第一章 基因工程学案苏教

第一章基因工程

第1课时基因工程的诞生、发展和工具

目标导航 1.说出基因工程诞生的理论与实践依据、发展阶段和基因工程的含义及其主要实验成果。2.举例说出限制性核酸内切酶的作用、特点。3.举例说出DNA连接酶的作用。4.简述质粒的含义、特性及其在基因工程中的作用。

一、基因工程的诞生和发展

1．基因工程是指在______通过人工“______”和“____________”等方法，对生物的基因进行的______和重新组合，然后______受体细胞并使重组基因在受体细胞中______，产生人类需要的____________的技术，又称为________技术。基因工程是在______水平上操作、改变生物的______________的技术，包括基因的______、____________、______以及在受体细胞内的______和______等过程。

2．艾弗里证明了______是遗传物质、沃森和克里克阐明了______________________结构，尼伦贝格等破译了____________，这些都为基因工程的创立作出了重要的理论铺垫，而________________酶和________酶等工具酶、________等载体和________酶的发现，则直接促使了基因工程的诞生。

3．基因工程的诞生和发展经历了三个时期：1973～1976年为______期；1977～1981年为______期；1982年以后为迅猛发展和____________期。1973年，美国科学家科恩和博耶等将________________的DNA分子进行体外重组，并首次实现了在大肠杆菌中的______，创立了________________的新技术——基因工程；不久，又有科学家将第一个____核生物的基因导入大肠杆菌，使大肠杆菌产生了相应的______；1977年，科学家使得生长激素抑制素基因在大肠杆菌中成功表达；1978年，____________在大肠杆菌中成功合成；1979年，____________基因在大肠杆菌中成功表达；1980年，____________基因在大肠杆菌中成功表达……1982年，美国科学家岶米特等采用____________法，将经过重组的带有________________基因的质粒转入小鼠的受精卵内，成功获得带有________________基因的小鼠。该小鼠生长迅速，体型是同一胎其他小鼠的1.8倍，称为______小鼠。这一实验被认为是基因工程的发展史上的一个里程碑。

二、基因工程中的工具——酶与载体

1．限制性核酸内切酶——分子手术刀

(1)来源：第一种限制酶从________________中分离并纯化。

(2)作用：每种限制性核酸内切酶只能识别DNA分子的________________，且在特定位点上切割DNA分子。

(3)切割结果：大部分限制性核酸内切酶在切开DNA双链时，切口处两个末端都带有由若干____________组成的单链，这种单链被称为______末端。

2．DNA连接酶——分子针线

(1)作用：把DNA分子“梯子”的__________________连接起来。

(2)结果：形成一条________分子。

3．载体——运载工具

(1)常用种类：______、________以及一些可以起载体作用的动植物病毒。

(2)质粒：来自于____________中的一种很小的____________分子。

知识点一基因工程的诞生和发展

1．下列关于基因工程的叙述，不正确的是()

A．基因工程的原理是基因重组

B．运用基因工程技术，可使生物发生定向变异

C．一种生物的基因转接到另一种生物的DNA分子上，属于基因工程的内容

D．是非同源染色体上非等位基因的自由组合

2．以下有关基因工程的叙述，正确的是()

A．基因工程是细胞水平上的生物工程

B．基因工程的目的是获得目的基因表达的蛋白质产物

C．基因工程产生的变异属于人工诱变

D．基因工程育种的优点之一是可以定向地使生物产生可遗传的变异

知识点二限制性核酸内切酶和DNA连接酶

3．限制性核酸内切酶Ⅰ的识别序列和切点是—G↓GA TCC—，限制性核酸内切酶Ⅱ的识别序列和切点是—↓GATC—。在质粒上有酶Ⅰ的一个切点，在目的基因的两侧各有1个酶Ⅱ的切点。

(1)请画出质粒被限制性核酸内切酶Ⅰ切割形成黏性末端的过程。

(2)请画出目的基因两侧被限制性核酸内切酶Ⅱ切割形成黏性末端的过程。

(3)在DNA连接酶的作用下，上述两种不同限制酶切割后形成的黏性末端能否连接起来？为什么？

4．下表中列出了几种限制酶识别序列及其切割位点，图1、图2中箭头表示相关限制酶的酶切位点。请回答下列问题：

图1

图2

(1)一个图1所示的质粒分子经Sma Ⅰ切割前、后，分别含有________个游离的磷酸基团。

(2)若对图中质粒进行改造，插入的Sma Ⅰ酶切位点越多，质粒的热稳定性越________。

(3)用图中的质粒和外源DNA 构建重组质粒，不能使用Sma Ⅰ切割，原因是________________________________________________________________________

________________________________________________________________________ ________________________________________________________________________。

(4)与只使用Eco R Ⅰ相比较，使用Bam H Ⅰ和Hind Ⅲ两种限制酶同时处理质粒、外源DNA 的优点在于可以防止________________________________________________________

________________________________________________________________________。

(5)为了获取重组质粒，将切割后的质粒与目的基因片段混合，并加入______________酶。

(6)重组质粒中抗生素抗性基因的作用是为了____________________________________ ________________________________________________________________________。 知识点三 “分子运输车”——载体

5．将ada (腺苷酸脱氨酶基因)通过质粒pET28b 导入大肠杆菌并成功表达腺苷酸脱氨酶。下列叙述错误的是( )

A ．每个大肠杆菌细胞至少含一个重组质粒

B ．每个重组质粒至少含一个限制性核酸内切酶识别位点

C ．每个限制性核酸内切酶识别位点至少插入一个ada

D ．每个插入的ada 至少表达一个腺苷酸脱氨酶分子

6．如图为大肠杆菌及质粒载体的结构模式图，据图回答下列问题：

(1)a 代表的物质和质粒的化学本质相同，都是____________，二者还具有其他共同点，

如：①____________________，②__________________(写出两条即可)。

(2)若质粒DNA 分子的切割末端为—A —TGCGC ，则与之连接的目的基因切割末端应为

______________；可使用________把质粒和目的基因连接在一起。

(3)氨苄青霉素抗性基因在质粒DNA 上称为________________，其作用是________________________________________________________________________。

(4)下列常在基因工程中用作载体的是( )

A ．苏云金芽孢杆菌抗虫基因

B ．土壤农杆菌环状RNA 分子

C．大肠杆菌的质粒

D．动物细胞的染色体

基础落实

1．人们将苏云金芽孢杆菌中的抗虫基因导入棉花细胞中培育成为抗虫棉，这个过程中所利用的主要原理是()

A．基因突变B．基因重组

C．基因工程D．染色体变异

2．下列有关限制酶知识的叙述，错误的是()

A．产生于细胞内，同时可以在细胞外起作用

B．一种限制酶可以识别多种特定的核苷酸序列

C．限制酶作用于两个核苷酸之间的磷酸二酯键

D．微生物中的限制酶对自身DNA无损害作用

3．属于“分子缝合针”的是()

①E·coli DNA连接酶②T4DNA连接酶③DNA聚合酶④解旋酶⑤RNA聚合酶

A．①②③B．①②

C．①②⑤D．②④

4．限制性核酸内切酶Eco RⅠ对DNA的识别序列是GAATTC，当用它处理环状DNA 分子时，可形成()

A．两端相同的线性DNA，有黏性末端

B．两端相同的线性DNA，无黏性末端

C．两端不同的线性DNA，一端有黏性末端，一端无黏性末端

D．两种末端无法判断

5．在基因工程中用来修饰改造生物基因的工具是()

A．限制酶和DNA连接酶

B．限制酶和DNA水解酶

C．限制酶和载体

D．连接酶和载体

6．如图为DNA分子在不同酶的作用下所发生的变化，图中依次表示限制性核酸内切酶、DNA聚合酶、DNA连接酶、解旋酶作用的正确顺序是()

A．①②③④B．①②④③

C．①④②③D．①④③②

能力提升

7．下列关于基因工程的叙述，错误的是()

A．目的基因由载体导入受体细胞

B．限制性核酸内切酶和DNA连接酶是两类常用的工具酶

C．人胰岛素原基因在大肠杆菌中表达的胰岛素原无生物活性

D．载体上的抗性基因有利于筛选含重组DNA的细胞和促进目的基因的表达

8．2008年诺贝尔化学奖授予了“发现和发展了水母绿色荧光蛋白”的三位科学家。如果将绿色荧光蛋白基因的片段与目的基因连接起来组成一个融合基因，再将该融合基因转入真核生物细胞内，表达出的蛋白质就会带有绿色荧光。绿色荧光蛋白在该研究中的主要作用是()

A．追踪目的基因在细胞内的复制过程

B．追踪目的基因插入到染色体上的位置

C．追踪目的基因编码的蛋白质在细胞内的分布

D．追踪目的基因编码的蛋白质的空间结构

9．某科学家从细菌中分离出耐高温淀粉酶(Amy)基因a，通过基因工程的方法，将基因a与载体结合后导入马铃薯植株中，经检测发现Amy在成熟块茎细胞中存在。下列有关这一过程的叙述不正确的是()

A．获取基因a的限制酶的作用部位是图中的①

B．连接基因a与载体的DNA连接酶的作用部位是图中的②

C．基因a进入马铃薯细胞后，可随马铃薯DNA分子的复制而复制，传给子代细胞D．通过该技术人类实现了定向改造马铃薯的遗传性状

10．限制酶是一种核酸内切酶，可识别并切割DNA分子上特定的核苷酸序列。下图为四种限制酶Bam HⅠ、Eco RⅠ、HindⅢ和BglⅡ的识别序列和切割位点：

Bam HⅠEco RⅠHindⅢBglⅡ

↓↓↓↓

GGA TCC GAATTC AAGCTT AGATCT

CCTAGG CTTAAG TTCGAA TCTAGA

↑↑↑↑

切割出来的DNA黏性末端可以互补配对的是()

A．Bam HⅠ和Eco RⅠ

B．Bam HⅠ和HindⅢ

C．Bam HⅠ和BglⅡ

D．Eco RⅠ和HindⅢ

11.通过DNA重组技术使原有基因得以改造的动物称为转基因动物。运用这一技术使羊奶中含有人体蛋白质，下图表示了这一技术的基本过程，在该工程中所用的基因“剪刀”能识别的序列和切点是—G↓GA TCC—，请回答：

(1)从羊染色体中“剪下”羊蛋白质基因的酶是________________。人体蛋白质基因“插入”羊体细胞染色体中时需要的酶是________________。

(2)请画出质粒被切割形成黏性末端的过程图。

—G↓GATCC—

→

(3)人体蛋白质基因之所以能“插入”到羊的染色体内，原因是________________________________________________________________________。

12．请根据下面的实验原理和材料用具，设计实验探究质粒的抗生素基因所控制的抗菌类别。

实验原理：作为载体的质粒须有标记基因，这一标记基因可以是抗生素抗性基因，故有抗生素抗性基因的细菌，其质粒可以选作为载体(抗生素抗性基因一般位于质粒上)。

材料用具：青霉素溶液、10万单位/mL的四环素溶液、菌种、灭菌的含有细菌培养基的培养皿、酒精灯、接种环、一次性注射器、蒸馏水、恒温箱等。

(1)方法步骤：

第一步：取三个含细菌培养基的培养皿，编号1、2、3，在酒精灯旁，用三支注射器分别注入1毫升的蒸馏水、青霉素溶液和四环素溶液，并使之在整个培养皿表面均匀分布；

第二步：__________________________________________________________________；

第三步：将接种后的三个培养皿放入37 ℃恒温箱中培养24小时。

(2)预期结果及结论：

①若1号培养皿中细菌正常生长，2、3号培养皿中细菌不能存活，说明该细菌质粒既无青霉素抗性基因，也无四环素抗性基因；

②________________________________________________________________________

________________________________________________________________________；

③________________________________________________________________________

________________________________________________________________________；

④________________________________________________________________________

________________________________________________________________________。

(3)设置1号培养皿的目的是进行______________________________________________。

综合拓展

13．基因工程中，需使用限制酶切割目的基因和质粒，便于重组和筛选。已知限制酶Ⅰ的识别序列和切点是—G↓GA TCC—，限制酶Ⅱ的识别序列和切点是—↓GA TC—。

(1)根据已知条件和图回答：

①上述质粒用限制酶__________切割，目的基因用限制酶________切割。

②将切下的目的基因片段插入质粒的切口处，还要加入适量的________________。

③请指出质粒上至少要有一个标记基因的理由：__________________________________

________________________________________________________________________。

(2)不同生物的基因可以拼接的结构基础是______________________________________

________________________________________________________________________。

(3)大肠杆菌是首先成功表达外源基因的宿主菌，但不能表达结构复杂的蛋白质，哺乳类细胞、昆虫细胞表达系统虽然能表达结构复杂的哺乳类细胞蛋白，但操作复杂，表达水平低，不易推广使用。基因工程中常选用酵母菌作为受体细胞，请从细胞结构等方面分析用酵母菌作受体细胞能克服上述不足的理由：____________________________________________

________________________________________________________________________。

第1课时基因工程的诞生、发展和工具知识清单

一、1.体外剪切拼接改造导入表达基因产物重组DNA基因遗传性状分离体外重组转移复制表达 2.DNA DNA分子的双螺旋遗传密码限制性核酸内切DNA连接质粒逆转录 3.开始发展实际应用两种不同来源表达定向改造生物真rRNA人胰岛素人生长激素人干扰素显微注射大鼠生长激素大鼠生长激素巨型

二、1.(1)流感嗜血杆菌(2)特定核苷酸序列

(3)特定核苷酸黏性

2．(1)扶手断口 (2)重组DNA 3.(1)质粒 噬菌体 (2)细菌细胞 DNA

对点训练

1．D [基因工程实现了将一种生物的基因与另一种生物的基因组合到同一个体中的愿望，所以这是一种基因重组现象。基因工程是两种生物间的基因重组，而非同源染色体上非等位基因的自由组合仅限于一种生物的一个个体减数分裂过程中。]

思路导引 理解基因工程的概念；回忆必修二基因重组的概念；搞清两个概念间的关系。 知识链接 对基因工程的理解

(1)操作环境：生物体外

(2)优点

①与杂交育种相比：克服了远缘杂交不亲和的障碍。②与诱变育种相比：定向改造生物性状。

(3)操作水平：分子水平。

(4)原理：基因重组。

(5)本质：甲(供体：提供目的基因)――→导入

乙(受体：表达目的基因)，即基因未变，合成蛋白质未变，只是合成场所的转移。

2．D [基因工程是在分子水平上，对DNA 进行设计和施工，按照人们的意愿定向地改造生物性状，创造出符合人们需要的生物类型或生物产品，基本原理应为基因重组。]

思路导引 明确基因工程的含义、优点、操作水平；回忆人工诱变的原理。

知识链接 1.不同基因拼接为重组DNA 的理论基础

(1)DNA 分子的基本单位相同，都是由脱氧核苷酸构成的。

(2)空间结构相同，不同生物的DNA 分子，都是由两条反向平行的脱氧核苷酸长链形成的规则的双螺旋结构。

(3)碱基配对方式相同，不同生物的DNA 分子中，两条链之间的碱基配对方式均是A 与T 配对，G 与C 配对。

2．外源基因在受体细胞内表达的理论基础

(1)基因是控制生物性状的独立遗传单位。

(2)遗传信息的传递都遵循中心法则阐述的信息流动方向。

(3)生物界共用一套遗传密码。

3．(1)

(2)

(3)能。因为上述两种不同限制酶切割后形成的黏性末端是相同的。

解析 限制酶具有专一性，即一种限制酶只能识别一种特定的核苷酸序列并从特定的切点将DNA 分子切开。被限制酶切开的DNA 两条单链切口，如果各含有几个伸出的、可互补配对的核苷酸，这种切口就是黏性末端。两个黏性末端之间，只要切口处伸出的核苷酸间互补，就能在DNA 连接酶的作用下连接起来。虽然限制酶Ⅰ和限制酶Ⅱ识别的序列和切点不完全相同，但是形成的黏性末端是相同的，存在着互补关系，因此在DNA 连接酶的作用下是可以连接起来的。

思路导引 仔细审题，注意酶Ⅰ和酶Ⅱ的识别位点，以及切割后产生的黏性末端的异同。 知识链接 1.限制性核酸内切酶

(1)作用特点：具有专一性，表现在两个方面

①识别双链DNA 中特定核苷酸序列。

②切割特定序列中的特定位点，特定序列表现为中心对称，如Eco R Ⅰ酶的切割序列(如下图)：

(2)作用结果：产生黏性末端或平口末端

①黏性末端：是限制酶在识别序列的中心轴线两侧将DNA 的两条链分别切开形成的，如下图所示：

②平口末端：是限制酶在识别序列的中心轴线处切开形成的。如下图所示：

2．DNA 连接酶

常用的DNA 连接酶

E ·coli DNA 连接酶?????

来源：大肠杆菌作用特点：只连接黏性末端 T 4DNA 连接酶?????

来源：T 4噬菌体作用特点：连接黏性末端和平口 末端

4．(1)0、2 (2)高

(3)Sma Ⅰ会破坏质粒的抗性基因、外源DNA 中的目的基因

(4)质粒和含目的基因的外源DNA 片段自身环化

(5)DNA 连接

(6)鉴别和筛选含有目的基因的细胞

解析 (1)质粒切割前是双链环状DNA 分子，所有磷酸基团参与形成磷酸二酯键，故不含游离的磷酸基团。从图1可以看出，质粒上只含有一个Sma Ⅰ的切点，因此被该酶切割后，质粒变为线性双链DNA 分子，因每条链上含有一个游离的磷酸基团，因此切割后含有两个游离的磷酸基团。(2)由题目可知，Sma Ⅰ识别的DNA 序列只有G 和C ，而G 和C 之间可以形成三个氢键，A 和T 之间可以形成两个氢键，所以Sma Ⅰ酶切位点越多，热稳定性就越高。(3)质粒抗生素抗性基因为标记基因，由图2可知，标记基因和外源DNA 中均含有Sma Ⅰ酶切位点，都可以被Sma Ⅰ破坏，故不能使用该酶剪切含有目的基因的外源DNA 和质粒。(4)只使用Eco R Ⅰ，则质粒和目的基因两端的黏性末端相同，用连接酶连接时，会产生质粒和目的基因自身连接物，而利用Bam H Ⅰ和Hind Ⅲ剪切时，质粒和目的基因两端的黏性末端不同，用DNA 连接酶连接时，不会产生自身连接产物。(5)质粒和目的基因连接后获得重组质粒，该过程需要连接酶作用，故混合后加入DNA 连接酶。(6)质粒上的抗性基因为标记基因，用于鉴别和筛选含有重组质粒的受体细胞。

(2)DNA 连接酶与限制性核酸内切酶的比较

同，一个是切割，一个是连接。

两者的关系可表示为：

5．C [大肠杆菌成功表达出腺苷酸脱氨酶，说明这些大肠杆菌都至少含有一个重组质

粒，A 项正确；作为载体的条件为至少含有一个或多个酶切位点，所以作为载体的质粒至少含有一个限制性核酸内切酶识别位点，B 项正确；作为基因表达载体应包括目的基因、启动子、终止子、标记基因四部分，但并不是每个酶切位点都至少插入一个ada ，C 项错误；由于这些目的基因成功表达，所以每个ada 至少表达一个腺苷酸脱氨酶分子，D 项正确。]

思路导引 ①要明确质粒作为载体所需要具备的条件；②理解基因工程含义。

知识链接 基因进入受体细胞的载体——“分子运输车”

(1)类型????? 最常用载体：质粒其本质是小型环状 DNA ，不是细胞器

其他载体：噬菌体、动植物病毒等

(2)功能：将目的基因导入受体细胞，并能使其在受体细胞中稳定遗传和表达。

(3)应具备的条件

①含复制原点，能在宿主细胞内稳定保存并大量复制；

②有遗传标记基因，可用于鉴定与筛选重组DNA 分子；

③有限制酶的切割位点，便于外源基因的插入。

6．(1)DNA ①能够自我复制 ②具有遗传效应

(2)CGCGT — A — DNA 连接酶

(3)标记基因 供重组DNA 的鉴定和选择

(4)C

解析 本题通过质粒结构的模式图考查质粒的功能和特点，分析如下：

归纳提升 (1)一般来说，天然载体往往不能满足人类的所有要求，因此人们根据不同

的目的和需要，对某些天然的载体进行人工改造。

(2)常见的标记基因有抗生素抗性基因、产生特定颜色的表达产物基因、发光基因等。

(3)作为载体必须具有一个至多个限制酶切点，而且每种酶的切点最好只有一个。因为

某种限制酶只能识别单一切点，若载体上有一个以上的酶切点，则切割重组后可能丢失某些片段，若丢失的片段含复制起点区，则进入受体细胞后便不能自主复制。一个载体若只有某种限制酶的一个切点，则酶切后既能把环打开接纳外源DNA 片段，又不会丢失自己的片段。

(4)注意与细胞膜上载体的区别，两者的化学本质和作用都不相同。

(5)质粒能自我复制，既可在自身细胞、受体细胞内，也可在体外。

课后作业

1．B [将苏云金芽孢杆菌的抗虫基因导入棉花细胞中，通过DNA 转录、翻译合成特定的蛋白质，表现出特定的性状。此题易错选C 。基因工程是一种技术手段，而不是生物学原理，抗虫棉的培育利用的是基因工程这一技术手段使基因发生重组。]

2．B [微生物中限制酶被提取出来之后，可以在细胞外起作用，进行DNA 的切割，例如基因工程中的限制酶的应用就是在细胞外进行的。限制酶作用于两个核苷酸之间的磷酸二酯键，每种限制酶只能识别一种特定的核苷酸序列。]

3．B [“分子缝合针”是指DNA 连接酶。]

4．A [不同限制性核酸内切酶切割位点是不相同的，DNA 分子经限制酶切割产生的DNA 片段末端通常有两种形式，即黏性末端和平口末端。如果是限制酶Eco R Ⅰ，则在它识别序列的中心轴线两侧进行切割，产生黏性末端；如果是限制酶Sma Ⅰ，则在它识别序列的中心轴线处切割，产生的是平口末端。]

5．A [解答本题的关键是“修饰、改造”二词。限制性核酸内切酶(即限制酶)是剪切基因的“剪刀”，DNA 连接酶是将DNA 末端之间的缝隙“缝合”起来的“分子缝合针”。所以修饰改造工具是限制酶和DNA 连接酶。]

6．C [限制性核酸内切酶、DNA 聚合酶、DNA 连接酶三者均作用于磷酸二酯键处，限制性核酸内切酶使键断开，而DNA 聚合酶连接的是单个脱氧核苷酸，DNA 连接酶作用于DNA 片段，解旋酶作用于氢键，使DNA 双链打开，形成DNA 单链。]

7．D [载体上的抗性基因有利于筛选含重组DNA 的细胞，但由于它和目的基因是相互独立的，不能促进目的基因的表达。]

8．C [将绿色荧光蛋白基因的片段与目的基因连接起来组成一个融合基因，将该融合基因转入真核生物细胞内，表达出的蛋白质带有绿色荧光，从而可以追踪目的基因编码的蛋白质在细胞内的分布。]

9．B [限制酶和DNA 连接酶的作用部位都位于①，但两者作用相反，载体具有在宿主细胞中复制的能力，与目的基因结合后，目的基因也会在宿主细胞中一起复制。基因工程的目的就是定向改造生物的遗传性状。]

10．C [从图中可以看出Bam H Ⅰ、Eco R Ⅰ、Hind Ⅲ和Bgl Ⅱ四种限制酶切割出来的黏性末端分别是GA TC 、AA TT 、AGCT 、GATC ，Bam H Ⅰ和Bgl Ⅱ切割出来的黏性末端相同，可以互补配对。]

11．(1)限制性核酸内切酶 DNA 连接酶

(2)

—CCTAG ↑G 用限制性核酸内切酶切割—G GATCC ——CCTAG G —

(3)人的遗传物质(基因)与羊的都为DNA ，其物质组成和空间结构相同

解析 在基因工程中用到的工具酶有限制性核酸内切酶和DNA 连接酶，在对载体和目的基因进行切割的时候，一定要用同一种限制性核酸内切酶，才能切出相同的黏性末端，当插入目的基因时，常用DNA 连接酶在二者之间形成磷酸二酯键。

12．(1)第二步：将接种环在酒精灯上灼烧，并在酒精灯火焰旁对三个培养皿接种

(2)②若仅1、2号中细菌存活，3号中细菌死亡，说明该细菌质粒上有青霉素抗性基因，无四环素抗性基因

③若仅1、3号中细菌存活，2号细菌死亡，说明该细菌质粒上无青霉素抗性基因，有四环素抗性基因

④若1、2、3号中细菌都存活，说明该细菌质粒上既有青霉素抗性基因，又有四环素抗性基因

(3)对照

解析 本实验的目的是探究细菌质粒上的抗性基因。1号培养皿中未加抗生素，不管细

菌质粒上有无抗生素基因，该培养皿中的细菌都能存活，所以是起对照作用的；2号培养皿中加入了青霉素，只有细菌质粒上有抗青霉素的基因，其中的细菌才能存活，否则，其中的细菌就会死亡；3号培养皿中加入了四环素，只有细菌质粒上有抗四环素的基因，其中的细菌才能存活，否则，就会被四环素杀死。注意预测结果时考虑问题要全面，几种可能的情况都应该考虑到，而且每种可能结果要和相应的结论对应起来。

13．(1)①Ⅰ Ⅱ ②DNA 连接酶 ③检测重组质粒(或目的基因)是否导入受体细胞

(2)DNA 结构基本相同(其他合理答案均可)

(3)①单细胞真核生物，含有加工、修饰蛋白质的内质网和高尔基体；②繁殖速度快，能很快得到大量的目的基因；③培养成本低；④容易培养

解析 要形成重组质粒，质粒只能出现一个切口，并且至少保留一个标记基因，因=====GGATCC

CCTAGG 序列在Gene Ⅱ上，因此用限制酶Ⅰ切割，保留Gene Ⅰ标记基因；目的基因必须切割两次，切割后产生的黏性末端能与质粒的黏性末端互补，=====GGATCC CCTAGG 序列中有酶Ⅱ的切割序列，因此用酶Ⅱ，产生的末端互补。

第2课时 基因工程的一般过程与技术 目标导航 1.简述基因工程的一般过程。2.理解基因工程每个步骤的原理、方法和过程。

3.了解以原核细胞、植物细胞和动物细胞为表达体的基因工程的一般过程。

一、基因工程

1．以原核细胞为表达体的基因工程

(1)过程：以原核生物细胞(如大肠杆菌)为重组DNA 表达体的基因工程的“施工”过程主要包括________________、________________、________________、筛选获得目的基因的受体细胞、________________并实现目的基因____________等五大步骤。

(2)图示：

2．以植物细胞为表达体的基因工程——抗软化番茄的培育过程

二、转基因动物生产方法

最常用的方法主要有两种，即________________的方法和____________________法。

三、转基因技术

1．常用的动物转基因技术有______________________和________________。

2．常用的植物转基因技术：____________________技术、基因枪介导转化技术、____________技术。

知识点一目的基因获取的方法

1．下列获取目的基因的方法中需要模板链的是()

①从基因文库中获取目的基因②利用PCR技术扩增目的基因③反转录法④通过DNA合成仪利用化学方法人工合成目的基因

A．①②③④B．①②③

C．②③④D．②③

2．下列有关PCR技术的说法不正确的是()

A．PCR技术是在细胞内完成的

B．PCR技术是一项在生物体外复制特定DNA片段的核酸合成技术

C．PCR技术的原理与DNA复制的原理相同

D．PCR技术的前提是有一段已知的目的基因的核苷酸序列

知识点二制备重组DNA分子和转化受体细胞

3．在用基因工程技术构建抗除草剂的转基因烟草过程中，下列操作错误的是() A．用限制性核酸内切酶切割烟草花叶病毒的核酸

B．用DNA连接酶连接经切割的抗除草剂基因和载体

C．将重组DNA分子导入烟草原生质体

D．用含除草剂的培养基筛选转基因烟草细胞

4．下图为某种重组质粒简图，小箭头所指分别为限制性核酸内切酶Eco RⅠ、Bam HⅠ的酶切位点，amp R为青霉素抗性基因，tet R为四环素抗性基因，P为启动子，T为终止子，ori为复制原点。已知目的基因的两端分别有包括Eco RⅠ、Bam HⅠ在内的多种酶的酶切位点。

据图回答：

(1)将含有目的基因的DNA与质粒分别用Eco RⅠ酶切，酶切产物用DNA连接酶进行连接后，其中由两个DNA片段之间连接形成的产物有______________________、______________________、________________________三种。若要从这些连接产物中分离出重组质粒，需要对这些连接产物进行____________________________。

(2)用上述3种连接产物与无任何抗药性的原核宿主细胞进行转化实验。之后将这些宿主细胞接种到含四环素的培养基中，能生长的原核宿主细胞所含有的连接产物是______________；若接种到含青霉素的培养基中，能生长的原核宿主细胞所含有的连接产物是________________。

(3)目的基因表达时，RNA聚合酶识别和结合的位点是________，其合成的产物是________________。

(4)在上述实验中，为了防止目的基因和质粒表达载体在酶切后产生的末端发生任意连接，酶切时应选用的酶是________________________。

知识点三筛选重组细胞和实现功能表达

5．下图为用于基因工程的一个质粒示意图。用EcoRⅠ限制酶切割目的基因和该质粒，再用DNA连接酶连接形成重组质粒，然后导入大肠杆菌，最后将大肠杆菌放在四种培养基中培养：a—无抗生素的培养基，b—含四环素的培养基，c—含氨苄青霉素的培养基，d—含四环素和氨苄青霉素的培养基。含重组质粒的大肠杆菌能生长的是()

A．a B．a和c

C．a和b D．b和c

6．目的基因导入受体细胞后，是否可以稳定维持和表达其遗传特性，只有通过鉴定和检测才能知道。下列属于目的基因功能表达检测和鉴定的是()

①检测受体细胞是否有目的基因②检测受体细胞是否有致病基因③检测目的基因是否转录mRNA ④检测目的基因是否翻译蛋白质

A．①②③B．②③④

C．①③④D．①②④

知识点四基因工程的全过程

7．回答有关基因工程的问题：

(1)构建基因工程表达载体时，用不同类型的限制酶切割DNA后，可能产生黏性末端，也可能产生______末端。若要在限制酶切割目的基因和质粒后使其直接进行连接，则应选择能使二者产生________(相同、不同)黏性末端的限制酶。

(2)利用大肠杆菌生产人胰岛素时，构建的表达载体含有人胰岛素基因及其启动子等，其中启动子的作用是_________________________________________________________ ________________________________________________________________________。

在用表达载体转化大肠杆菌时，常用________处理大肠杆菌，以利于表达载体进入；为了检测胰岛素基因是否转录出了mRNA，可用标记的胰岛素基因片段作探针与mRNA杂交，该杂交技术称为____________。为了检测胰岛素基因转录的mRNA是否翻译成____________，常用抗原—抗体杂交技术。

(3)如果要将某目的基因通过农杆菌转化法导入植物细胞，先要将目的基因插入农杆菌Ti质粒的______________中，然后用该农杆菌感染植物细胞，通过DNA重组将目的基因插入植物细胞的________上。

8．回答下列有关基因工程的问题：

(1)基因工程中使用的限制酶，其特点是__________________________________。

下图四种质粒含有E1和E2两种限制酶的识别，Ap r表示抗青霉素的抗性基因，Tc r表示抗四环素的抗性基因。

(2)将两端用E1切开的Tc r基因与用E1切开的质粒X－1混合连接，连接后获得的质粒类型有________________。(可多选)

A．X－1 B．X－2 C．X－3 D．X－4

(3)若将上图所示X－1、X－2、X－3、X－4四种质粒导入大肠杆菌，然后分别涂布在含有青霉素或四环素的两种培养基上。在这两种培养基上均不能生长的大肠杆菌细胞类型有________________、________________。

(4)如果X－1用E1酶切，产生850对碱基和3550对碱基两种片段；那么质粒X－2(Tc r 基因的长度为1200对碱基)用E2酶切后的片段长度为__________对碱基。

(5)若将外源的Tc r基因两端用E2切开，再与用E2切开的X－1混合链接，并导入大肠杆菌细胞，结果显示，含X－4的细胞数与含X－1的细胞数之比为1∶3，增大DNA连接酶用量能否提高上述比值？________。原因是_______________________________________ ________________________________________________________________________。

基础落实

1．采用基因工程的方法培育抗虫棉，下列导入目的基因的方法正确的是()

①将毒素蛋白注射到棉受精卵中②将编码毒素蛋白的DNA序列注射到棉受精卵中③将编码毒素蛋白的DNA序列与质粒重组，导入农杆菌，用该细菌感染棉的体细胞，再进行组织培养④将编码毒素蛋白的DNA序列与细菌质粒重组，借助花粉管通道进入受精卵A．①②B．③④C．②③D．①④

2．基因工程是在DNA分子水平上进行设计施工的。在基因操作的基本步骤中，不进行碱基互补配对的是()

A．人工合成目的基因B．目的基因与载体结合

C．转化受体细胞D．实现功能表达

3．下列有关基因工程技术的正确叙述是()

A．重组DNA技术所用的工具酶是限制酶、连接酶、载体

B．为育成抗除草剂的作物新品种，导入抗除草剂基因时只能以受精卵为受体细胞

C．选用细菌作为重组质粒的受体细胞是因为细菌繁殖快

D．只要目的基因进入了受体细胞就能成功表达

4．研究人员想将生长激素基因通过质粒导入大肠杆菌细胞内，以表达产生生长激素。已知质粒中存在两个抗性基因：A是抗链霉素基因，B是抗氨苄青霉素基因，且目的基因不插入基因A、B中，而大肠杆菌不带任何抗性基因，则筛选获得“工程菌”的培养基中的抗生素首先应该()

A．仅有链霉素

B．仅有氨苄青霉素

C．同时有链霉素和氨苄青霉素

D．无链霉素和氨苄青霉素

5．如图为重组质粒的模式图，若结构X是表达载体所必需的，则X最可能是()

A．氨苄青霉素抗性基因B．启动子

C．限制酶D．DNA连接酶

6．用某人的胰岛素基因制成的DNA 探针，能与之形成杂交分子的是( )

①该人胰岛A 细胞中的DNA ②该人胰岛B 细胞中的mRNA ③该人胰岛A 细胞中的mRNA ④该人肝细胞中的DNA

A ．①③④

B ．①②③

C ．①②④

D ．② 能力提升

7．质粒是基因工程中最常用的载体，它存在于许多细菌体内，某细菌质粒上的标记基

因如图所示，通过标记基因可以推知外源基因(目的基因)是否转移成功。外源基因插入的位置不同，细菌在培养基上的生长情况也不同，如图所示外源基因在质粒中可插入的位置有a 、b 、c ( )

8.( )

A ．这三种方法都用到酶，都是在体外进行

B ．①②③碱基对的排列顺序均相同

C ．①②③片段均不含内含子，但含非编码区

D ．方法a 不遵循中心法则

9．人们试图利用基因工程的方法，用乙种生物生产甲种生物的一种蛋白质。生产流程是：甲生物的蛋白质→mRNA ――→①目的基因――→②与质粒DNA 重组――→③导入乙细胞――→④获得甲生物的蛋白质，下列说法正确的是( )

A ．①过程需要的酶是反转录酶，原料是A 、U 、G 、C

B ．②要用限制酶切断质粒DNA ，再用DNA 连接酶将目的基因与质粒连接在一起

C ．如果受体细胞是细菌，可以选用枯草杆菌、炭疽杆菌等

D ．④过程中用的原料不含有A 、U 、G 、C

10.通过基因工程的方法，科学家采用花粉管通道法将毒蛋白基因转入棉花植株并获得成功表达。棉铃虫吃了这种转基因棉花的植株后就会死亡。花粉管通道法是指：利用植物花粉萌发时形成的花粉管通道将毒蛋白基因送入胚囊，进而导入尚不具备细胞壁的合子或早期胚体细胞中，借助天然的种胚系统，形成含有目的基因的种胚。请回答下列问题：

(1)下列所示的黏性末端是由________种限制性核酸内切酶作用产生的。

(2)利用花粉管通道法将毒蛋白基因导入棉花细胞，此过程是基因工程操作步骤中的第

三步，即__________________。获取目的基因时，如果基因比较小，核苷酸序列又已知，则可以通过DNA 合成仪用化学方法直接______________。

(3)该目的基因在导入受体细胞前需要与载体结合，目前经常使用的载体是________________。

11．请回答基因工程方面的有关问题：

(1)利用PCR技术扩增目的基因，其原理与细胞内DNA复制类似(如下图所示)。图中引物为单链DNA片段，它是子链合成延伸的基础。

①从理论上推测，第四轮循环产物中含有引物A的DNA片段所占的比例为________。

②在第________轮循环产物中开始出现两条脱氧核苷酸链等长的DNA片段。

(2)设计引物是PCR技术关键步骤之一。某同学设计的两组引物(只标注了部分碱基序列)都不合理(如下图)，请分别说明理由。

①第1组：_________________________________________________________________；

②第2组：_______________________________________________________________。

(3)PCR反应体系中含有热稳定DNA聚合酶，下面的表达式不能正确反映DNA聚合酶的功能，这是因为______________________________________________________________ ________________________________________________________________________。

(4)用限制酶EcoRⅤ、MboⅠ单独或联合切割同一种质粒，得到的DNA片段长度如下图(1 kb即1 000个碱基对)，请画出质粒上EcoRⅤ、MboⅠ的切割位点。

综合拓展

12．分析有关基因表达的资料，回答问题：

取同种生物的不同类型细胞，检测其基因表达，结果如下图。

(1)基因1～8中有一个是控制核糖体蛋白质合成的基因，则该基因最有可能是基因____________。

(2)如图所示细胞中功能最为近似的是细胞____________________________。

A．1与6 B．2与5

C．2与3 D．4与5

(3)判断图中细胞功能近似程度的依据是________________________________________

________________________________________________________________________。

(4)现欲研究基因1和基因7连接后形成的新基因的功能，导入质粒前，用限制酶切割的正确位置是____________________________________________________________。

(5)下图是表达新基因用的质粒的示意图，若要将新基因插入到质粒上的A处，则切割基因时可用的限制酶是____________。

A．HindⅢB．Eco RⅠ

C．Eco B D．PstⅠ

(6)新基因与质粒重组后的DNA分子导入受体细胞的概率很小，因此需进行__________，才能确定受体细胞已含有目的基因。

(7)在已确定有目的基因的受体细胞中，若质粒的抗青霉素基因缺失了两个碱基，将这样的受体细胞接种到含有青霉素的培养基中，该细胞中可能出现的结果是__________(多选)。

A．抗青霉素基因不能转录

B．基因1和7没有表达

C．基因1和7不能连接

D．质粒上的酶切位置发生改变

第2课时基因工程的一般过程与技术知识清单

一、1.(1)获取目的基因制备重组DNA分子转化受体细胞培养受体细胞功能表达(2)同一种限制性核酸内切酶DNA连接酶筛选转化 2.重组DNA农杆菌不能合成多聚半乳糖醛酸酶抗多聚半乳糖醛酸酶

二、显微注射DNA精子介导的基因转移

三、1.显微注射技术体细胞核移植技术

2．农杆菌介导转化花粉管通道

对点训练

1．D[PCR利用的是DNA双链复制原理，即将双链DNA之间的氢键打开，变成单链DNA，作为聚合反应的模板链。反转录法则是以目的基因转录成的信使RNA为模板，在反转录酶的作用下，先反转录形成互补的单链DNA，再合成双链DNA。①④则不需要模板。] 思路导引熟悉获取目的基因的方法是准确解答本题的关键。

知识链接目的基因获取的几种方法

(1)直接分离：从自然界中已有的物种中分离，如从基因文库中获取。

(2)人工合成目的基因

已知核苷酸序列的较小基因，直接利用DNA合成仪，用化学方法合成，不需要模板。

(3)利用PCR技术扩增目的基因

利用DNA双链复制的原理，在体外将基因的核苷酸序列不断地加以复制，使其数量成指数方式增加。

2．A[PCR技术的场所为细胞外，A错误，B正确；PCR技术的原理与DNA复制相同，C正确；PCR技术需要一小段已知序列的核酸作为引物，D正确。]

思路导引 PCR 技术是根据DNA 复制的原理，在体外快速大量复制DNA 的技术。

RNA ，不能用限制性核酸内切酶切割，A 项错误；DNA 连接酶可以连接具有相同黏性末端的目的基因和载体，B 项正确；受体细胞可以是受精卵和体细胞，也可以是去除细胞壁的原生质体，C 项正确；目的基因为抗除草剂基因，所以未成功导入目的基因的细胞不具有抗除草剂的能力，筛选时应该用含除草剂的培养基筛选转基因细胞，D 项正确。]

思路导引 限制酶切割的为DNA 分子；烟草花叶病毒的核酸为RNA 。

知识链接 (1)重组DNA 分子的制备

①目的基因是指编码蛋白质的结构基因，没有启动子，若只将目的基因导入受体细胞中无法转录。

②目的基因的表达需要调控序列，因而用做载体的质粒插入目的基因时须有启动子，插入后须有终止子。

③目的基因是否导入受体细胞中需要有筛选标记——标记基因。

因此，一个重组DNA 分子的组成至少应该包括：启动子、终止子、目的基因、标记基因。

(2)受体细胞不同转化的方法不同

①转入动物细胞的方法?????

a ：显微注射技术

b ：体细胞核移植技术 ②转入植物细胞的方法????? a ：农杆菌介导转化技术b ：基因枪介导转化技术

c ：花粉管通道技术

(3)目的基因导入受体细胞的结果

上图中发生②与发生①相比，②会使目的基因的遗传特性得以稳定维持和表达，原因是

在进行细胞分裂时，细胞核上的DNA 经复制后平均分配到两个子细胞中，保证了亲子代遗传性状的稳定性，而①细胞分裂时，细胞质是不均分的，子细胞不一定含有目的基因。

4．(1)目的基因—载体连接物 载体—载体连接物 目的基因—目的基因连接物 分离纯化 (2)载体—载体连接物 目的基因—载体连接物、载体—载体连接物 (3)启动子 mRNA (4)Eco R Ⅰ和Bam H Ⅰ

解析 (1)在基因表达载体的构建过程中用同种限制酶来切割目的基因和质粒，使之产生相同的黏性末端，以利于DNA 片段的连接。将切割后的目的基因和质粒，用DNA 连接酶进行连接，它们之间随机连接，可有三种产物：目的基因—载体连接物、载体—载体连接物和目的基因—目的基因连接物。获得DNA 连接产物以后，必须通过筛选才能获得所需的基因表达载体，导入宿主细胞后才能表达获得基因产物。(2)从图中可以看出，目的基因的插入位点在抗四环素基因上，可推知：目的基因—载体连接物的抗四环素基因被破坏，丧失了抗四环素的能力，但保留了抗青霉素的能力；载体—载体连接物既保留了抗四环素的能力也保留了抗青霉素的能力；目的基因—目的基因连接物既无抗青霉素基因也无抗四环素基因，不具备抗性。(3)目的基因表达过程中，RNA 聚合酶首先与启动子结合，指导目的基因转录产生mRNA ，mRNA 再指导蛋白质的合成。(4)从图中可看出抗四环素基因上有两个不同的切割位点，所以在实际操作过程中，为避免切割后的末端任意连接，可用Eco R Ⅰ和Bam H Ⅰ同时对目的基因和质粒进行切割，使同一切割产物的黏性末端不同。

思路导引 发散思维：将同一种限制酶切割后的目的基因与质粒混合后，DNA 片段间的连接方式？注意图示观察：酶切后，哪种抗性基因失活？回忆基因表达的相关知识。

归纳提升 将同一种限制酶切割获得的目的基因和质粒混合后加DNA 连接酶会出现的连接方式有：

(1)自连?

????

目的基因自连质粒自连 (2)片段间的连接????? 目的基因与质粒连接目的基因与目的基因连接

质粒与质粒连接

其中片段间的连接又有两个片段间、三个片段间、多个片段间等。

5．B [如图，在EcoR Ⅰ限制酶的作用下，四环素抗性基因失活，所以导入大肠杆菌后，应使大肠杆菌具有抗氨苄青霉素的能力，而无抗四环素的能力。]

思路导引 质粒上有两个抗性标记基因；由于目的基因的插入导致一个抗性基因失效。 知识链接 重组细胞筛选的方法

(1)插入灭活筛选法：

amp r 氨苄青霉素抗性基因

tet r 四环素抗性基因

tet s 失活的四环素抗性基因

析图：①质粒中amp r 和tet r 完好；②tet r

内部插入外源基因，使该基因失活，变为tet s ；

③将转化的受体细胞涂布在含氨苄青霉素的培养基中培养，获得菌落，这些菌落的大肠杆菌均导入了质粒；④原位影印菌落在四环素的培养基中；⑤对比分析：凡是在氨苄青霉素培养

基中能生长而且在四环素培养基中不能生长的菌落，就是带重组质粒的菌落。

(2)核酸筛选法——核酸杂交法。

(3)蛋白质筛选法——抗原—抗体杂交法。

6．C [目的基因的检测包括：检测转基因生物的染色体DNA 上是否插入了目的基因，方法是用DNA 探针，使DNA 探针与基因组DNA 杂交；检测目的基因是否转录出了mRNA ，方法是用基因探针与mRNA 杂交；最后检测目的基因是否翻译了蛋白质，方法是进行抗原—抗体杂交。]

思路导引 本题为知识拓展考查的内容，先阅读下列知识拓展，再独立完成相关选项的判断思考。

知识拓展 目的基因功能表达的检测与鉴定

目的基因导入受体细胞是否可以稳定维持和表达其遗传特性，只有通过检测与鉴定才能知识，这是检查基因工程是否成功的一步。

mRNA ，最终获得所需要的蛋白质 Ca 2＋ DNA 分子杂交技术 人胰岛素 (3)T-DNA 染

色体的DNA

解析 (1)限制酶能识别特定的DNA 序列，并在特定位点上切割DNA ，形成黏性末端或平口末端；要使目的基因和质粒直接进行连接，应使用同一种限制酶进行切割，使二者产生相同的黏性末端。(2)启动子为DNA 序列，其具有RNA 聚合酶结合位点，能启动转录，

合成RNA ；将基因表达载体导入大肠杆菌时，常用Ca 2＋处理；检测目的基因时，常用分子

杂交技术检测目的基因或相应的mRNA ，或采用抗原—抗体杂交技术鉴定相应的蛋白质。(3)用农杆菌转化法将目的基因导入植物细胞时，首先将目的基因导入农杆菌Ti 质粒的T-DNA 中，再利用农杆菌侵染植物细胞，通过DNA 重组将目的基因插入植物细胞的染色体的DNA 上。

知识链接 基因工程的图解

(1)抗虫棉的培育过程

(2)利用基因工程技术生产凝乳酶的过程