冯慧琴１，糜可１，杨庆尧２（１．上海师范大学微生物与免疫学研究所，上海２００２３４；２．上海杨杨百草研究所，上海２００２３４）两种纳豆激酶活性测定方法对比及相关性分析摘要：从线性和精密度两个方面对纤维蛋白平板法和四肽底物法测定纳豆激酶活性的两种方法进行了比较研究，并验证了两种方法测定值之间的直线相关性。

结果表明：纤维蛋白平板法和四肽底物法分别在１０．７７ＩＵ／ｍＬ￣８０．７３ＩＵ／ｍＬ和０．０３Ｕ／ｍＬ￣０．０９Ｕ／ｍＬ浓度范围内呈线性，且日间和日内变异系数均小于１０％。

两者结果具有直线相关性，其关系为纤维蛋白平板法测定值（ＩＵ）＝２６４．８７×四肽底物法测定值（Ｕ）－１９．６３３，（Ｒ２＝０．９９４２）。

结论：纤维蛋白平板法与四肽底物法均能用于纳豆激酶活性测定，前者测定结果直接，但四肽底物法更灵敏，还可应用于高通量筛选。

关键词：纳豆激酶；纤维蛋白平板法；四肽底物法ＡＣＯＭＰＡＲＩＳＯＮＡＮＤＣＯＲＲＥＬＡＴＩＯＮＳＴＵＤＹＯＦＴＷＯＭＥＴＨＯＤＳＦＯＲＮＡＴＴＯＫＩＮＡＳＥＡＣＴＩＶＩＴＹＤＥＴＥＣＴＩＯＮＹＡＮＧＭｉｎｇ－ｊｕｎ１，ＹＡＮＧＸｉａｏ－ｔｏｎｇ１，＊，ＦＥＮＧＨｕｉ－ｑｉｎ１，ＭＩＫｅ１，ＹＡＮＧＱｉｎｇ－ｙａｏ２（１．Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｏｆｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ＆Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，ＳｈａｎｇｈａｉＮｏｒｍａｌＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｓｈａｎｇｈａｉ２００２３４，Ｃｈｉｎａ；２．ＳｈａｎｇｈａｉＹａｎｇ’ｓＨｅｒｂＩｎｓｔｉｔｕｔｅ，Ｓｈａｎｇｈａｉ２００２３４，Ｃｈｉｎａ）Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｔｈｉｓｓｔｕｄｙｃｏｍｐａｒｅｄｔｈｅｌｉｎｅａｒｉｔｙａｎｄｐｒｅｃｉｓｉｏｎｏｆｆｉｂｒｉｎｐｌａｔｅ（ＦＰ）ｍｅｔｈｏｄｗｉｔｈｔｅｔｒａ－ｐｅｐｔｉｄｅ（Ｓｕｃ－Ａｌａ－Ａｌａ－Ｐｒｏ－Ｐｈｅ－ｐＮＡ）ｓｕｂｓｔｒａｔｅ（ＳＳ）ｍｅｔｈｏｄ，ａｎｄｔｈｅｉｒｒｅｓｕｌｔｓ’ｃｏｒｒｅｓｐｏｎｄｅｎｃｙｗａｓａｌｓｏｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｅｄ．Ｒｅ－ｓｕｌｔｓｓｈｏｗｅｄｔｈａｔ：Ｔｈｅａｃｔｉｖｉｔｙｌｉｎｅａｒｒａｎｇｅｓｗｅｒｅ１０．７７ＩＵ／ｍＬ￣８０．７３ＩＵ／ｍＬｆｏｒＦＰｍｅｔｈｏｄａｎｄ０．０３Ｕ／ｍＬ￣０．０９Ｕ／ｍＬｆｏｒＳＳｍｅｔｈｏｄｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ，ｗｈｉｌｅｂｏｔｈＣＶｓｗｅｒｅｌｅｓｓｔｈａｎ１０％ｉｎｗｉｔｈｉｎ－ｄａｙａｎｄｄａｙ－ｔｏ－ｄａｙｔｅｓｔｓ．Ｔｈｅｔｗｏｒｅｓｕｌｔｓｓｈｏｗｅｄａｇｏｏｄｌｉｎｅａｒｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎａｎｄｃｏｕｌｄｂｅｃｏｎｖｅｒｔｅｄａｓ：ＦＰｖａｌｕｅｓ（ＩＵ）＝２６４．８７×ＳＳｖａｌｕｅｓ（Ｕ）－１９．６３３，（Ｒ２＝０．９９４２）．Ｔｈｅｒｅｆｏｒｅ：ｆｉｂｒｉｎｐｌａｔｅｍｅｔｈｏｄａｎｄｔｅｔｒａ－ｐｅｐｔｉｄｅｓｕｂｓｔｒａｔｅ（ＳＳ）ｍｅｔｈｏｄａｒｅｂｏｔｈａｐ－ｐｌｉｃａｂｌｅｆｏｒｄｅｔｅｃｔｉｎｇＮａｔｔｏｋｉｎａｓｅａｃｔｉｖｉｔｙ．ＴｈｅｒｅｓｕｌｔｆｒｏｍＦＰｍｅｔｈｏｄｃａｎｄｉｒｅｃｔｌｙｒｅｆｌｅｃｔｎａｔｔｏｋｉｎａｓｅ’ｓｔｈｒｏｍ－ｂｏｌｙｔｉｃａｃｔｉｖｉｔｙａｎｄｔｈｅｔｅｔｒａ－ｐｅｐｔｉｄｅｓｕｂｓｔｒａｔｅｍｅｔｈｏｄｈａｓｔｈｅａｄｖａｎｔａｇｅｆｏｒｆａｓｔ，ｓｅｎｓｉｔｉｖｅａｎｄｈｉｇｈ－ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔｓｃｒｅｅｎｉｎｇ．Ｋｅｙｗｏｒｄｓ：ｎａｔｔｏｋｉｎａｓｅ；ｆｉｂｒｉｎｐｌａｔｅｍｅｔｈｏｄ；ｔｅｔｒａ－ｐｅｐｔｉｄｅｓｕｂｓｔｒａｔｅｍｅｔｈｏｄ纳豆（Ｎａｔｔｏ）是日本的传统发酵食品，以大豆为原料由纳豆芽孢杆菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓｓｕｂｔｉｌｉｓｖａｒ．ｎａｔｔｏ）发酵而成，其风味独特、营养丰富。

纳豆激酶（Ｎａｔｔｏｋｉｎａｓｅ，ＮＫ）是纳豆中的一种丝氨酸蛋白酶，具有较强纤溶活性，因此常食纳豆可减少血管栓塞的危险，有益于老年性心血管疾病的预防［１］。

纳豆激酶的活性反映了纳豆的保健功效，因此活性测定是纳豆研究和质量控制中必需也是关键的技术之一。

纳豆激酶活性测定方法常见的有纤维蛋白平板法［２］、纤维蛋白块溶解时间法［３］、四肽底物法［４］、酶联免疫吸附法［５］和血清板法［６］等，其中使用得较多的是纤维蛋白平板法，即根据纳豆激酶将纤维蛋白平板内纤维蛋白（Ｆｉｂｒｉｎ）水解而形成透明圈的原理，利用透明圈面积计算纳豆激酶纤溶活性。

该测定法的优点是结果比较直观，但由于所用试剂为生物制品，批次差异大，实验操作复杂，实验过程耗时，难以进行大批量样品高通量筛选。

已知纳豆激酶对Ｓｕｃ－Ａｌａ－Ａｌａ－Ｐｒｏ－Ｐｈｅ－ｐＮＡ最为敏感［７］，可以将该底物水解生成对硝基苯胺（ｐ－ＮＡ）而使溶液呈黄色，根据单位时间内对硝基苯胺的释放量计算酶的活性。

此法底物为人工合成的小肽，品质容易控制，操作便捷，特别是可以进行大批样品的高通量筛选。

但其测定的纳豆激酶活性与纤溶活性的相关性一直未经验证，用于纳豆激酶测定的具体条件也未见报道。

本研究分别用纤维蛋白平板法和四肽底物法测图１尿激酶活性标准曲线Ｆｉｇ．１ＳｔａｎｄａｒｄｃｕｒｖｅｏｆＵｒｏｋｉｎａｓｅａｃｔｉｖｉｔｙ定了纳豆激酶的活性，研究了与纤维蛋白平板法结果的相关性，并初步建立了纳豆激酶四肽底物测定法的具体条件。

１材料与方法１．１材料和主要仪器纳豆激酶粗酶提取冻干粉：由上海杨杨百草研究所提供；尿激酶标准品（６９０ＩＵ／支）：中国药品生物制品检定所；牛纤维蛋白原（７２ｍｇ可凝蛋白／支）：中国药品生物制品检定所；牛凝血酶（１９０ＢＰ单位／支）：中国药品生物制品检定所；琼脂糖：上海东海制药厂；四肽底物（Ｌ－１４００，Ｓｕｃ－Ａｌａ－Ａｌａ－Ｐｒｏ－Ｐｈｅ－ｐＮＡ）：Ｂａｃｈｅｍ公司；对硝基苯胺：上海试剂三厂。

Ｍｏｄｅｌ６８０型酶标仪：Ｂｉｏ－Ｂａｄ公司；ＧＳＰ－９１６０ＭＢＥ隔水式恒温培养箱：上海博迅实业有限公司；ＤＫ－Ｓ２４型电热恒温水浴锅：上海精宏实验设备有限公司。

１．２方法１．２．１纤维蛋白平板法首先用２％（ｗ／ｖ）牛纤维蛋白原巴比妥－氯化钠（ｐＨ７．８）溶液５ｍＬ；１０％（ｗ／ｖ）琼脂糖生理盐水溶液５ｍＬ；２００ＢＰ单位／ｍＬ牛凝血酶溶液２５ｍＬ制成纤维蛋白平板。

用巴比妥－氯化钠缓冲液配制１００ＩＵ／ｍＬ尿激酶标准品溶液并稀释成８０ＩＵ／ｍＬ、６０ＩＵ／ｍＬ、４０ＩＵ／ｍＬ、２０ＩＵ／ｍＬ和１０ＩＵ／ｍＬ的浓度梯度，然后各取１０ｍＬ滴加到纤维蛋白平板上，３７℃条件下孵育１８ｈ后测量形成透明圈两条相互垂直的直径，并计算其面积。

以尿激酶活力单位的对数值为横坐标，透明圈面积的对数值为纵坐标，绘制标准曲线。

样品溶液形成的透明圈按同样的方法测定，并计算透明圈面积的对数值，根据标准曲线以尿激酶活力单位表示其纤溶活性。

１．２．１．２纤维蛋白平板法的线性以巴比妥－氯化钠缓冲液配制浓度分别为３０ｍｇ／ｍＬ、２４ｍｇ／ｍＬ、１８ｍｇ／ｍＬ、１２ｍｇ／ｍＬ和６ｍｇ／ｍＬ的样品溶液，同法滴加在纤维蛋白平板上，测量透明圈的面积，每浓度重复５次取平均值，以ＳＰＳＳ１０．０对样品溶液浓度与相应透明圈面积的关系进行直线回归分析。

１．２．１．３纤维蛋白平板法的精密度分别取各浓度的样品溶液滴加在纤维蛋白平板上，测量透明圈的面积，日内和日间各重复３次，以变异系数（ＣＶ）表示测定值批次间的差异。

１．２．２四肽底物法用Ｔｒｉｓ－ＣａＣｌ２缓冲液（０．１ｍｏｌ／ＬＴｒｉｓ，０．０１ｍｏｌ／ＬＣａＣｌ２，ｐＨ８．０）配制１ｍｍｏｌ／Ｌ的四肽底物溶液。

３７℃条件下，分别取５０ｍＬ不同浓度的样品溶液加入细胞培养孔中，再同时加入５０ｍＬ四肽底物溶液，振荡混匀，以４１５ｎｍ为测定波长５５０ｎｍ为参比波长，用酶标仪测定１ｍｉｎ内酶促反应速度（ｍＯＤ／ｍｉｎ）。

以对硝基苯胺标准溶液的浓度为横坐标，以吸光值为纵坐标作出标准曲线。

根据标准曲线得到样品水解四肽底物生成对硝基苯胺的物质量。

活力单位定义为，３７℃条件下，１ｍｉｎ时间内１ｍＬ反应体系中，水解四肽底物生成１ｍｍｏｌ对硝基苯胺的酶活力为１Ｕ。

１．２．２．１四肽底物法的线性以Ｔｒｉｓ－ＣａＣｌ２缓冲液配制浓度分别为７．５ｍｇ／ｍＬ、６ｍｇ／ｍＬ、４．５ｍｇ／ｍＬ、３ｍｇ／ｍＬ和１．５ｍｇ／ｍＬ的样品溶液，同法测酶促反应的速度，重复５次取平均值，以ＳＰＳＳ１０．０对样品溶液的浓度与相应酶促反应速度的关系进行直线回归分析。

１．２．２．２四肽底物法的精密度分别取各浓度的样品溶液测酶促反应的速度，日内和日间各重复３次，以变异系数表示测定值批次间的差异。

１．２．３纤维蛋白平板法和四肽底物法测定值的相关性在３０ｍｇ／ｍＬ、２４ｍｇ／ｍＬ、１８ｍｇ／ｍＬ、１２ｍｇ／ｍＬ和６ｍｇ／ｍＬ浓度梯度下，分别以纤维蛋白平板法和四肽底物法测定样品溶液的活性，以ＳＰＳＳ１０．０对测定的结果进行相关性分析。

２结果与分析２．１纤维蛋白平板法２．１．１尿激酶标准曲线尿激酶标准溶液的活力单位与其形成透明圈面积的关系见图１。

在１０ＩＵ／ｍＬ￣１００ＩＵ／ｍＬ浓度范围内，尿激酶活力单位的对数值与透明圈面积的对数值呈线性关系，Ｙ＝０．４０５６Ｘ－０．４７４９，Ｒ２＝０．９９０２。

图２样品溶液浓度对数值与透明圈面积对数值的线性关系Ｆｉｇ．２Ｔｈｅｌｉｎｅａｒｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎｂｅｔｗｅｅｎｌｏｇａｒｉｔｈｍｖａｌｕｅｏｆｓａｍｐｌｅｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎａｎｄｌｙｔｉｃｃｉｒｃｌｅａｒｅａ图３对硝基苯胺溶液吸光值的标准曲线Ｆｉｇ．３Ｓｔａｎｄａｒｄｃｕｒｖｅｓｏｆｐ－ｎｉｔｒｏａｎｉｌｉｎｅａｂｓｏｒｂｅｎｃｙ图４样品溶液浓度与反应速度的关系Ｆｉｇ．４Ｔｈｅｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎｂｅｔｗｅｅｎｏｆｓａｍｐｌｅｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎａｎｄｒｅａｃｔｉｏｎｖｅｌｏｃｉｔｙ２．１．２纤维蛋白平板法的线性以样品溶液浓度的对数值与透明圈面积的对数值作图，发现样品溶液不同浓度的对数值与相应透明圈面积的对数值呈线性关系，Ｙ＝０．５１１２Ｘ－０．４４２３，Ｒ２＝０．９９０２。

以ＳＰＳＳ１０．０进行直线回归分析可见：显著性概率小于１％，二者之间有极显著的直线回归关系，见表１。

２．１．３纤维蛋白平板法的精密度各浓度的样品溶液在日内和日间分别重复３次测定，其结果见表２。

由表２可见，在日间和日内各进行３次实验其变异系数均小于１０％，显示该方法具有较高的精密度，符合生物样品的测定要求。

在测定浓度范围内，随着样品溶液活性的升高变异系数明显降低。

在日间和日内进行测定具有相似变异系数的结果，显示该方法具有较高的精密度和批次稳定性。