DNA甲基化和肿瘤的关系
DNA 甲基化与肿瘤
一、DNA甲基化与基因表达
5-甲基胞嘧啶是天然存在的修饰碱基，甲基化的 mCpG ，在DNA 双链中对称出现。哺乳类动物基因组约60 %的表达基因5′端启动子存在未被甲基化的CpG岛,而启动子区域外的CpG岛大都为 mCpG。正常情况下，非活化的X染色体、印迹基因等的启动子区域的CpG岛为甲基化状态，而看家基因的 CpG岛则是去甲基化状态。 DNA 甲基化状态与基因表达呈负相关。其调控作用主要在转录水平抑制基因表达。
DNA甲基化的检测方法
经过亚硫酸盐处理后的DNA中胞嘧啶（C）转变为胸腺嘧啶（T）,但是甲基化的中的CpG二核苷酸C 未转变为T，而无甲基化的CpG二核苷酸则发生这种转变，由此可以推断DNA是否发生甲基化。TATAGGGCGAATTGGGCCCTCTAGATGCATGCTCGAGCGG CCGCCAGTGTGATGGATATCTGCAGAATTGCCCTTTAGTAT TGTTTGGTGAAATGGTACGTGTTTATAATTTTAGTTATTTAG GAGGTTGAGGTAGGAGGATTTTTTGAGTTTAGGAGTTTAA GTTTAGTTTGGGTAATATAGTTTAGTGGTTATATTAAAAAA AGTAAAATAGTCGGGCGCGGTGGTTTACGTTTGTAATTTTA GTATTTTGGGAGGTCGAGGCGGGTGGATTACGAGGTTAGG AGGTTGAGATTATTTTAAGGGCAAT
DNA 甲基化抑制基因转录的分子机制
①DNA 双螺旋结构的大沟为DNA 与多种转录因子的作用部位，mCpG的甲基化胞嘧啶突入大沟，抑制转录因子的结合而抑制转录。②mCpG 激活阻遏蛋白因子，如DMAP1、TSG101、 Mi2等，通过阻遏蛋白因子的作用抑制转录。③DNA甲基化与组蛋白乙酰化的研究发现，组蛋白H3、H4 的赖氨酸去乙酰化后带负电荷,与带正电荷的DNA 结合更紧密,不利于转录过程中的聚合物解聚，从而抑制基因转录。甲基化的CpG 结合蛋白(MeCPs) 与DNA 的mCpG结合,并与组氨酸去乙酰化酶(HDAC) 形成复合物共同抑制转录。
二、DNA甲基化与肿瘤
以往的研究认为癌基因激活、抑癌基因失活主要是基因突变、缺失导致的DNA 序列改变。在肿瘤研究中，检测到许多肿瘤的重要基因并未发生突变、缺失，基因表达的异常主要通过DNA 甲基化实现。癌基因的去甲基化和抑癌基因的甲基化状态，可导致癌基因激活、抑癌基因的失活。癌基因的低甲基化和抑癌基因的高甲基化改变是肿瘤细胞的一个重要特征。 DNA 甲基化状态的改变导致基因结构和功能的异常，与肿瘤发生的关系是近年来研究的热点。
DNA甲基化的异常与基因突变、缺失等基因组异常也有密切的关系
甲基化异常可能通过以下途径导致的基因不稳定:
①DNA甲基化使基因突变率升高,5-甲基胞嘧啶可自发
脱氨形成胸腺嘧啶,这一频率高于胞嘧啶转变为尿嘧啶的频率,并常导致C →T 突变。p53、Rb、c-H-ras-1基因中均发现该类型突变。②启动子甲基化使一些重要的基因渐成失活,倾向基因
不稳定。
③肿瘤的一个重要特征是DNA启动子局部
甲基化增强的同时,基因组总甲基化水平却低于正常细胞。基因组总甲基化水平低也是基因不稳定的原因之一。
三、乳腺癌中基因的甲基化
1. ER基因 ER的表达与否是乳腺癌激素治疗的
一个肿瘤标记物。
ER基因启动子和1号外显子上分布有CpG岛。
乳腺癌中ER失表达是经常性事件,约1/3的乳腺癌
患者初诊时ER表达阴性；相当一部分的乳腺癌患者随着肿瘤病情的进展, ER由阳性变成阴性。基因组的改变, 在ER基因失表达中作用不大。近来的研究认为, ER基因的甲基化异常是其失活的主要机制。
应用Southern
印迹杂交及MS-PCR法研究,显示在正常
乳腺组织和ER表达阳性的肿瘤细胞株,如MCF-7、T47-D、
ZR75-1 均未检测到启动子的高甲基化,而在原发性乳腺
癌和许多ER阴性的乳腺癌细胞株MDA-MB-231、MDA-MB435、MDA-MB-468、Hs578t 中,近50 %的ER启动子高甲基化。可见,DNA甲基化在乳腺癌的ER基因失活中起着十
分重要的作用。
一系列乳腺癌细胞株中DNA甲基转移酶1
(DNMT1) 的
活性水平检测结果显示, ER阴性的乳腺癌细胞株和ER
阳性的比较， DNMT1的表达水平无论RNA 水平或是蛋白水平都显著升高。ER阴性的乳腺癌DNMT1在整个细胞周
期都表达,ER阳性的细胞株则DNMT1多数出现于S 期。
2.PR 基因
PR 基因1号外显子上分布有CpG岛。该基因编码两种同源性的蛋白质hPRa和hPRb。二者的区别在于 N-末端序列和生物活性。hPRb的转录需要ER激活, 而hPRa不必。Southern印迹杂交及MS-PCR法分析
PR表达阴性的原发性乳腺癌及乳腺癌细胞株,约
40%的PR基因启动子甲基化。
应用DNMT1抑制剂5-aza-Dc和雌激素作用于PR阴性
的乳腺癌细胞株MSA-MB-231, PR基因启动子部分去甲基化且基因重新表达。
3. BRCA1基因 BRCA1 基因于1994年最早报道, 为具有遗传倾向的乳腺癌、卵巢癌的易感基因,在乳腺癌中最主要的改变形式为等位基因杂合型缺失和突变。目前的研究认为, 在约50%的遗传性乳腺癌中，BRCA1基因的可遗传性突变是主要的分子机制。散发性乳腺癌病例中,BRCA1基因突变罕见。DNA甲基化机制可以合理地解释散发性乳腺癌的BRCA1基因转录与翻译水平异常。应用Southern印迹和甲基化敏感特异单链构象分析法(MS-SSCA法)分析散发性乳腺癌中BRCA1 基因启动子甲基化情况,11～2
4.2%的病例的BRCA1基因启动子高度甲基化。在散发型乳腺癌中,甲基化改变是 BRCA1基因失表达的重要机制之一。
4.上皮钙黏附蛋白( E-cadherin)
黏附分子的异常，使细胞和细胞间失去黏附作用，在肿瘤的转移和侵润中起关键作用。
E-cadherin是一种重要的钙依赖性的黏附分子, 该蛋白在上皮细胞之间起着黏附及维持组织结构完整性的作用。正常上皮中该蛋白在细
胞边缘区呈强阳性表达,而在大多数肿瘤中表达异常。该蛋白的表达与肿瘤的浸润、转移呈负相关。
基因的突变、缺失可以解释部分E-cadherin失表达, 但是在约50%的原发性乳腺癌和乳腺癌细胞株MDAMB-435中未检测到基因的突变、缺失,应用MS-PCR 法却发现E-cadherin基因5′端CpG的高甲基化现象, 表明E-cadherin基因启动子甲基化与该基因失活密切相关。乳腺原位导管癌中E-cadherin启动子30% 甲基化,而转移病灶上升到60% ,提示E-cadherin基因的甲基化情况与肿瘤的恶性程度相关。研究显示口部鳞癌淋巴结转移细胞系的E-cadherin 的低表达和甲基化有关。
5.P16INK4a/CDKN2A/MTS
DNA 甲基化在抑癌基因失活中起着重要的作用。 P16INK4a 编码的蛋白是细胞周期依赖性激酶4 的抑制物(CDKI4) ,通过Rb蛋白的磷酸化/去磷酸化作用调节细胞G1 →S 期的转化。该基因转录产物是P16INK4a与P19ARF 两种蛋白。P16INK4a失活存在于大多数肿瘤中,
但是乳腺癌中纯合性缺失、点突变极低，分别为1.9%和1.0%。有20%～30%的原发性乳腺癌及乳腺癌细胞株T47-D、HMECs、ZR75-1检测到5′端启动子和1号外显子的甲基化情况。在40例浸润性导管癌占30%发生P16INK4a基因甲基化，与肿瘤分级、淋巴结转移有关。
6.候选抑癌基因脾酪氨酸激酶syk启动子甲基化与乳腺癌发生和转移的关系
在细胞的信号传导途径中,酪氨酸激酶起着很重要的作用。syk在造血细胞上广泛表达, 作为信号传导过程中一个影响因子而被广泛研究。B 细胞抗原受体 (BcR)激活以后,依赖syk 的信号传导途径调节 B 细胞的克隆表达, 分化和凋亡。磷脂酶C(PLC)-γ 2 和磷脂酰肌醇3 激酶(PI3-K) 是syk 的关键靶位。B 细胞内 PLC-γ 2 syk的磷酸化导致ERK 和JNK激酶活性的下降, 相反,通过syk 介导Akt 激活可致PI3-K磷酸化。国外研究认为syk,在T 细胞分化成熟过程中也起着很重要的作用采用。
syk 也可使微管的α -微管蛋白亚基磷酸化,α -微管蛋白亚基磷酸化有调节微管细胞骨架的功能,而微管细胞骨架是作为信号复合物装配的基础。
RT-PCR和
MS-PCR检测了40例乳腺癌组织癌旁组织及 15 例乳腺纤维瘤组织中syk基因 mRNA 的表达及syk 基因启动子甲基化情况。syk mRNA 在乳腺正常组织中可检测到,而在乳腺癌组织中检测率很低,两组差异有显著意义,这表明syk mRNA 的表达缺失可能与乳腺癌的发生有关。同时，有淋巴结转移的乳腺癌组织的 syk mRNA 的检出率显著低于无淋巴结转移组,这表明 syk mRNA 的表达缺失可能与乳腺癌的转移有关。
研究发现，转染了野生型syk 的乳腺癌细胞株有抑制乳腺癌生长和转移的作用。Okamura 等认为Syk 基因的表达是p53 依赖性的。在肿瘤生成过程中，p53 的功
能丧失会导致syk 的活性下降,从而使肿瘤易于生成和转移。Carter 等认为syk 与HER2/ neu 是一对功能相反的抑癌/癌基因，HER2/ neu 的过度表达可诱导血管内皮细胞的收缩，从而使肿瘤细胞易于穿过血管屏障发生转移，而syk 可抑制HER2/ neu 的收缩血管内皮细胞作用，从而抑制肿瘤的转移。Mahabeleshwar 等研究认为，syk通过抑制磷脂酰肌醇3 (PI-3) 激酶的活性，从而抑制肿瘤细胞的分裂和核因子NF-κ B 调节的尿激酶型－纤溶酶激活物(u-PA) 的激活分泌,而 u-PA 的激活分泌与多种恶性肿瘤的发生、发展及转移相关。
7. 乳腺癌Nm23-H1 转移抑制基因 Nm23-H1基因的启动子有2个 CpG 岛。DNA 甲基化抑制剂 5-Aza-CdR，使 11个乳腺癌细胞系中5个细胞
系的Nm23H1 表达升高，其中3个有转移能力。 Nm23-H1表达升高的同时细胞系体外转移能力下降。
8. hDAB2IP
（人DOC-2/DAB2 interactive protein ）
hDAB2IP 肿瘤抑制基因是 Ras GTPase活化家族的新
成员。乳腺癌、前列腺癌中，hDAB2IP 甲基化率高，与表达负相关，甲基化状态在hDAB2IP 基因失活中起关键作用。5-aza-2-deoxycytidine处理后，基因表达恢复。 hDAB2IP 的启动子区分成m2a 和 m2b。 m2a区甲基化异常：25个乳腺癌细胞系中，有11个，占44%。39个原发乳腺癌中有15个，占 38%； m2b区甲基化异常：25个乳腺癌细胞系中，有12 个，占48%。 39个原发乳腺癌中有13个，占 33%。 m2b区甲基化异常和乳腺癌淋巴结转移有关。
9.其它基因的甲基化
14-3-3σ基因PHME1(human mammary epithelial 1) 、RARβ 2 基因(即视黄酸受体β基因) 等许多关键的抑癌基因和生长因
子调节基因的研究都肯定了DNA 甲基化异常
是基因失活的重要机制。这些基因的表达蛋
白产物涵盖了诸如DNA 修复、细胞周期调节、
细胞生长调节、细胞间黏附等各环节。
Cyclin D2, RAR-? , Twist, RASSF1A, HIN-1
在乳腺原发癌及其淋巴结(25例)、骨（12例）、
脑（8例）、肺转移（10例）的配对标本中检测Cyclin
D2, RAR-? , Twist, RASSF1A, 和HIN-1 基因的高甲基
化情况。与原发癌相比，转移癌均有甲基化率高的趋势，其中淋巴结转移癌HIN-1 的甲基化状况有显著差异，骨、脑、肺转移癌HIN-1 和RAR-? 有显著差异。
转移癌中，上述基因的低表达与其启动子区的高甲基
化相关。甲基化率高的转移癌对甲基化抑制剂和组蛋
白去已酰酶抑制剂治疗敏感。
RASSF1A, APC, DAP-kinase
RAS association domain family protein 1A (RASSF1A), adenomatous
polyposis coli (APC), death-associated protein kinase (DAP-kinase)
在原发导管癌和小叶癌及不同阶段和等级的侵
润癌中， RASSF1A, APC, DAP-kinase 的高甲基化
34例标本中，32例有一个或多个基因高甲基化，占 94%。 RASSF1A 高甲基化22例
，占65%；APC 高甲基化15例，占47%；DAP-kinase 高甲基化17例，占50%。
Urokinase （uPA ）
uPA 只在高转移癌(包括乳腺癌)中表达， uPA
的高表达和其启动子低甲基化有关。S-Adenosyl-
L-methionine (AdoMet) 抑制去甲基化且促进甲基
化，使uPA甲基化，表达降低，显著抑制肿瘤转移。 5‘-azacytidine 抑制了AdoMet对uPA的作用。
四.DNA甲基化在乳腺癌诊断中的应用
DNA 甲基化在乳腺癌的诊疗中至少可在两方面得到应用。①作为临床诊断,病程监控的分子标志物。
②逆转基因甲基化作为肿瘤治疗的新方向。
目前,基因甲基化在乳腺癌诊断中应用的最大
问题是确定候选靶基因。
五.DNA甲基化在肿瘤治疗中的应用
逆转DNA甲基化可作为一种治疗肿瘤的方向。
目前国外正在应用DNMT和HDAC 的抑制剂作这方面的
研究。DNMT的抑制物5-aza-C 及其脱氧衍生物5aza-dC 是胞嘧啶的类似物,参与DNA 的复制。其参与形成的DNA与DNMT形成的共价化合物抑制DNMT的活性,这种作用是不可逆的。从而可以逆转被甲基化的
基因,重新激活靶基因的转录。DNMT的抑制物临床上
早已在白血病,脊髓发育不良症等疾病中应用。在大肠癌细胞株HT29 联合应用干扰素与5-aza-Dc 重新激活STAT-1 、2 、3 基因的转录活性。
DNA甲基化和肿瘤的关系
DNA 甲基化与肿瘤 一、DNA甲基化与基因表达 5-甲基胞嘧啶是天然存在的修饰碱基，甲基化的 mCpG ，在DNA 双链中对称出现。哺乳类动物基因组约60 %的表达基因5′端启动子存在未被甲基化的CpG岛,而启动子区域外的CpG岛大都为 mCpG。正常情况下，非活化的X染色体、印迹基因等的启动子区域的CpG岛为甲基化状态，而看家基因的 CpG岛则是去甲基化状态。 DNA 甲基化状态与基因表达呈负相关。其调控作用主要在转录水平抑制基因表达。 DNA甲基化的检测方法 经过亚硫酸盐处理后的DNA中胞嘧啶（C）转变为胸腺嘧啶（T）,但是甲基化的中的CpG二核苷酸C 未转变为T，而无甲基化的CpG二核苷酸则发生这种转变，由此可以推断DNA是否发生甲基化。TATAGGGCGAATTGGGCCCTCTAGATGCATGCTCGAGCGG CCGCCAGTGTGATGGATATCTGCAGAATTGCCCTTTAGTAT TGTTTGGTGAAATGGTACGTGTTTATAATTTTAGTTATTTAG GAGGTTGAGGTAGGAGGATTTTTTGAGTTTAGGAGTTTAA GTTTAGTTTGGGTAATATAGTTTAGTGGTTATATTAAAAAA AGTAAAATAGTCGGGCGCGGTGGTTTACGTTTGTAATTTTA GTATTTTGGGAGGTCGAGGCGGGTGGATTACGAGGTTAGG AGGTTGAGATTATTTTAAGGGCAAT
DNA 甲基化抑制基因转录的分子机制 ①DNA 双螺旋结构的大沟为DNA 与多种转录因子的作用部位，mCpG的甲基化胞嘧啶突入大沟，抑制转录因子的结合而抑制转录。②mCpG 激活阻遏蛋白因子，如DMAP1、TSG101、 Mi2等，通过阻遏蛋白因子的作用抑制转录。③DNA甲基化与组蛋白乙酰化的研究发现，组蛋白H3、H4 的赖氨酸去乙酰化后带负电荷,与带正电荷的DNA 结合更紧密,不利于转录过程中的聚合物解聚，从而抑制基因转录。甲基化的CpG 结合蛋白(MeCPs) 与DNA 的mCpG结合,并与组氨酸去乙酰化酶(HDAC) 形成复合物共同抑制转录。 二、DNA甲基化与肿瘤 以往的研究认为癌基因激活、抑癌基因失活主要是基因突变、缺失导致的DNA 序列改变。在肿瘤研究中，检测到许多肿瘤的重要基因并未发生突变、缺失，基因表达的异常主要通过DNA 甲基化实现。癌基因的去甲基化和抑癌基因的甲基化状态，可导致癌基因激活、抑癌基因的失活。癌基因的低甲基化和抑癌基因的高甲基化改变是肿瘤细胞的一个重要特征。 DNA 甲基化状态的改变导致基因结构和功能的异常，与肿瘤发生的关系是近年来研究的热点。 DNA甲基化的异常与基因突变、缺失等基因组异常也有密切的关系
DNA甲基化
DNA甲基化概述 在哺乳动物基因组中，甲基化是一种表观遗传机制，包括将甲基转移到胞嘧啶的C5位置形成5-甲基胞嘧啶。DNA甲基化通过招募参与基因抑制的蛋白或通过抑制转录因子与DNA的结合来调节基因表达。在发育过程中，DNA甲基化的模式在基因组中发生变化，这是DNA从头甲基化和去甲基化的动态过程的结果。 DNA甲基化是被一个甲基转移酶家族所催化，转移S腺苷甲硫氨酸(SAM)的一个甲基到第五个碳胞嘧啶残基形成5mc , Dnmt3a和Dnmt3b可以建立一个新的DNA甲基化模式来去修饰DNA，被称为从头甲基化。另一方面，Dnmt1在DNA复制过程中起作用，将亲代DNA链上的甲基化模式复制到新合成的子链上。这三种DNA都广泛参与胚胎的发育。这三种DNA都广泛参与胚胎的发育。当细胞到达终末分化时，Dnmt的表达大大降低。这似乎表明有丝分裂后细胞的DNA甲基化模式是稳定的。 大部分DNA的甲基化发生在鸟嘌呤核苷酸或CpG位点之前的胞嘧啶上。总的来说，哺乳动物基因组中CpG位点的减少可能是由于5 - mc可脱氨成胸腺嘧啶的诱变潜力。剩余的CpG位点分布在整个基因组中，除了CpG岛外，它们都被严重甲基化。DNA甲基化对沉默逆转录病毒分子、调节组织特异性基因表达、基因印记和X染色体失活至关重要。不同基因组区域的DNA甲基化可能根据潜在的遗传序列对基因活动产生不同的影响。 一、DNA甲基化的位置 1.1 基因间区 大约45%的哺乳动物基因组由转座因子和病毒因子组成，这些因子被大量甲基化而沉默。这些元素中的绝大多数是通过DNA甲基化或随着时间的推移由于5mC的破坏而产生的突变而失活的。如果表达，这些元素是潜在的有害的，因为它们的复制和插入可以导致基因损坏和DNA突变。胞内颗粒(IAP)是小鼠基因组中最具侵袭性的逆转录病毒之一。在整个生命过程中，IAP在配子形成、发育和成年阶段都被高度甲基化。甚至在胚胎内部，当基因组其余部分相对低甲基化时，Dnmtl维持对IAP元件的抑制。当Dnmtl被基因突变耗尽，导致广泛的低甲基化时，IAP元素被表达。这表明，在基因间区，DNA甲基化的主要作用之一是抑制潜在有害基因元素的表达。 1.2 CpG岛 CpG岛是大约1000个碱基对长度的DNA延伸，它们的CpG密度比基因组的其他部分高，但通常不会甲基化。大多数基因启动子，大约70%，在CpG岛。特别是，管家基因的启动子常常嵌入到CpG岛。CpG岛，尤其是那些与启动子相关的基因在小鼠和人类之间高度保守。在整个进化过程中，CpG岛屿的位置和保存意味着这些区域具有重要的功能。 CpG岛通过调控染色质结构和转录因子的结合来促进基因表达。DNA有规律地包裹在组蛋白周围，形成被称为核小体的小段。DNA与组蛋白的联系越紧密，对基因表达的宽容程度就越低。CpG岛的一个共同特征是，它们比其他DNA片段包含更少的核团。与CpG 岛相关的少数核小体常含有组蛋白，其修饰涉及增强基因表达。尽管约50%的CpG岛包含已知的转录起始位点，但CpG岛往往缺乏常见的启动子元件，如TATA boxes 。由于许多转录因子结合位点富含GC, CpG岛可能会增强对转录起始位点的结合。CpG岛虽然缺乏共同的启动子元件，但却能增强DNA的可达性，促进转录因子的结合。 CpG岛的甲基化导致了稳定的基因表达沉默。在配子发生和胚胎早期发育期间，CpG 岛经历了差异甲基化。通过CpG岛调控基因表达的甲基化能力对建立很重要。印迹基因仅由两个遗传亲本染色体中的一个表达，它们的表达由遗传亲本决定。除了印迹基因外，CpG
DNA甲基化的总结
DNA甲基化是指在DNA甲基转移酶(DNMTs)的催化下,将甲基基团转移到胞嘧啶碱基上的一种修饰方式。它主要发生在富含双核苷酸CpG岛的区域,在人类基因组中有近5万个CpG岛[5]。正常情况下CpG岛是以非甲基化形式(活跃形式)存在的，DNA甲基化可导致基因表达沉默。DNMTs的活性异常与疾病有密切的关系,例如位于染色体上的DNMT3B基因突变可导致ICF综合征。有报道[6]表明，重度女性侵袭性牙周炎的发生与2条X染色体上TMP1基因去甲基化比例增高有关。DNMT基因的过量表达与精神分裂症和情绪障碍等精神疾病的发生也密切相关。风湿性疾病等自身免疫性疾病特别是系统性红斑狼疮(SLE)与DNA甲基化之间关系已经确定[7]，在SLE病人的T细胞发现DNMTs活性降低导致的异常低甲基化。启动子区的CpG岛过度甲基化使抑癌基因沉默,基因组总体甲基化水平降低导致一些在正常情况下受到抑制的基因如癌基因被激活[8],都会导致细胞癌变。 甲基化作用是转录水平上表达调控的基本方式之一。由于宿主细胞基因组DNA中不 同位点的甲基化程度存在某种平衡，并形成一定的空间结构特点。一旦转基因的整合破坏了这种平衡及空间特征，破坏后的结构便成为宿主基因组防御系统识别的信号，使新整合的DNA 序列发生不同程度的甲基化，甲基化基因序列则通过抑制甲基化DNA结合蛋白(MeCP2)的结合而抑制转录的顺利进行Ⅲo。在拟南芥中发现了DNA甲基化可以导致基因沉默汹埘]。在基因沉默过程中，外源或内源性信号引起部分DNA序列中CpG的甲基化，甲基化CpG结合域蛋白2(MeCP2)结合到甲基化的胞嘧啶上聚集HDACs使组蛋白去乙酰化，该蛋白与去乙酰化的组蛋白通过聚集更多的DNA 甲基转移酶来加强沉默信号，从而引起基因沉默H?。 ?。DNA甲基化对染色质结构和基因表达的作用很可能是通过一组蛋白介导的，这些蛋白可能含有共同的高度保守的甲基化的CpG结合结构域(MBD)L45 J。DNA甲基化在基因印记、x染色体失活、某些疾病的发生发展中发挥重要作用。其直接作用机制可能是CpG岛甲基化干扰了一些转录因子(transcription factor，TF)与基因调控区的结合，使甲基从DNA分子大沟中突出，从而阻止转录 因子与基因相互作用。间接机制可能是由于甲基化DNA与甲基化DNA结合蛋白结合或DNA甲基化改变染色质结构，这2种情况都间接阻碍TF与DNA结合从而抑制转录m1。DNA甲基化一般是通过转录抑制机制来调节特定基因的，具体的机制可能有：5一MeC伸入DNA双螺旋大沟，影响转录因子的结合；序列特异的甲基化DNA结合蛋白(MDBP一1，MDBP一2)与甲基化的启动子序列特异性结合而抑制转录因子与靶序列的结合；甲基化CpG结合蛋白(MeCPl，MeCP2)与甲基化的二核苷酸CpG结合，发挥类似转录抑制蛋白的作用H“。一般DNA甲基化会通过干扰转录因子与识别位点结合和招募组蛋白乙酰转移酶(histon acefltransfeI"SeS，HATs)、组蛋白去乙酰化酶(histone deacetylases，HDACs)形成辅助阻遏复合体，使基因沉默而抑制其表达，而去甲基化则使沉默的基因重新激活Ⅲ卜 ＤＮＡ甲基化尤其是基因启动子区ＣｐＧ岛的高甲基化，会导致基因表达的下降或沉默。甲基化抑制基因的表达目前认为要有两个方面，一方面甲基化引起的基因结构改变可直接阻碍一些转录因子与其结合位的结合；另一方面可能与一些甲基化
DNA甲基化研究综述
DNA甲基化研究综述 The summarize of the research on DNA methylation 郭文媛 （生物技术 1353227） 摘要：DNA 甲基化是真核生物表观遗传学中一种重要的基因表达调控方式，是一种酶催化的修饰过程。其是在DNA 甲基转移酶催化下，将甲基基团转移到胞嘧啶的5 位碳原子上，使之转变成5-甲基胞嘧啶的化学修饰过程。在人类和其他哺乳动物中，此修饰过程通常发生在5'-CpG-'二核苷酸的胞嘧啶上。大量相关研究表明，DNA 甲基化与人类疾病密切相关。 Abstract:DNA methylation is an important epigenetic regulation of gene expression in eukaryotes．It is a kind of enzyme catalysis modification process: refers to the chemical modification process of DNA methyltransferase catalysis，the transfer of methyl groups onto cytosine carbon atom 5，making them into 5-methyl cytosine．In humans and other mammals，the modification process usually occurs in 5＇CpG -＇dinucleotide cytosine．A large number of relevant studies have shown that DNA methylation is closely related to human diseases． 关键词: DNA 甲基化; 甲基转移酶;表观遗传学; CpG 岛; Dnmt1; Dnmt3a; Dnmt3b; 基因沉默; DNA甲基化结合蛋白; 人类表观基因组计划 Key words:DNA methylation; Methyltransferase; Epigenetics; CpG island; Dnmt1; Dnmt3a; Dnmt3b ; Gene Silencing ;MBD; human epigenomeproject 表观遗传学研究的是不改变DNA 的一级结构而改变表型的一种基因表达调控机制，主要包括DNA 甲基化、组蛋白修饰、染色体重构、RNA 干扰等。 DNA甲基化是重要的表观遗传修饰之一，在大多数真核生物中广泛存在。DNA 甲基化水平受到环境、疾病、年龄和性别等因素的影响，处于动态的变化过程中。不同的细胞、组织或个体之间，甚至同一细胞或个体的不同发育时期，其DNA 甲基化状态和程度都可能存有差异。 2003 年10 月，人类表观基因组计划委员会正式宣布投资和启动人类表观基因组计划( human epigenomeproject，HEP) 。HEP 的主要目标是研究人类所有基因在主要组织以及200 多种细胞中正常和疾病状态下的甲基化模式，并在基因组水平绘制不同组织正常和疾病状态时的甲基化变异位点图谱[4]，本文结合2013年至今DNA甲基化研究文献，综述了DNA甲基化分布特点和与疾病关系等方面的研究情况。 1.DNA甲基化 1.1DNA甲基化与DNA去甲基化 DNA 甲基化是表观遗传( Epigenetic) 的一种重要表现方式，指在DNA 甲基转移酶( DNA methyltransferase，DMT) 的催化下，以s －腺苷甲硫氨酸( SAM) 为甲基供体，将甲基转移到特定碱基上的过程。 DNA 去甲基化也被称为DNA 甲基化丢失(lossof DNA methylation), 即甲基基团从胞嘧 啶上消失的过程。包含主动去甲基化与被动去甲基化2 种模式。 1.2DNA甲基化分布 DNA 甲基化在生物体内的分布并不是随机的，而是呈现一定的规律性。
DNA甲基化详解
提到遗传，我们都已经习惯于这样的概念，即基因组的编码信息存在于ACGT 这四种碱基的排列顺序中。然而，诸如胞嘧啶的甲基化修饰及其分布，组蛋白的乙酰化等，同样影响着表型。这就构成了表观遗传学(epigenetics)的主要研究内容。其实，早在1942年，C.H.Waddinton就提出了表观遗传学的概念，他指出，表观遗传与遗传相对，主要研究基因型和表型的关系。而现在，对于表观遗传学，比较统一的认识是，其研究在没有细胞核DNA序列改变的情况时，基因功能的可逆的可遗传的改变。也就是说，在不改变基因组序列的前提下，通过DNA和组蛋白的修饰等来调控基因表达，其中又以DNA甲基化(DNA methylation)最为常见，成为表观遗传学的重要组成部分。随着人类基因组计划的开展，科学家们开始在基因组水平来研究表观遗传学，逐步形成表观基因组学(epigenomics)。表观基因组学就是要在整个基因组水平来研究表观遗传过程以及与这些过程密切相关的特定基因组区域的识别与鉴定。2000年10月，人类表观基因组协会(Human Epigenome Consortium)由欧盟赞助，启动了旨在于人类6号染色体MHC区域首先做出DNA的甲基化图谱的先导计划(Pilot Project)。该计划顺利完成，引导启动了2003年的人类表观基因组计划(Human Epigenome Project，HEP)。2005年，美国国家卫生院(NIH)下属的国立癌症研究所启动了癌症基因组先导计划。2006年，该所与国立人类基因组研究所一起共同启动癌症基因组计划(Cancer Genome Project)。表观基因组学和DNA甲基化与癌症的研究成为新的热点。本文将简要介绍DNA甲基化与CpG岛，癌症与DNA甲基化，和DNA甲基化的重要检测方法。DNA甲基化与CpG岛：在人类表观遗传学研究中，最常见的就是CpG二核苷酸中胞嘧啶的甲基化修饰。其主要过程是，在CpG甲基化结合蛋白(Methyl-CpG Binding Proteins,MBDs) 和DNA甲基化转移酶(DNA methyltransferases, DNMTs)的作用下，使CpG二核苷酸5’端的胞嘧啶转变成为5’甲基胞嘧啶。在正常人类的DNA中，约有3-6%的胞嘧啶被甲基化。在哺乳动物中，约有50,000,000个CpG二核苷酸，其中70%的被甲基化。而那些可被甲基化的CpG 二核苷酸并非随机的分布于基因组序列中，相反，在基因组的某些区域中，通常是基因的启动子区域，5’端非翻译区和第一个外显子区，CpG 序列密度非常高，超过均值5倍以上，成为鸟嘌呤和胞嘧啶的富集区，称之为CpG岛(CpG Islands, CGIs)。CpG岛的概念最早由Adrian Bird提出，他称之为
DNA甲基化原理
DNA甲基化 甲基化检测服务-亚硫酸氢钠处理后测序法(bisulfite genomic sequencing PCR, BSP)是利用未甲基化的胞嘧啶可以被亚硫酸氢钠发生脱氨基变为尿嘧啶的原理，用两一特异性引物扩增后测序。测序法克服了只能针对单个位点检测，并且这些位点必须是限制性内切酶识别位点的缺点，可以对任何基因序列的甲基化状态进行检测。 甲基特异性的PCR扩增（MS-PCR）示意图 DNA甲基化（英语：DNA methylation） DNA甲基化是一种表观遗传修饰，它是由DNA甲基转移酶（DNA methyl-transferase, DNMT）催化S-腺苷甲硫氨酸(S-adenosylmethionine, SAM)作为甲基供体，将胞嘧啶转变为5-甲基胞嘧啶（mC）的一种反应，在真核生物DNA中，5-甲基胞嘧啶是唯一存在的化学性修饰碱基。CG二核苷酸是最主要的甲基化位点，它在基因组中呈不均匀分布，存在高甲基化、低甲基化和非甲基化的区域，在哺乳动物中mC约占C总量的2－7％。DNA甲基化是表观遗传修饰的主要方式，能在不改变DNA序列的前提下，改变遗传表现。为外遗传编码（epigenetic code）的一部分，是一种外遗传机制。DNA甲基化过程会使甲基添加到DNA分子上，例如在胞嘧啶环的5'碳上：这种5'方向的DNA甲基化方式可见於所有脊椎动物。在人类细胞内，大约有1%的DNA碱基受到了甲基化。在成熟体细胞组织中，DNA甲基化一般发生於CpG双核苷酸（CpG dinucleotide）部位；而非CpG甲基化则於胚胎干细胞中较为常见。植物体内胞嘧啶的甲基化则可分为对称的CpG（或CpNpG），或是不对称的CpNpNp形式（C与G是碱基；p是磷酸根；N指的是任意的核苷酸）。特定胞嘧碇受甲基化的情形，可利用亚硫酸盐定序（bisulfite sequencing）方式测定。DNA甲基化可能使基因沉默化，进而使其失去功能。此外，也有一些生物体内不存在DNA甲基化作用。
DNA甲基化综述
分子生物学综述 题目：DNA甲基化的研究方法与技术姓名： 班级： 学号：
摘要：DNA 甲基化是表观遗传学(Epigenetics)的重要组成部分，在维持正常细胞功能、遗传印记、胚胎发育以及人类肿瘤发生中起着重要作用，是目前新的研究热点之一。随着对甲基化研究的不断深入，各种各样甲基化检测方法被开发出来以满足不同类型研究的要求。这些方法概括起来可分为三类：基因组整体水平的甲基化检测、基因特异位点甲基化的检测和新甲基化位点的寻找。 关键字：表观遗传学；DNA甲基化；甲基化研究方法 1 导言 早在1942年,C.H.Waddington首次提出表观遗传学(epigenetics)的概念,并指出表观遗传与遗传是相对的,它主要研究基因型和表型的关系。几十年后,霍利迪(R. Holiday)针对表观遗传学提出了更新的系统性论断，也就是人们现在比较统一的认识[1]，即在不改变基因组序列的前提下，通过DNA和组蛋白的修饰来调控基因表达，这种修饰以DNA甲基化最为常见。其主要任务是绘制出人类基因组中甲基化可变位点图谱，即不同组织与疾病状态下，5-甲基胞嘧啶出现及其分布频率的图谱，以指导和系统地研究DNA甲基化在人类表观遗传、胚胎发育、基因印记、等位基因失活及肿瘤发生中的重要作用[2]。DNA甲基化的研究，逐渐成为新的研究热点。随着对甲基化研究的不断深入，各种各样甲基化检测方法被开发出来以满足不同类型研究的要求。让我一一介绍现有的大部分DNA甲基化研究方法，并对其相关特性进行简要分析与总结。
DNA甲基化是最早发现的基因表观修饰方式之一,可能存在于所有高等生物中。DNA甲基化能关闭某些基因的活性，去甲基化则诱导了基因的重新活化和表达。甲基化的主要形式有5-甲基胞嘧啶,N6-甲基腺嘌呤和7-甲基鸟嘌呤。原核生物中CCA/TGG和GATC常被甲基化，而真核生物中甲基化仅发生于胞嘧啶。DNA的甲基化是在DNA甲基化转移酶（DNMTs）的作用下使CpG二核苷酸5'端的胞嘧啶转变为5'甲基胞嘧啶。这种DNA修饰方式并没有改变基因序列，但是它调控了基因的 表达[3]。脊椎动物基因的甲基化状态有三种：持续的低甲基化状态,如管家基因；去甲基化状态,如发育阶段中的一些基因；高度甲基化状态,如女性的一条失活的X染色体[4]。 1.2 DNA 甲基化的生物学作用 1.2.1 DNA 甲基化与遗传印记、胚胎发育 DNA甲基化在维持正常细胞功能、遗传印记、胚胎发育过程中起着极其重要的作用。研究表明胚胎的正常发育得益于基因组DNA适当的甲基化。例如：缺少任何一种甲基转移酶对小鼠胚胎的发育都是致死性的（Li 等1992年和Okano等1999年）[3]。此外，等位基因的抑制(allelic repression)被印记控制区(imprinting control regions,ICRs)所调控,该区域在双亲中的一个等位基因是甲基化的[4]。印记基因的异常表达可以引发伴有突变和表型缺陷的多种人类疾病。如：脐疝-巨舌-巨大发育综合征(Beckwith-Wiedemann Syndrome, BWS)和Prader-Willi/Angelman综合征等[5]。
DNA甲基化
人类基因组单体型图细胞株中与遗传和基因表达变化有关的DNA甲基化模型 摘要 背景：DNA甲基化是参与基因调控和疾病的一种重要表观遗传学机制，但很 少人知道在个体间甲基化机制存在差异。在这，我们从77个图约鲁巴人的人类基因组单体中测量了22,290 CpG二核苷酸的淋巴母细胞系的甲基化水平，同时也使用了全基因组的基因表达和基因型数据。 结果：通过对超过三百万常见的单核苷酸多态性（SNP）位点的甲基化水平关联的分析，我们确定在173个基因的180个CpG双核苷酸位点与附近的单核苷酸多态性（独联体通常在5 KB内）的错误发现率为10％。在迪斯科相互 作用蛋白2的同源基因B（DIP2B，以前推测在DNA甲基化中发挥作用）中发现SNP rs10876043是最有趣的传输信号，全基因范围内的信号与第一组分的甲基化模式是有联系的。而且我们发现在整体信号联系中只有少量的反式作用。正如预期的那样，通过测量的RNA序列，我们发现基因的启动子甲基化和基因表达水平呈负相关关系。最后，发现有一个显着的SNP位点重叠，均与甲基化与基因的表达水平有关。 结论：我们的研究结果显示在个体间的差异在DNA甲基化方面有很强的遗传成 分。此外，丰富的单核苷酸多态性会影响甲基化和基因表达，为共享机制的一小部分的基因提供了证据。 背景：D NA甲基化在真核生物的基因组起着重要的调节作用。甲基化的改变可以影响转录和表型的变化[1]，但DNA甲基化本身的变化根源，现在仍然知之甚少。大量证据确实存在DNA甲基化的个体差异随着年龄的增长[2,3]，组织[4,5]，物种[6]。在哺乳动物中，DNA甲基化是通过DNA甲基转移酶（转移酶）介导的，是在复制过程中负责重新甲基化和维持甲基化模式。参与合成的甲基化和DNA去甲基化的基因也可以影响甲基化的变化。例如，突变的甲基转移酶DNMT3L[7]和亚甲基四氢酸还原酶MTHFR[8]基因可导致人的血液中DNA低甲基化。这些变化发生在全基因组水平，与遗传变异是不同的，而是有针对性的对基因组区域影响DNA甲基化变异，例如，在H19/IGF2位点的差异性甲基化与遗传多态性有关9]。 最近的证据表明，DNA甲基化的依赖所在基因的序列含量[10?12]。在对家庭与双胞胎甲基化模式的研究中发现有很强的遗传效应，但随机因素和环境因素也有可能发挥重要作用2,14]。最近的工作表明，基因变异可能对所在的甲基化模式有重大影响[5,15-18]，但影响甲基化的遗传变异是何种程度，机制尚不清楚。此外，在DNA甲基化变化的基础上对个体基因表达影响到何种程度，仍然是未知之数。
DNA甲基化和去甲基化的研究现状及思考_邓大君
Hereditas (Beijing) 2014年5月, 36(5): 403―410 https://www.360docs.net/doc/0610679366.html, 综 述 收稿日期: 2014-01-07; 修回日期: 2014-01-27 基金项目:国家自然科学基金项目(编号：30921140311，31261140372)资助 作者简介:邓大君，教授，研究方向：肿瘤病因学和DNA 甲基化研究。E-mail ：dengdajun@https://www.360docs.net/doc/0610679366.html, DOI: 10.3724/SP.J.1005.2014.0403 网络出版时间: 2014-3-3 12:41:25 URL: https://www.360docs.net/doc/0610679366.html,/kcms/detail/11.1913.R.20140303.1241.001.html DNA 甲基化和去甲基化的研究现状及思考 邓大君 北京大学肿瘤医院／研究所, 北京 100142 摘要: DNA 甲基化通过调节基因转录、印记、X 染色体灭活和防御外源性遗传物质入侵等, 在细胞分化、胚胎 发育、环境适应和疾病发生发展上发挥重要作用, 是当前表观遗传学研究的热点领域之一。文章介绍了在过去几年中TET 介导的DNA 羟甲基化及其在早期胚胎发育中的作用, DNA 主动去甲基化及其与被动去甲基化的关系, DNA 甲基化建立及其与组蛋白修饰、染色质构象、多梳蛋白和非编码RNA 结合等关系方面的重要研究进展和存在的问题以及DNA 甲基化的转化应用前景。 关键词: DNA 甲基化; 去甲基化; 表观遗传学; 稳态; 转化研究 DNA methylation and demethylation: current status and future per-spective Dajun Deng Peking University Cancer Hospital and Institute , Beijing 100142, China Abstract: DNA methylation plays important roles in cell differentiation, embryonic development, host adaptations to environmental factors, and pathogenesis through regulation of gene transcription and imprinting, X-inactivation, and de-fense of foreign genetic material invasion, is currently one of the hottest research fields on epigenetics. In the past few years, a number of important findings on DNA methylation have been achieved. These findings include discovery of TETs-catalyzed cytosine hydroxymethylation and its functions in the early embryonic development; the relationship be-tween active and passive DNA demethylation; establishment and maintenance of DNA methylation patterns and their asso-ciations with histone modifications, chromatin configuration, polycomb group proteins and non-coding RNA bindings. DNA methylation has become a new potential biomarker and therapy target. Keywords: DNA methylation; demethylation; epigenetics; homeostasis; translational research DNA 甲基化是指DNA 序列中的腺嘌呤(A)或胞嘧啶(C)碱基在甲基化转移酶的催化下与甲基发生共价结合, 可在细胞分裂过程中传递给子细胞的表 观遗传现象。由DNA 腺嘌呤甲基化酶(DNA adenine methylase, DAM)催化形成的O 6-甲基腺嘌呤(6mA)是一种CTAG 序列复制后维持甲基化, 在细菌表观
DNA甲基化功能汇总
Functions of DNA methylation: islands, start sites, gene bodies and beyond DNA甲基化功能：岛，起始位点，基因体和其他 peter a. jones 摘要DNA 甲基化通常被描述为一个“沉默”的表观遗传标记，的确，5-甲基胞嘧啶的功能最初是在20世纪70年代提出。现在，归功于甲基化绘图的基因组规模的改良，我们可以评估在不同的基因组背景下的DNA甲基化：在基因体上，在调控元件和重复序列上，转录起始位点有或者没有CpG岛。新出现的图片是DNA甲基化功能似乎随背景而改变，DNA甲基化和转录的关系比我们最先认识到的更为微妙。有必要提高我们对DNA甲基化的功能的理解，为了解释这个疾病标记中观察到的变化，比如癌症。 两篇重要的文章在1975年分别表示胞嘧啶残基的甲基化在CpG二核苷酸背景中能作为表 观遗传标记。这些文章提出序列可以被重新甲基化，即甲基化通过一种机制的体细胞分裂 能够被遗传，包括一种能识别半甲基化CpG回文的酶，甲基基团的存在，可以由DNA吉合蛋 白和DNA甲基化直接沉默基因解释。虽然这些关键原则中的几个被证明是正确的，解开DNA 甲基化与基因沉默的关系已被证明是具有挑战性的。 在CpG序列背景下，在动物身上的大部分工作都集中在5-甲基胞嘧啶（5mC。据 报道，在哺乳动物的其他序列的甲基化广泛分布在植物和一些真菌中。在哺乳动物中，非 CpG甲基化的功能目前未知。在这里我主要集中在哺乳动物基因组中的CpG甲基化， 包括在其他动物和植物中观察到的差异的讨论。 理解DNA甲基化的功能需要通过基因组考虑甲基化的分布。超过一半的基因脊椎动 物的基因组包含短（约1 kb ）CpG丰富的区域称为CpG岛（CGIS，其余的基因组因 为CpGs而耗尽。当5mCS过自发或酶胸腺嘧啶脱氨基作用被转换成胸腺嘧啶，认为基 因组的损失是由于甲基化的序列在种族中的脱氨基；认为CGI 存在是因为他们可能是从来 没有或只有瞬时甲基化。然而，有很多关于准确定义CGI 是什么的讨论，虽然在哺乳动物基
DNA甲基化
DNA甲基化 DNA甲基化（DNAmethylation）是最早发现的修饰途径之一，大量研究表明，DNA甲基化能引起染色质结构、DNA构象、DNA稳定性及DNA 与蛋白质相互作用方式的改变，从而控制基因表达。 含义： 在甲基转移酶的催化下，DNA的CG两个核苷酸的胞嘧啶被选择性地添加甲基，形成5－甲基胞嘧啶，这常见于基因的5'-CG-3'序列。大多数脊椎动物基因组DNA都有少量的甲基化胞嘧啶，主要集中在基因5'端的非编码区，并成簇存在。甲基化位点可随DNA的复制而遗传，因为DNA复制后，甲基化酶可将新合成的未甲基化的位点进行甲基化。DNA的甲基化可引起基因的失活，DNA甲基化导致某些区域DNA构象变化，从而影响了蛋白质与DNA的相互作用，甲基化达到一定程度时会发生从常规的B-DNA 向Z-DNA的过渡，由于Z-DNA结构收缩，螺旋加深，使许多蛋白质因子赖以结合的原件缩入大沟而不利于转录的起始，导致基因失活。另外，序列特异性甲基化结合蛋白（MBD/MeCP）可与启动子区的甲基化CpG岛结合，阻止转录因子与启动子作用，从而阻抑基因转录过程。 DNA甲基化主要形成5－甲基胞嘧啶（5-mC）和少量的N6-甲基腺嘌呤（N6-mA）及7－甲基鸟嘌呤（7-mG） 结构基因： 含有很多CpG结构，2CpG和2GPC中两个胞嘧啶的5位碳原子通常被甲基化，且两个甲基集团在DNA双链大沟中呈特定三维结构。基因组中
60%～90%的CpG都被甲基化，未甲基化的CpG成簇地组成CpG岛，位于结构基因启动子的核心序列和转录起始点。有实验证明超甲基化阻遏转录的进行。DNA甲基化可引起基因组中相应区域染色质结构变化，使DNA 失去核酶ö限制性内切酶的切割位点，以及DNA酶的敏感位点，使染色质高度螺旋化，凝缩成团，失去转录活性。 5位C甲基化的胞嘧啶脱氨基生成胸腺嘧啶（C-T转换），由此可能导致基因置换突变，发生碱基错配，如果在细胞分裂过程中不被纠正，就会诱发遗传病或癌症。 酶的分类： 动物中DNA甲基转移酶有两种： 1）DNMT1，持续性DNA甲基转移酶——作用于仅有一条链甲基化的DNA 双链，使其完全甲基化，可参与DNA复制双链中的新合成链的甲基化，DNMT1可能直接与HDAC（组蛋白去乙酰基转移酶)联合作用阻断转录；2）DNMT3a、移酶可能参与细胞生长分化调控，其中DNMT3b在肿瘤基因甲基化中起重要作用。 去甲基化 有两种方式：1）被动途径：由于核因子NF粘附甲基化的DNA，使粘附点附近的DNA不能被完全甲基化，从而阻断DNMT1的作用；2）主动途径：是由去甲基酶的作用，将甲基基团移去的过程。在DNA甲基化阻遏基因表达的过程中，甲基化CpG粘附蛋白起着重要作用。虽然甲基化DNA 可直接作用于甲基化敏感转录因子E2F、CREB、AP2、CMycöMyn、NF2KB、Cmyb、Ets，使它们失去结合DNA的功能从而阻断转录，但是，