流式protocol
收获P3代生长状态良好细胞，0.25%胰酶消化，4 ℃离心，1 000 r/min，5 min。
↓
用PBS(含1%BSA)清洗细胞3次，计数细胞。
↓
各管依次加入单克隆抗体CD29、CD34、CD45、CD90。
↓
同时每管样品设立同型阴性对照。
↓
避光冰上孵育45 min。
↓
用PBS(含1%BSA)洗涤细胞3次，以除去未结合抗体，用500 μL PBS(含1%BSA)重悬细胞，流式细胞仪进行检测分析。
（四个CD抗原分子，四个阴性对照，一个空白对照。九个EP管）细胞一定要足够量，一般要求1×106个细胞。对于直接标记单色样本，应该设置空白对照、阴性对照（同型抗体对照）和待测样本。对于直接标记多色样本，在单色基础上另加补偿对照。阴性对照的设置：在实验过程中，假设做直接标记法，可将实验组细胞，取一管，加上与实验抗体所标记的荧光颜色相同的同型对照来作为阴性对照。空白对照：即不进行任何标记的细胞。但是我们买的是pe和fitc荧光标记的抗体，那一管样品内可以同时加两中不同标记的抗体，那它们的同型对照怎么设置？我们的样品可以放在EP管里面吗？检测时，样品至少需要多少量？
取第3代第3～5d BMSCs，胰蛋白酶-EDTA消化成为单细胞悬液；
↓
PBS（1到2ml）洗三次，离心，1000rpm，5min弃液；
↓
4%多聚甲醛1ml室温下固定40min，1000r/min,离心5min后弃去上清液
↓
PBS（1到2ml）洗两次，离心，1000rpm，5min弃液；
↓
分别加入500ul已经稀释的大鼠CD29、CD34、CD45及CD90单克隆抗体；
↓
避光孵育30min
↓
用PBS洗涤细胞两次，以除去未结合抗体；
↓
用PBS重悬细胞，流式细胞仪进行检测分析。
PBS洗涤细胞的过程中细胞丢失？
解决办法有：（1）尽量采用尖底的离心管和水平离心机（2）离心后尽量用吸管吸取上清，不要倾倒；吸上清时最好残留1mm左右的水膜，不要吸完。（3）离心的转速或时间可稍微增加一点儿（4）每次加抗体时，吸头最好不要接触液面；混匀时最好不要用吸头吹打，以免吸头挂壁带走部分细胞。
Direct flow cytometry (FACS) protocol
General procedure for flow cytometry procedure using a conjugated primary antibody
1. Harvest, wash the cells and adjust cell suspension to a concentration of 1-5 x 106 cells/ml in ice cold PBS, 10% FCS, 1% sodium azide. Cells are usually stained in polystyrene round bottom 12 x 75 mm2 Falcon tubes. However, they can be stained in any container for which you have an appropriate centrifuge e.g. test tubes, eppendorf tubes, and 96 well round bottomed microtiter plates. In general, cells should be centrifuged sufficiently so the supernatant fluid can be removed with little loss of cells, but not so the cells are difficult to resuspend.
We recommend staining with ice cold reagents/solutions and at 4o C, as low temperature and presence of sodium azide prevent the modulation and internalization of surface antigens. Which can produce a loss of fluorescence intensity.
2. Add 0.1-10 μg/ml of the primary labelled antibody. Dilutions, if necessary, should be made in 3%
BSA/PBS (Propidium iodide can also be added at this point for dead cell exclusion).
3. Incubate for at least 30 min at room temperature or 4o C. This step will require optimisation.
4. Wash the cells 3 X by centrifugation at 400 g for 5 minutes and resuspend them in 500 μl to 1 ml of ice cold PBS, 10% FCS,1% sodium azide. Keep the cells in the dark on ice or at 4o C in a fridge until your scheduled time for analysis.
5. For best results, analyze the cells on the flow cytometer as soon as possible.
We recommend analysis on the same day. For extended storage (16 hr) as well as for greater flexibility in planning time on the cytometer, resuspend cells in 1% paraformaldehyde to prevent deterioration
Fixation:
If you need to wait longer than for an hour, you may need to fix the cells after step three. This can preserve them for at least several days. (This will stabilize the light scatter and inactivate most biohazardous agents). Controls will require fixation using the same procedure. Cells should not be fixed if they need to remain viable. There are several methods available, please refer to fixation in the Indirect Staining protocol. The fixation for different antigens will require optimisation by the user.
三、骨髓MSCs 的流式鉴定
1. 取培养的第3 代骨髓细胞，吸弃原培养基，pbs液漂洗2 遍。
2. 每皿加入0.25%胰蛋白酶(含0.02%EDTA)1ml，室温消化2min，用含10%FBS 的DMEM/F12 培养基中和，吹打细胞成悬液。
3. 移入15ml 离心管中，800 转/min×5min，吸弃上清液，
4. PBS 洗涤，800 转/min×5min，2 遍；洗涤完后加入PBS 反复吹打成细胞悬液。
5. 用300 目细胞筛过滤，计数过滤后的细胞数。
6. 按每1×106 个细胞分别移入1.5mlEP 管中，每管分别加入CD34-PE 抗体、CD44-FITC 抗体、CD45-PE 抗体、CD90-FITC 抗体及其同型对照抗体。
7. 避光条件下37℃孵育30min。
8. PBS 洗涤，800 转/min×5min，3 遍。
9. 每管重悬为200μl 细胞悬液，行流式细胞分析。
a)大鼠以10％水和氯醛腹腔麻醉，剂量为O．33~0．36ml／100ml，麻醉满意后仰卧固定于手术台上。
b)手术剪于胸骨剑突处剪开胸腔，“V"字形剪断肋骨，两侧肋骨拉开固定，暴露肺和心脏。
c)50ml注射器吸满生理盐水，连接钝头粗针备用。
d)小心剪开心包膜，尽量避免小血管的损伤，剪开右心耳，同时粗针经心尖刺入主动脉，开始灌注。
e)首先以生理盐水150-200ml经主动脉快速灌注，直至右心耳内流出清亮无色液体，同时肝脏由紫红色变为土褐色。
f）换4％多聚甲醛液继续灌注，约需250ml，前100ml速度快，至出现肌颤后开始缓慢推注，共约需20分钟。
g）触肝脏坚韧，四肢僵硬，灌注成功，开颅取脑置于装有4％多聚甲醛液的标本储存瓶中。h)脑标本在4％多聚甲醛液中固定24小时以上，供病理组织学观察。
流式protocol
收获P3代生长状态良好细胞，0.25%胰酶消化，4 ℃离心，1 000 r/min，5 min。 ↓ 用PBS(含1%BSA)清洗细胞3次，计数细胞。 ↓ 各管依次加入单克隆抗体CD29、CD34、CD45、CD90。 ↓ 同时每管样品设立同型阴性对照。 ↓ 避光冰上孵育45 min。 ↓ 用PBS(含1%BSA)洗涤细胞3次，以除去未结合抗体，用500 μL PBS(含1%BSA)重悬细胞，流式细胞仪进行检测分析。 （四个CD抗原分子，四个阴性对照，一个空白对照。九个EP管）细胞一定要足够量，一般要求1×106个细胞。对于直接标记单色样本，应该设置空白对照、阴性对照（同型抗体对照）和待测样本。对于直接标记多色样本，在单色基础上另加补偿对照。阴性对照的设置：在实验过程中，假设做直接标记法，可将实验组细胞，取一管，加上与实验抗体所标记的荧光颜色相同的同型对照来作为阴性对照。空白对照：即不进行任何标记的细胞。但是我们买的是pe和fitc荧光标记的抗体，那一管样品内可以同时加两中不同标记的抗体，那它们的同型对照怎么设置？我们的样品可以放在EP管里面吗？检测时，样品至少需要多少量？ 取第3代第3～5d BMSCs，胰蛋白酶-EDTA消化成为单细胞悬液； ↓ PBS（1到2ml）洗三次，离心，1000rpm，5min弃液； ↓ 4%多聚甲醛1ml室温下固定40min，1000r/min,离心5min后弃去上清液 ↓ PBS（1到2ml）洗两次，离心，1000rpm，5min弃液； ↓ 分别加入500ul已经稀释的大鼠CD29、CD34、CD45及CD90单克隆抗体； ↓ 避光孵育30min ↓ 用PBS洗涤细胞两次，以除去未结合抗体； ↓ 用PBS重悬细胞，流式细胞仪进行检测分析。 PBS洗涤细胞的过程中细胞丢失？
多线程论文
一．线程的创建： 1. 2. 3.
二．T imer传统定时器： 1. 2. 三．线程互斥技术synchronized:
1.线程安全问题可以用银行转账问题解释。 2. static class Outputer{ public void output(String name){ int len = name.length(); synchronized (Outputer.this){ for(int i=0;i 植物材料的固定、包埋和制片 一、植物材料的固定和包埋 在此过程应注意避免Rnase的污染。所使用的熔蜡管（管盖不能耐受180℃烘，只需高压湿热灭菌即可）、量筒、三角瓶和药勺均需180℃烘5小时以上。所用蒸馏水无需用DEPC处理。所固定的材料越小越好，尽可能切除多余的材料。材料取下后应立即固定。取材后若不能立即固定，则应置于冰上运输。配试剂前请计算一下所需用量，用多少配多少，节约试剂。 300 ml量为例） 1、先打开一个60℃左右的水浴锅。 2、在通风橱中往三角瓶中加入12 g多聚甲醛(终浓度为4%)。 3、用量筒配300 ml PBS缓冲液（30 ml 10×PBS+270 ml水），另加1粒NaOH，盖好锡 箔纸后，轻轻摇动，稍微溶化后置于水浴锅中溶解。 4、完全溶解后，取出，加0.1% Tween-20 (300 ul)和0.1% Triton(300 ul)混匀（包 埋水稻时还要再加3 ml 25%的戊二醛）。 5、置于冰上或4℃冰箱降至室温，然后用硫酸调pH 至7.0。 6、把配制好的甲醛溶液分装到小瓶中，（一般用10 ml的小瓶）。 7、分装好的甲醛溶液应放置在冰浴中当天使用。 二、固定材料 1、取植物新鲜材料，去除不需要的部分至适当大小。注意：所固定的材料越小越好， 尽可能去除无用多余的部分。 2、把取好材料放入冰浴的装有甲醛溶液的小瓶中。注意每瓶中的切块数：太多固定不 好；太少则浪费固定液（固定液:材料≥20:1）。 3、材料放入固定液后，应通过抽真空（1至数分钟，视具体情况而定：尽可能短时间， 以材料沉入固定液中为准），帮助固定液进入组织中，以达到迅速固定植物材料的目 的。抽气减压时，尽量不要使液体过分沸腾。抽真空时，材料一般在固定液中浮起； 抽完真空的材料应该沉入固定液中，有时可能要反复多次抽真空，直至材料沉没在 固定液中。一般抽真空多于5分钟大部份材料还不沉没在固定液中的情况极少见， 如果此情况发生，建议抽真空达10分钟后，继续做步骤4。 4、抽真空后需要更换一次新鲜的固定液。 5、更换新鲜固定液后，材料在4℃过夜。 注意：甲醛有剧毒，因此药品的称取和溶液的配置必须在通风橱中进行！多聚甲醛极易飞散；称取时通风橱可暂不抽风；要避免将多聚甲醛洒落在天平或台面上造成污染，如有洒落，要及 按以下序列对材料进行脱水（水为高压灭过菌的双蒸水）。 0.85% NaCl 冰浴，30 分钟 2、50%乙醇/0.85% NaCl 冰浴，5 小时 3、70%乙醇/0.85% NaCl 冰浴，5 小时 4、85%乙醇/0.85% NaCl 4℃，过夜 50%乙醇后，材料应开始脱色。 /水 4℃，5小时 2、100%乙醇 4℃，5小时 3、100%乙醇 4℃，过夜 注：第三天起，每个脱水步骤时间可延长至一天。两次100%乙醇脱水后，材料应为无色。 清华大学实验动物研究及使用计划（Animal Protocol）（201312版） 此处供IACUC使用： 研究计划编号 批准日期 终止日期 1)为节省审批时间和节约纸张，请首先e-mail本申请书电子版至清华大学实验动物使用与管理委员会（IACUC）工 作邮箱（lac@https://www.360docs.net/doc/088281819.html,）。 2)接收后将由IACUC秘书进行格式审查，假如符合要求，将递交给IACUC委员会所有成员进行审阅。IACUC秘书将 收集修改意见反馈给申请者。时间间隔一般为2周。 3)研究计划被批准后，PI签字后正式生效。请递交一式一份纸质版到实验动物中心1182房间订购动物。 A.管理信息：□初次申请□3年复审，请填写已有的研究计划号：（） 列出在本计划中所有动物实验操作人员： 注：职责可为：课题设计、主要操作、辅助操作、手术操作、小鼠管理等 列出每个人相对于职责，已有的实验经验和资格 B.研究或教学的目的： 以一般非生物医学背景人员为对象，简述研究目的，以及对人类或动物的健康与解决的科学问题。一般只需要以非科学术语描述做什么以及做这个实验的必要性。 C.危险试剂或感染性试剂： □本计划不使用任何有害物质 □本计划使用有害物质，假如使用 危险试剂的使用需要取得清华大学生物安全委员会的认可。危险试剂包括下列几个范畴： □1. 放射性性物质□2. 致癌物/致突变物□3. 感染物质□4. 重组DNA □5. 肿瘤等细胞系□6. 组织或抗血清□7.其他有害物质 1.请详细描述具体的试剂名称、拟使用剂量，以及给药或使用方式： 2. 请详细描述对人或动物的潜在毒性、并简述安全操作和处理受污染动物及材料的方法及程序： AFLP实验流程protocol Step1 DNA提取（DNA extraction） Using CTAB method （这个我们现在都是用试剂盒提取了，不知道你们用什么提取，还是发给你，AFLP对DNA纯度和浓度的要求很高，CTAB很难满足这个要求，尤其是纯度要 求） 1.裂解液的制备：检查水浴锅是否有水，打开设温65℃，将CTAB母液预热溶解，按照每 管1ml的体积取CTAB母液，加入3％PVP（即0.03g/管），加热溶解，使用前 ．．．加入1～2％β-巯基乙醇（即10～20μl/管） 2.取样：称取0.02~0.025g（即20~30mg）硅胶干燥的样品，放入fastprep管中，做好标 记。※NOTE：样品在放入管中时，挑取幼嫩的叶片，尽量不要将叶脉等维管组织放入，切误将一个管中的样品溅入另一个管中。 3.打碎：将称好的样品放入fastprep打碎机中打碎，speed 5.0 time 30s, 取出加入制备好的 CTAB裂解缓冲液800μl/管，（※NOTE：裂解液的体积应该在fastprep管的一半以上，注意盖好管冒，防止裂解液在打碎和裂解的时候溢出。），混匀，使裂解液和样品充分接触，再打一次speed 5.0 time 30s。 4.裂解：水浴65℃，1h，注意在裂解的过程中每隔10min要混匀一次，（※NOTE：越到 裂解的后期动作越要温和，防止DNA剪切破碎。） 5.抽提：取出水浴样品，冷却至室温 ．．．．．，加入-20℃等体积（800μl/管）氯仿：异戊醇（24： 1），手摇晃混合均匀 ．．．．．．．，离心：室温，12000r/min，10min。 6.再次抽提：取上层液体约550μl，（※NOTE：尽量少取，不要将杂质一并取出）转入 一个灭菌1.5ml离心管中，做好标记，加入等体积加入－20℃等体积（800μl/管）氯 仿：异戊醇（24：1），手摇晃混合均 ．．．．．．匀．，离心：4℃，14000r/min，10min。 7.初沉：取上清约。。。μl，转入一个灭菌1.5ml离心管中，做好标记，加入4℃ 0.1倍 体积NaAc （3mol/L pH 5.2）,-20℃ 0.6倍体积异丙醇，-20℃沉淀40min，离心：4℃，12000r/min，10min。 8.干燥：弃上清，用小枪头吸干，在超经工作台中倒置干燥40min。打开水浴锅37℃水 浴锅，预热TE。 9.除RNA： 10.抽提RNAse 11.再沉 12.洗涤 13.干燥 14.溶解 15.检测 Using 试剂盒 基因定点突变试剂盒 产品简介： 碧云天生产的基因定点突变试剂盒(Site-directed Gene Mutagenesis Kit)可 以用于点突变，多个邻近密码子的突变，单个或多个邻近密码子的缺失 (deletion)或插入(insertion)。 本试剂盒是一个利用目前最新的基因点突变技术设计而成的试剂盒。只 需通过基于PCR的突变质粒的合成，和基于Dpn I的模板质粒的消化，转 化培养以及后续的酶切或测序鉴定，即可得到预期的突变质粒(参考图 1)。累计操作时间不足2小时即可完成基因的定点突变。 参考图1，使用本试剂盒时需要先设计长度通常为30个碱基以上的互补的 两个引物，在引物中含有预期的突变位点。然后以待突变的质粒为模 板，用这两个引物进行PCR扩增反应。这样可以产生含有预期的突变位 点的双链质粒，但这个双链质粒中有两个nick位点。待突变的质粒通常来 源于大肠杆菌等细菌，在细菌中会被甲基化修饰，而在体外通过PCR扩 增得到的质粒不会被甲基化。这样用甲基化酶Dpn I处理，可以消化掉待 突变的质粒模板，而使通过PCR扩增出来的含有突变位点的质粒被选择 性地保留下来。这样把Dpn I处理过的产物转化细菌后，质粒中有两个 nick位点可以被大肠杆菌修复，得到的克隆就会含有预期的突变质粒了。 本试剂盒提供了DH5α甘油菌，可用于感受态细菌的制备。 本试剂盒共可以进行十次基因定点突变反应。图1. 基因定点突变试剂盒原理图 保存条件： -20℃保存，一年有效。 注意事项： 需自行配制LB液体培养基和LB平板以用于细菌的培养。 需自行设计和合成用于基因定点突变的引物。需自备用于细菌转化的试剂。 使用本试剂盒前请先阅读后面的常见问题。 为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。 使用说明： 1. 引物设计： 用于特定基因突变的引物需要单独设计，请参考如下一些基本原则进行设计： (1) 共需设计两条互补的引物。可以先集中设计一条，然后就可以得到互补的另一条引物。 (2) 引物的长度通常为25-45个碱基。 (3) 引物中突变位点任何一侧都必需满足 4X(GC碱基数)＋2X(AT碱基数) ≥45。但引物也不宜过长，否则通常会形成非常 稳定的二级结构。通常把突变位点两侧的碱基数控制在15个左右，且使两侧按照上述计算得到的数值相近。 例如引物为agtcaggccaattcg aag cagtcgaattgccaag，其中蓝色的aag为突变位点，则 TRIzol 提取RNA 实验试剂： TRIzol、氯仿、异丙醇、75%酒精、DEPC水 实验用具： 4℃离心机，1mL、200uL、100uL移液器，1.5mL、200uL EP管，一次性手套、口罩等 操作步骤 1. 样品处理 取新鲜或-70℃冻存小鼠视网膜尽量剪碎，每50-100 mg组织加入1 ml TRIzol，匀浆仪进行匀浆处理。（可先加200uLTRIzol直接用移液枪打碎视网膜，再加TRIzol至1mL） 可选步骤：当样品富含蛋白质，脂肪，多糖或是细胞外物质例如肌肉，脂肪组织和植物的块茎部分时可能需要一额外的分离步骤。匀浆化后在2~8°C的条件下以12,000×g的离心力离心10分钟，移除匀浆中不溶解的物质，余下的沉淀中包含有细胞外膜，多糖，以及高分子量DNA，而RNA存在于上清中。对于脂肪组织的样品中，大量的脂肪漂在最上层也应该除掉。吸取上清备用。 2. 将匀浆样品反复吹打几次，在室温条件下静置5min，使蛋白核酸复合物完全分离。 3. 向以上溶液中加入氯仿，每使用1ml TRIzon加入0.2ml氯仿，盖好管盖，剧烈振荡15秒，室温放置2-3min。 4. 4℃12,000 rpm离心15分钟，此时样品分成三层：红色有机相，中间层和上层无色水相，RNA主要在水相中，把水相（约600μl）转移到一个新的离心管（自备）中。 5. 在得到的水相溶液中加入0.5mL异丙醇（每使用1mLTRIzol加入0.5mL异丙醇），颠倒混匀，室温放置10分钟。 6. 4℃ 12,000 rpm离心10分钟，弃上清。 7. 加入75%乙醇（用无RNase的水配制）洗涤沉淀。每使用1 ml TRIzol用1 ml 75%乙醇对沉淀进行洗涤一次。 8. 4℃7500rpm离心5分钟，小心吸弃上清，注意不要吸弃RNA沉淀。 9. 室温放置5分钟，晾干。加入30-100 μl无RNase的水，充分溶解RNA（可55~60℃溶解10min），得到的RNA分装于200uL EP管中（每管10uL）。测浓度后保存在-70℃，防止降解。 注意：沉淀不要过分干燥，以免难于溶解。 免疫共沉淀(Co-IP)Protocol 一、原理： 免疫共沉淀（Co-Immunoprecipitation）是以抗体和抗原之间的专一性作用为基础的用于研究蛋白质相互作用的经典方法。是确定两种蛋白质在完整细胞内生理性相互作用的有效方法。其原理是：当细胞在非变性条件下被裂解时，完整细胞内存在的许多蛋白质－蛋白质间的相互作用被保留了下来。如果用蛋白质X 的抗体免疫沉淀X，那么与X在体内结合的蛋白质Y也能沉淀下来。目前多用精制的prorein A预先结合固化在argarose的beads上，使之与含有抗原的溶液及抗体反应后，beads上的prorein A就能吸附抗原达到精制的目的。这种方法常用于测定两种目标蛋白质是否在体内结合；也可用于确定一种特定蛋白质的新的作用搭档。 其优点为：（1）相互作用的蛋白质都是经翻译后修饰的，处于天然状态；（2）蛋白的相互作用是在自然状态下进行的，可以避免人为的影响；（3）可以分离得到天然状态的相互作用蛋白复合物。缺点为：（1）可能检测不到低亲和力和瞬间的蛋白质－蛋白质相互作用；（2）两种蛋白质的结合可能不是直接结合，而可能有第三者在中间起桥梁作用；（3）必须在实验前预测目的蛋白是什么，以选择最后检测的抗体，所以，若预测不正确，实验就得不到结果，方法本身具有冒险性。 二、准备工作： 预冷PBS，RIPA Buffer，细胞刮子（用保鲜膜包好后，埋冰下），离心机 1. 用预冷的PBS洗涤细胞两次，最后一次吸干PBS； 2. 加入预冷的RIPA Buffer(1ml/107个细胞、10cm培养皿或150cm2培养瓶，0.5ml/5×106个细胞、6cm培养皿、75cm2培养瓶) 3. 用预冷的细胞刮子将细胞从培养皿或培养瓶上刮下，把悬液转到 1.5EP 管中，4℃，缓慢晃动15min（EP管插冰上，置水平摇床上） 4. 4℃，14000g离心15min，立即将上清转移到一个新的离心管中 5. 准备Protein A agarose，用PBS 洗两遍珠子，然后用PBS配制成50%浓度，建议减掉枪尖部分，避免在涉及琼脂糖珠的操作中破坏琼脂糖珠 Western Blot protocol 主要试剂及缓冲液的配制 1). 30%丙烯酰胺： 将29g丙烯酰胺和1g N，N’-亚甲双丙烯酰胺溶于总体积为100ml的水中。搅拌器帮助溶解，滤纸过滤除杂质，避光保存于4度冰箱。 2). 10% SDS： 称量10g十二烷基硫酸钠，加入80ml超纯水中，加热搅拌溶解，加水至100ml室温保存备用。 3).10x蛋白电泳缓冲液： 、188g甘氨酸、10gSDS、加水至1000ml 4).20×转膜缓冲液： Tris 29g，Glycine 144g，SDS 2g 加水定容至1000ml 配制1×转膜缓冲液200ml (甲醇 40ml，20×transfer buffer 10ml，H2O 150ml) 5). Tris ：（注意温度对tris PH值的影响） g Tris 溶于80ml超纯水中，加浓盐酸调PH值，定容至100ml。 · 高温灭菌后室温保存。 6).1M Tris ： Tris 溶于80ml 超纯水，加浓盐酸调PH值，定容至100ml。 高温灭菌后室温保存。 7). 10×PBS： NaCl 80g，KCl 2g，，KH2PO4 ，用盐酸调PH至，加水定容至1000ml 8). 1xPBST% Tween 20)： 10×PBS 100ml，H2O 900ml， Tween 20 50ul 9).10%（W/V）过硫酸铵： 临时配，过硫酸铵溶于1ml 超纯水，4度冰箱保存3天 10). 丽春红染液储存液%（W/V）丽春红，5%（V/V）乙酸)： ，丽春红，冰醋酸2ml，超纯水 38ml 》 11). 封闭液： 5%（W/V）脱脂奶粉溶于1X PBST 中，使用时现配。 12) Stripping buffer (BME 800ul，SDS 2g，TRIS ，HCl调pH至，加水定容至100ml) 操作步骤 1.蛋白制备：10CM细胞平板，90%满度。弃培基，用5ml PBS清洗一遍， 加入1 ml PBS用细胞刮将细胞挂下，移入2 ml EP管中，（将平板 第一章流式细胞仪的结构和原理 第1节流式细胞术发展史 纵观历史，几乎没有哪一门科学技术象流式细胞术这样凝结了众多不同学术背景、不同科研领域科学家的心血。从流式细胞术的发明、改进、革新，到今天在各个领域应用的拓展，每一步都是诸如生物学、生物技术、计算机科学、流体力学、激光技术、高等数学、临床医学、分子生物学、有机化学和生物物理学等学科知识综合运用的结晶。现代流式细胞术更是由于结合了单克隆抗体技术、定量细胞化学技术和定量荧光细胞化学，使其在生物学、临床医学、药物学等等众多研究领域中的应用有了更加突飞猛进的发展。临床流式细胞术发展趋势可归纳为：①流式细胞仪从单纯大型仪器发展为适应各种实际应用的便携式、台式、高分辨率、高质量分选的研究型流式细胞仪；②对流式细胞术检测荧光参数，从采用荧光单色、双色分析发展为多色分析，目前最多可同时检测15 种荧光信号；③从检测参数的相对定量发展为绝对定量；④从检测参数的手动人工分析发展为计算机软件的自动分析；⑤所采用的荧光试剂，从非配套试剂发展为配套的试剂盒试剂。而这一切，就要求我们流式细胞仪使用者和科研人员一定要不断地有意识地学习上述各门学科知识，只有这样才能更好地将流式细胞术应用到生物医学的临床实践和基础科学研究工作中去。 流式细胞术的发展简史： 1930年 Caspersson 和 Thorell 开始致力于细胞的计数； 1934年 Moldaven 是世界上最早设想使细胞检测自动化的人，他试图用光电仪记录流过一根毛细管的细胞数量； 1936年 Caspersson等引入显微光度术； 1940年 Coons 提出用结合了荧光素的抗体去标记细胞内的特定蛋白； 1947年 Guclcer 运用层流和湍流原理研制烟雾微粒计数器； 1949年 Wallace Coulter 提出在悬液中计数粒子的方法并获得专利； 1950年 Caspersson用显微分光光度计的方法在紫外线（UV）和可见光光谱区检测细胞：1953年 Croslannd-Taylor应用分层鞘流原理，成功地设计红细胞光学自动计数器； 1953年Parker和Horst描述一种全血细胞计数器装置，成为流式细胞仪的雏形； 1954年 Beirne和Hutcheon发明光电粒子计数器； 1959年B型Coulter计数器问世； 1965年 Kamemtsky等提出两个设想，一是用分光光计定量细胞成份；二是结合测量值对细胞分类； 1967年 Kamemtsky和Melamed在Moldaven的方法基础上提出细胞分选的方法； 1969年Van Dilla，Fulwyler及其同事们在Los Alamos，NM(即现在的National Flow Cytometry Resource Labs),发明第一台荧光检测细胞计； 1972年 Herzenberg 研制出一个细胞分选器的改进型，能够检测出经荧光标记抗体染色的细胞的较弱的荧光信号； 1975年Kochler和Milstein提出了单克隆抗体技术，为细胞研究中大量的特异的免疫试剂的应用奠定了基础。 从此，大量厂家不断研制生产出各具特色的流式细胞仪，流式细胞术进入了一个空前飞速发展的时代。科学家们、仪器制造商们又纷纷将流式细胞仪的研究焦点转向染料的开发、细胞的制备方法和为提高电子信号的处理能力上来。进入21 世纪，流式细胞术作为一门生 实验方法（Protocol)的检索方法-来自《丁香园》来源：夏叶子的日志 找到一个合适的实验方法，对科学研究有着很重要的意义。对于多数常见的分子生物学方法，我们可以参考分子克隆搞定，但是有时一些特定的方法，就需要自己动手寻找。比如说，如果我要找到一个测定GTPase活性的方法，貌似分子克隆上就没有。这时，就需要用上一些必要的检索技巧。 方法1：https://www.360docs.net/doc/088281819.html,检索 检索式子：GTPase acitivity assay site:edu 这个检索式子中请注意三点：一是https://www.360docs.net/doc/088281819.html,而不是https://www.360docs.net/doc/088281819.html,，二是assay这个词的运用，许多paper中某个特定的实验方法多使用assay这个词，因此该词有助于快速从文献中捞取试验方法（如果搜索实验室网页建议用protocol这个词）；其三，site:edu的限定，可以搜索到美国大学实验室网页上的提供此方法的链接。当然，你可以限定为site：https://www.360docs.net/doc/088281819.html,(英国大学), site:ac.jp（日本), site:fr(法国）。大家别小看这个定位式子，可以淘汰掉商业公司捆绑自己产品的一些所谓protocol。淘汰商业公司实验方法的另一个检索式子是："https://www.360docs.net/doc/088281819.html,"。 方法2：杂志搞定 提供实验方法的网站很多，比如 Nature protocols Nature methods Nucleic Acids Research Methods 等等。这个我就不逐一介绍了。到这些杂志主页就可以搜索到。现在又出现一个视频化的杂志，即https://www.360docs.net/doc/088281819.html,/，专门用视频的方式介绍实验操作。由此联想到，某些比较抽象的或者没有接触过的实验，可以在youtube上搜索视频，更为直观。 方法3: 电子书搞定 很多出版社提供了丛书形式的试验方法，常见的有： Wiley出版社的Current protocols系列（https://www.360docs.net/doc/088281819.html,/browse/?ty pe=CURRENT_PROTOCOL） Springer出版社的Methods系列（原humana press所有），现在也称springer protocols （https://www.360docs.net/doc/088281819.html,/index.vm）； Elsevier出版社也有Methods系列，著名的包括Methods in Enzymology，Methods in C ell Biology等（地址：https://www.360docs.net/doc/088281819.html,/science?_ob=BrowseListURL&_type =title&_title=M&content=journals&content=books&entitle=sub&entitle=nsub&_acct=C0 00050221&_version=1&_urlVersion=0&_userid=10&md5=48002dbf3641bac8f773ee39b e006ff7）； 冷泉港出版社的Protocols系列（https://www.360docs.net/doc/088281819.html,/） 可喜的是，这些电子书大都可以检索到免费的。 比如说，到上述出版社的网页找到这篇文章：“Isolation of endocitic organelles by densit y gradient centrifugation”，我们看到，此文章属于“Methods in Molecular Biology”系列丛书中，“2D PAGE: Sample Preparation and Fractionation”这部分的内容。为此，我们在g oogle中输入： 亚细胞定位 Confocus 一、实验材料 玻片，镊子，75%酒精，细胞转染用物品，PBS，4%多聚甲醛，Trixon-X-100，铝箔，摇床，DAPI染色液，荧光封片液，指甲油，载玻片，激光扫描共聚焦显微镜（型号：ZEISS LSM 510 META），光盘 二、实验原理 亚细胞定位是指某种蛋白或表达产物在细胞内的具体存在部位，如胞核，胞浆内，细胞膜或某一特定细胞器上存在。通常是将目的蛋白与报告基因（如绿色荧光蛋白基因EGFP、红色荧光蛋白基因Dsred等）融合表达，在激光共聚焦显微镜下观察荧光的表达部位从而致使目的蛋白在细胞内的定位。 DAPI，4，6-联脒-2-苯基吲哚，是一种标记细胞核的荧光染料，因其与dsDNA有高度的亲和力，与DNA结合后会发出强烈的荧光。 激光共聚焦扫描显微技术（Confocal laser scanning microscopy）是一种高分辨率的显微成像技术。普通的荧光光学显微镜在对较厚的标本（例如细胞）进行观察时，来自观察点邻近区域的荧光会对结构的分辨率形成较大的干扰。共聚焦显微技术的关键点在于，每次只对空间上的一个点（焦点）进行成像，再通过计算机控制的一点一点的扫描形成标本的二维或者三维图象。在此过程中，来自焦点以外的光信号不会对图像形成干扰，从而大大提高了显微图象的清晰度和细节分辨能力。 三、操作程序与结果判定（结合自己的经验将可能遇到的问题 及解决办法也列出） 1、细胞爬片的处理（24孔板） 细胞爬片可以买专门的爬片（一般直径1cm的正方形玻片正好适合24孔板的大小）用镊子夹取后在酒精灯上过火后轻轻放入细胞板内。此后再接入适量消化好的细胞。 爬片处理：将玻片放入小烧杯，再加浓硫酸处理。处理完后，用ddH20洗。再泡到75%酒精里。 诱导表达 1、挑取含重组质粒的单菌落至５ml LB（含抗性）培养基中37℃过夜培养。 2、按1∶100比例稀释过夜菌，一般将５０μl菌接种到含５ml LB（含抗性）培养基的5 ml试管中, 37 ℃震荡培养至OD600≌0.4－0.8（最好0.6，单抗大约需２－２.5 hr，双抗大约需３－３.５hr）。 3、取部分液体作为未诱导的对照组,余下的加入诱导剂至终浓度作为实验组,两组继续在合适温度下震荡培养４hr。 4、分别取菌体0.5 ml, 离心10000 g × 1 min收获沉淀，用４０μl蛋白loading buffer重悬，混匀，煮沸５min。 5、离心10000 g × 5 min，取上清作为样品,可做SDS-PAGE等分析。蛋白质纯化 亲和层析 一、样品准备 1) 准备细胞，接种，诱导表达。对于实验室用的pET载体表达系列，在细胞OD600=0.4-0.8时，用IPTG诱导1-4小时，可以获得理想的表达效率。收集细胞，置于-20 ℃或立即进行步骤2操作。 2) 用Binding Buffer重悬清洗细胞，混匀，离心收集菌体。再加入1/20细胞生长体积的Binding Buffer，将菌体悬浮起来，混匀，冰上超声破碎细胞。 3) 10000 g，4 ℃离心20－30 min。取上清，置于冰上备用或-20度保存。 二、层析 1) 将处理好的NTA树脂装入合适的层析柱，将样品加到NTA层析柱中，流速控制在0.5-1 ml/min左右，收集流出部分，用于SDS/PAGE分析蛋白质的结合情况。 3) 用大约5倍柱体积的Binding Buffer洗，流速控制在0.5-1 ml/min左右，直到紫外监测数值基本无变化 4) 分别用2－5倍柱体积的梯度Elution Buffer洗脱，咪唑浓度分别为40mM，60mM，80mM，100mM，120mM，500mM。流速控制在0.5-1ml/min左右，收集洗脱液。待清楚纯化条件后，就可只使用2个咪唑梯度纯化。 5) 确定目标蛋白质在洗脱液中的分布情况。最为有效的方式是SDS/PAGE分析。 6) 目标蛋白质需要进一步纯化需要根据蛋白质的用途确定。纯化的目标蛋白质的保存条件需要根据蛋白质的性质和用途确定。 三、柱材料处理 1）用大约10倍柱体积的Strip Buffer洗，流速1 ml／min。 2）用大约10倍柱体积的ddWater洗，流速1 ml／min。 3）用大约10倍柱体积的Charge Buffer上镍，流速1 ml／min。4）用大约5倍柱体积的ddWater洗，流速1 ml／min。 5）用大约10倍柱体积的Binding Buffer平衡，流速1 ml／min。四、附件：溶液配方 Binding Buffer https://www.360docs.net/doc/088281819.html, Springer Protocols 實驗室指南 全世界內容最全面，並且經過同儕評閱的生命科學實驗室指南資料庫 7 超過18,000個實驗室指南， 每年新增2,000個 7 所有內容均源於實踐驗證， 包括：《分子生物學方法》 (Methods in Molecular Biology) 7 SpringerProtocols平臺提供 基於Web 2.0的合作研究功能 https://www.360docs.net/doc/088281819.html, Springer Protocols 實驗室指南： 廣泛的內容，可靠的來源，Springer Protocols是 生命科學研究者的無價資源。 出色的科學家一定會提出正確的問題，而且他們會通過設計恰當的實驗來獲得答案。這正是實驗室指南能夠給予幫助的地方。它可以提供確定的、可靠的和可信賴的實驗程式，而這些程式能夠讓使用者對實驗結果充滿信心。 —編輯 John M. Walker 《分子生物學方法》 (Methods in Molecular Biology)Springer Protocols包含18,000多個分子生物學 和生物醫學的實驗室指南，其中很多都是來 自經典的叢書系列，例如：《分子生物學方 法》(Methods in Molecular Biology)。 使用Protocol的研究者們希望得到可快速瀏 覽、值得信賴的線上資源。這些內容必須有很 高的學術認可，可以在實驗室“再現”。 我們鄭重向您推薦 Springer Protocols！ Protocol 歷史 John M.Walker是Protocol的鼻祖，他是第一位通 過生物醫學實驗室指南(Protocol)按部就班地介 紹實驗方法，並使其成為標準的人。幾十年來， 分子生物學領域的學者們一直依賴著由Walker 博士編輯的實驗室研究指南：《分子生物學方 法》(Methods in Molecular Biology)。這些內容 經受了非常嚴格的實踐檢驗，倍受研究人員稱 讚。 Springer Protocols 現在，在https://www.360docs.net/doc/088281819.html,數据庫平臺和 https://www.360docs.net/doc/088281819.html,平臺上，您可以輕鬆訪問這些 由Walker博士編輯，實驗研究領域必不可少 的“處方”— Springer Protocols。 其他享有很高聲譽的Protocols包括： 7 Methods in Molecular Medicine 分子醫學方法 7 Methods in Biotechnology 生物技術方法 7 Methods in Pharmacology and Toxicology 藥理 學與毒物學方法 7 Neuromethods 神經方法 Springer Protocols 可以在 SpringerLink 的平臺瀏 覽。SpringerLink平臺收錄了1,700多種同行評 議的期刊，以及不斷擴充的電子書、電子叢 書、電子參考書和線上回溯性資料。Springer Protocols可以與這些內容合併檢索。 Springer Protocols 也可以作為一個獨立資料庫 瀏覽。https://www.360docs.net/doc/088281819.html, 平臺擁有web 2.0 特色，為生命科學研究者提供基於社區形式 的合作方式。使用者可以對自己關注的實驗 室指南添加注釋，使得同行從他的經驗中受 益。整個平臺內容框架設計出色，提供在實 驗室指南內、外部的快速導航，用戶可以便 捷地找到所需內容。由於這個網站內容來源 於Springer出版社，研究者可以信賴這些內容 的穩定性，並通過Springer出版社進一步瞭解 不斷擴充的內容。 產品特色一覽 7最大的線上實驗室指南的集合。超過18,000 種實驗室指南、每年遞增2,000種。包括當前 最新實驗室指南和可供選擇的版本。 什麼是實驗室指南（Protocol）? 實驗室指南：詳細、精確地實驗操作記錄，主要為生物化學、分子生物學、以及生物醫學等學科。 7 實驗室指南是一種標準化的，並可在實驗室再現的“配方”或“方法” 7 包括按部就班的操作步驟、實驗必需的原材料清單（原材料包括化學成分、硬體、軟體等 等） 7 包括注釋和提醒，提醒實驗員在實驗過程中需要注意的事項，以及如何解決問題 2 For life science research only. Not for use in diagnostic procedures. System Technical Note No. 3 / February 2010 General Cell Migration Protocol Using the CIM-Plate 16 Cell Migration Assay Using the CIM-Plate 16 with the RTCA DP Instrument 1. Protocol Reagents 1.1 ?HeLa and HT-1080 cells, purchased from ATCC and at 60% – 80% con? uence at the time of detachment T he ultimate success of the migration experiments is dependent upon cell culture conditions prior to the assay and conditions used for detaching the cells from the ? ask. The number of cells used in a migration experiment will ultimately depend on the cell type being used. It is imperative to conduct preliminary experiments and determine the optimal cell number for each cell line. We recommend initially seeding cells in the range of 10,000 – 80,000 cells in a ? nal volume of 100 μl. ?T rypsin-EDTA solution for cell detachment, or Non-enzymatic Cell Dissociation Solution (Sigma Cat. No. C5789) for cells that may be especially sensitive to enzymatic methods of cell detachment I f using the protease method for cell detachment, it is important to minimize the time of incubation with the detachment solution. Cell surface receptors (such as integrins) play an important role in cell migration and it is important to conserve the number and integrity of these receptors on the cell surface as much as possible. ?TNS solution (Clonetics, Cat. No. CC-5002) ?Serum-free medium (SFM), i.e., the same media that the cells are cultured in, without the serum C ertain cell types are sensitive to total absence of serum and it may be necessary to include some serum in the SFM. We recommend testing a range of 0.1% to 2% serum. Alternatively, the SFM can be supplemented with bovine serum albumin (BSA) in the range of 0.25% to 0.5%. It is important to use highly pure forms of BSA and not the crude fraction product which may contain factors that could affect cell adhesion and migration. We recommend using 30% BSA stock solution from Sigma (Cat. No. A9576). ?Phosphate buffered saline (PBS), HyClone (Cat. No. 3002201) ?C hemotaxis inducer, typically SFM supplemented with serum in the range of 5% to 10%, conditioned ? broblast media, or SFM supplemented with chemotactic agents such as growth factors I f low serum or BSA was used as part of the SFM, it may be important to add the chemotactic factor to the same media. 1.2 Equipment ? ? ? ? 免疫组化（SP 法） 第一天 (5h) 准备：60℃ 烘片2-4h 1. 二甲苯脱蜡1 30min 2. 二甲苯脱蜡2 30min 3. 100% 乙醇 10min 2次 4. 95% 乙醇 3min 5. 85% 乙醇 3min 6. 75% 乙醇 3min 7. ddH 20 1min 2次 轻晃以防掉片 8. 抗原修复： 使用1L 烧杯，9ml 柠檬酸（0.1M 现配）溶液和41ml 柠檬酸钠（0.1M ）加450ml ddH 20（ph=6）罩上锡纸，封烧杯口，扎洞若干，煮沸20min （可先煮沸再放片子，也可以先放片子再一起煮，温度先调至420℃多，煮沸后调到250℃左右，计时15-20min ）之后自然冷却（30-40℃） 9ml 柠檬酸配法：9ml ddH 20加0.18g 柠檬酸。可以直接称取0.18g 柠檬酸加41ml 柠檬酸钠加450ml 水 0.1M 柠檬酸钠配法：29.41g 柠檬酸钠加入1L 蒸馏水中，或14.7g 加入500ml 蒸馏水中 9. 3%H 202孵育10min （200ml ，盒子装，现配，用甲醇稀释30%H 202至3%H 202）以消除内源性过氧化物酶活性（内源性过氧化物酶能与HRP 反应，造成假阳性），PBS 冲洗3min 3次 10. 加试剂A （山羊血清，起到封闭作用）一滴（蓝色）室温孵育10-15min 盖盖防干，倾去勿洗，先甩再擦（试剂A,B,C 放在1号冰箱侧门，擦干玻片，放在湿盒里，盒子两侧不要放玻片，以防接触到盒壁，抗体流出，要求试剂刚好覆盖组织，全部滴完计时10min ，用黄枪头抹匀试剂） 11. 加一抗，4℃过夜，25-50ul 每个组织，一抗用PBS 稀释，4℃放置，加完一抗后，先不要盖盖，放到冰箱里后再盖盖植物(拟南芥水稻)原位杂交详细protocol试验方法
清华大学实验动物研究和使用计划(AnimalProtocol)(201312
AFLP实验流程protocol(精)
定点突变protocol
RNA提取protocol
免疫共沉淀(Co-IP)protocol
Western-Blot-protocol实验步骤
流式细胞仪Protocol
实验方法(Protocol)的检索方法
亚细胞定位实验protocol
蛋白纯化protocol
springer protocol实验室指南
细胞迁移和浸润实验操作 protocol
免疫组化 protocol 方法与原理大全