国产b型流感嗜血杆菌结合疫苗PRP_TT加强免疫效果评价

b型流感嗜血杆菌（Haemophilus influenzae type b，Hib）可引起严重的脑膜炎、肺炎、会厌炎、蜂窝组织炎及骨关节感染。世界卫生组织估计，每年Hib可引起约300万5岁以下儿童患病，其中38.6万患者死亡，30％～40％的Hib脑膜炎患者有神经系统后遗症［1］。Hib结合疫苗于1987年批准上市后，一些国家在短期内几乎消灭了这种疾病，但数年后，在大量人群中

基金项目：科技部疫苗生产关键技术研究开发（2008BA166B01）．作者单位：1中国药品生物制品检定所菌种室（北京100050）；

2兰州生物制品研究所第一研究室（兰州730046）．

通讯作者：谢贵林，E-mail：glxie＠lzsws．gs．bnet．cn 【临床观察】

国产b型流感嗜血杆菌结合疫苗PRP-TT加强免疫效果评价

李亚南1乔瑞洁2李红1刘佳2王浩2史晓玲2叶强1谢贵林2

【摘要】目的评价国产b型流感嗜血杆菌（Haemophilus influenzae type b，Hib）结合疫苗PRP-TT的加强免疫效果。方法分别用安儿宝和呵儿贝两种Hib结合疫苗，对在广西柳州市常住儿童进行3、4、5月龄3针免疫，1年后，进行第4剂加强免疫。分别于3针免疫1年后和加强免疫1个月后采血，分离血清，采用ELISA和体外杀菌实验（Serum bactericidal assay，SBA）分别检测免疫前后血清IgG抗体浓度和加强免疫后SBA抗体滴度。结果安儿宝和呵儿贝疫苗3针免疫1年后，血清IgG抗体几何平均数浓度（Geometric mean concentrations，GMCs）分别为3.17μg／ml和3.00μg／ml，二者差异无统计学意义（P＞0.05）；其中，IgG抗体浓度在1.00μg／ml以上的血清所占的比例分别为79％（62／78）和76％（115／152），二者差异无统计学意义（P＞0.05）。加强免疫后1个月，两种疫苗免疫血清中IgG抗体GMCs分别为71.33μg／ml和65.35μg／ml，二者差异无统计学意义（P＞0.05）；IgG抗体浓度均能100％达1.00μg／ml以上。两种疫苗加强免疫后的血清IgG抗体浓度与各自加强免疫前比较，差异均有统计学意义（P＜0.05）。加强免疫后，两种疫苗免疫血清的SBA抗体滴度分别为5263和4637，二者差异无统计学意义（P＞0.05）。两种疫苗免疫后血清IgG抗体浓度和SBA抗体滴度均具有相关性（r值分别为0.696和0.689，P＜0.05）。结论3针免疫1年后，两种疫苗免疫血清中IgG抗体仍保持较高的水平，第4剂加强免疫后，抗体水平迅速显著升高，100％达1.00μg／ml 以上，且具有有效的体外杀菌功能。

【关键词】嗜血菌，流感，b型；疫苗，结合；免疫接种，加强；免疫效果

【中国图书分类号】R378.4＋1R392-33【文献标识码】A【文章编号】1004-5503（2011）02-0213-04

Immune Effect of a Booster with Domestic Haemophilus influenzae Type b PRP-TT Conjugate Vaccine

LI Ya-nan△，QIAO Rui-jie，LI Hong，LIU Jia，WANG Hao，SHI Xiao-ling，YE Qiang，XIE Gui-lin（△National Institute for the Control of Pharmaceutical and Biological Products，Beijing100050，China）

【Abstract】Objective To evaluate the immune effect of a booster with domestic Haemophilus influenzae type b（Hib）PRP-TT conjugate vaccine．Methods The infants resided in Liuzhou City，Guangxi Zhuang Autonomous Region，China were inoculated with two kinds of PRP-TT conjugate vaccine（Anerbao and Heerbei）respectively，for3times at ages of3，4and5months，and boosted with the same kind of vaccine12months later．The serum samples were collected12month after the3rd dose and one month after the booster，and determined for IgG titers by ELISA and serum bactericidal assay（SBA）respectively．Results The geometric mean concentrations（GMCs）of serum IgG of infants12months after inoculation with3doses of Anerbao and Heerbei were3.17and 3.00μg／ml respectively，which showed no significant difference（P＞0.05）．The percentages of serum samples with antibody con－centration of more than1.00μg／ml were79％（62／78）and76％（115／152）respectively，which showed no significant difference （P＞0.05）．One month after the booster，the GMCs of serum IgG of infants inoculated with the two kinds of conjugate vaccines were 71.33and65.35μg／ml respectively，which showed no significant difference（P＞0.05），while the percentage of serum samples with antibody concentration of more than1.00μg／ml was100％．The serum IgG concentration after booster with each vaccine was signif－icantly higher than that before booster（P＜0.05）.The SBA titers of serum IgG after booster with Anerbao and Heerbei were5263 and4637respectively，which showed no significant difference（P＞0.05）．However，the serum IgG concentrations after inoculation with the two kinds of conjugate vaccines were related to the corresponding SBA titers（r＝0.696，0.689，P＜0.05）．Conclusion The serum IgG12months after inoculation with two kinds of PRP-TT conjugate vaccines for3times remained at high levels，and in－creased rapidly after a booster，all of which reached more than1.00μg／ml and showed effective bactericidal activities in vitro．【Key words】Haemophilus，influenzae，type b；Vaccine，conjugate；Immunization，booster；Immune effect

观察到Hib病例的发生［2］。英国于1992年将Hib 结合疫苗纳入常规免疫计划，之后Hib疾病的发病率下降，但在1998年之后开始上升，且大部分病例发生在完全免疫的儿童中［3］。研究发现，Hib病例的增加既与群体免疫的迅速减弱有关，又与免疫原性较弱的Hib-无细胞百日咳联合疫苗有关［4］。为此，本研究对国产b型流感嗜血杆菌结合疫苗PRP-TT 在3针剂免疫程序的基础上，进行了第4剂加强免疫，并评价其免疫效果。

1.材料与方法

1.1观察对象

选择广西柳州市常住儿童中体检无禁忌证、未接种过Hib结合疫苗的健康婴幼儿共230名。

1.2疫苗

b型流感嗜血杆菌结合疫苗RPR-TT（安儿宝）为法国安万特巴斯德公司生产（批号：U0334，冻干剂型）；b型流感嗜血杆菌结合疫苗RPR-TT（呵儿贝）为兰州生物制品研究所生产（批号：20061104，液体剂型）。两种疫苗多糖含量均为10μg／0.5ml。1.3菌株

流感嗜血杆菌EAGAN菌株由兰州生物制品研究所第一研究室保存。

1.4血清、补体及标准品

体外杀菌实验（Serum bactericidal assay，SBA）阴性质控血清由中国药品生物制品检定所惠赠；SBA阳性质控血清和2份ELISA质控血清由正常人群中筛选获得；乳兔补体购自Pel-free公司；ELISA 标准品NIBSC-UK-EN63QG购自NIBSC公司。

1.5疫苗免疫

将230名观察对象随机分为2组：安儿宝疫苗组（78人）和呵儿贝疫苗组（152人），均按3、4、5月龄的3针免疫程序免疫，3针免疫1年后采血，分离血清，－20℃保存备用，同时接种第4针疫苗，1个月后采血，分离血清，-20℃保存备用。

1.6血清中IgG抗体浓度的测定

采用间接ELISA法。用含2μg／ml Hib PRP-酪胺的包被缓冲液包被96孔酶标板，100μl／孔，4℃过夜；用含20％小牛血清的PBS37℃孵育1h；样品倍比稀释后加入酶标板，100μl／孔，37℃孵育1h；标准品含抗Hib PRP抗体20μg，以其绘制标准曲线，2份质控血清抗体含量分别为2.000和8.987μg／ml；再加入碱性磷酸酶标记的羊抗鼠IgG，37℃孵育1h；加入底物溶液100μl，37℃孵育1h；以50μl终止

液终止反应，酶标仪读取A

405值。

1.7抗体杀菌滴度的测定

采用SBA法［5］。将流感嗜血杆菌EAGAN划线

接种于巧克力平板上，于37℃，5％CO

2

条件下孵育

过夜，用稀释缓冲液悬起细菌，调整浓度至约5×

104个／ml，置4℃备用。在96孔细胞培养板中将血

清系列稀释，每孔10μl；加入工作菌液，每孔20μl，

于37℃，5％CO

2

条件下孵育15min；加入25μl乳

兔补体和25μl稀释缓冲液，37℃，5％CO

2

条件下

孵育60min；取10μl反应混合物涂布于巧克力平

板上，置于37℃，5％CO

2

条件下孵育过夜，计数存

活的细菌数。以加灭活补体不加血清和加未灭活补

体不加血清作为对照，以加未灭活补体的对照计算

杀菌率，杀菌率为50％时的血清稀释度即为体外杀

菌抗体滴度。

1.8统计学分析

应用CurveExpert3.1统计软件，使用四参数曲

线拟合法对ELISA抗体滴度和SBA杀菌滴度进行

分析，使用SPSS11.5统计学软件对实验数据进行配

对t检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2.结果

2.1血清IgG抗体浓度

检测结果显示，在3针免疫1年后，安儿宝和呵

儿贝疫苗免疫后血清IgG抗体几何平均均浓度（Ge－

ometric mean concentration，GMC）分别为3.17μg／ml

（95％可信区间为2.26～4.46）和3.00μg／ml

（95％可信区间为2.64～3.40），二者差异无统计学

意义（P＝0.955）。IgG抗体浓度达1.00μg／ml以

上的血清所占比例分别为79％（62／78）和76％

（115／152），二者差异无统计学意义（P＞0.05）。第

4针加强免疫后1个月，两种疫苗免疫血清IgG抗

体GMCs分别为71.33μg／ml（95％可信区间为

54.78～92.89）和65.35μg／ml（95％可信区间为

59.41～71.89），二者差异无统计学意义（P＝0.998），

血清IgG抗体浓度100％达1.00μg／ml以上。

两种疫苗加强免疫后，血清IgG抗体浓度与各

自加强免疫前比较，在短期内明显升高，分别升高了

23倍和22倍，二者差异无统计学意义（P＞0.05）。

两种疫苗加强免疫后的血清IgG抗体浓度与各自加

强免疫前比较，差异均有统计学意义（P＝2.46×

10－9），加强免疫前，两种疫苗免疫的血清IgG抗体浓

度未达到1.00μg／ml的血清分别占16份和37

份，抗体GMCs分别为0.30μg／ml和0.33μg／ml，

加强免疫后，血清抗体GMCs分别提高了114倍和

126倍，达34.05μg／ml和41.53μg／ml。最少的

提高倍数也分别达6和8倍。加强免疫前后血清IgG 抗体浓度差异均有统计学意义（P ＝2.46×10－12）。2.2抗体杀菌滴度

检测结果显示，加强免疫后1个月，安儿宝疫苗和呵儿贝疫苗免疫血清的SBA 抗体几何平均滴度分别为5263（95％可信区间为4179～6629）和4637（95％可信区间为4082～5266），二者差异无统计学意义（P ＝0.54）。

2.3血清IgG 抗体浓度与SBA 抗体滴度的相关性

Spearman 分析显示，血清IgG 抗体浓度与SBA 抗体滴度之间具有一定的相关性，安儿宝疫苗的相关系数r ＝0.696（P ＜0.05），呵儿贝疫苗的相关系数r ＝0.689（P ＜0.05），见图1。

图1加强免疫后血清IgG 抗体浓度与SBA 抗体滴度的相关性

Fig 1.Correlation of serum IgG concentration to SBA titer after booster

3.

讨论

理想的疫苗应安全、有效，有效包括良好的免疫

原性、保护效率和免疫记忆。呵儿贝疫苗已经临床观察证明了其安全性［6］，本次观察以安儿宝疫苗作为对照，评价呵儿贝疫苗的免疫原性、免疫记忆、抗体体外杀菌功能及预期的长期保护效率。

许多国家已在上世纪80年代末和90年代初，将Hib 结合疫苗纳入国家儿童免疫规划。Hib 结合疫苗的免疫程序多采用1周岁以内3针剂免疫，起始的免疫月龄不等，间隔免疫时间为1或2个月；也有国家在第2年进行1次加强免疫。一般在3～7月龄的3针免疫后，体内抗体在开始几个月内下降较快，以后趋缓；至18月龄，若给予第4针剂加强免疫，免疫反应增强，在随后6个月再次降低［7］。4～18月龄儿童Hib 发病率最高，随着年龄的增长，发病率降低，一般将5岁以下儿童均视为高危人群。本

研究采用3、

4、5月龄的3针基础免疫程序及1年后的第4针加强免疫，充分考虑了抗体变化的特点及Hib 高危人群的发病特点。结果表明，3针免疫1年后，血清IgG 抗体GMCs 仍能保持在3.00μg ／ml ，第4剂加强免疫后1个月，血清IgG 抗体浓度短期内迅速显著升高，平均提高了22倍，达65.35μg ／ml 。加强免疫前，血清IgG 抗体浓度小于1.00μg ／ml 的37名婴儿抗体GMCs 为0.33μg ／ml ，加强免疫后，抗体浓度均大于1.00μg ／ml ，GMCs 达41.53μg ／ml ，

最少的也提高8倍，

平均提高126倍。表明疫苗具有良好的免疫原性，且提示其存在有效的免疫记忆。

SBA 是与革兰阴性菌的疫苗保护力直接相关的一个重要指标［8］。加强免疫后，SBA 的抗体几何平均滴度为4637，其中最低的也达800，表明疫苗具有有效的体外杀菌功能。目前公认预示具有长期保护效率的抗体浓度指标是达1.00μg ／ml 以上［9］。本次观察表明，呵儿贝疫苗加强免疫前，血清IgG 抗体浓度达1.00μg ／ml 的血清所占比例为76％，加强免疫后，血清IgG 抗体浓度100％达1.00μg ／ml 以上。SBA 抗体滴度和IgG 抗体浓度两项指标均间接证明了疫苗具有有效的抗体杀菌功能和良好的预

期长期保护效率。血清IgG 抗体浓度与SBA 抗体滴

度之间具有良好的相关性（r ＝0.689），表明SBA 是非常有效的评价革兰阴性菌疫苗保护效果的替代方

法。

Hib 结合疫苗有效的保护期限，即有效抗体水平持续时间受多种因素的影响。有研究报道，1周岁内接受基础免疫，而未在第2年加强免疫的儿童，3.6岁时抗体GMC 为1.06μg ／ml ，4.5岁抗体GMC 为0.89μg ／ml ［10］。本次观察表明，3针基础免疫1年后的血清IgG 抗体GMC 为3.00μg ／ml ，第4剂加强免疫后，血清IgG 抗体GMCs 达65.35μg ／ml ，与英国研究者的结果相近［11］。本次观察采用第4剂加强免疫，血清抗体浓度大大提高，即使抗体水平随着时间的延长而下降，也能长期保持较高水平，以达到预期的长期保护效果。

Hib 病例在完全免疫的儿童中出现与疫苗有关，应该引起重视，以及时应对。应选用经严格评审的合格疫苗，同时应继续监测抗体水平随时间的变化情况，为制定合适的加强免疫程序提供依据。新近研究表明，Hib 结合疫苗免疫失败，可能发生在任何免疫程序，包括1、2或3针剂［12］。另外，应加强病源监测，关注Hib 结合疫苗免疫后可能出现的非b 型嗜血流感菌引起的病例［13］。

（下转第224页）

◆安儿宝疫苗◇呵儿贝疫苗

S B A 抗体滴度

血清IgG 抗体浓度（μg ／ml ）

1000100000100001001011000

100101

（上接第215页）

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（收稿日期：2010-07-13）

蛋白纯度较高，说明对于含6个组氨酸尾巴的蛋白采用金属鳌合层析进行柱上复性，通过一步纯化即能获得纯度较高的目的蛋白。由电泳图可知，分子筛纯化后，蛋白的浓度有较大提高，同时，分子筛也能将目的蛋白与杂蛋白较好地分开，进一步提高目的蛋白的纯度。此外，仍有小部分蛋白复性失败，形成二聚体或发生二硫键错配的情况。

本文建立了免疫毒素ScFv（anti HER2）-PE38的分离纯化工艺，为进一步的研究奠定了基础。

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（收稿日期：2010-10-13）