腺病毒的包装和感染PDF
腺病毒的包装，纯化和感染
技术背景：Adeasy系统利用了腺病毒具有的高感染能力，可高度浓缩等优点，并破坏了腺病毒基因组中的早期基因E1，使之成为较为安全、高效的病毒载体。利用带有E1基因的293细胞作为包装细胞，通过倍比扩增，富集病毒颗粒，并通过CsCl梯度离心，透析进行分离纯化。对绝大多数的细胞株可以达到近乎100％的感染效率。但需要指出的是Adeasy同样具有所有病毒载体或转染试剂都不可避免的细胞毒性问题。
所需试剂：
●293细胞；
●重组好的腺病毒质粒；
●Pac I限制性内切酶；
●质粒回收相关试剂；
●细胞培养、转染相关试剂；
●TBS：10mM Tris,0.9%NaCl,pH8.1;
●40%CsCl：28.45g CsCl溶于42.7ml的TBS中，4度保存；
●15%CsCl：9.085g CsCl溶于47.69ml的TBS中，4度保存；
●Beckman离心管：14*89mm，SW41转头；
●Polybrene(sigma)，10mg/ml；
●透析袋：Spectrum Co.（成卷供应，带少量甘油，硫化物与重金属），
MW=8000~14400；
●灭菌甘油。
操作流程：
1.293细胞（E1-transformed human embryonic kidney cells在转染前24小时接种
于1或2个60mm培养盘中，使之在转染时细胞汇合率为50-70%；
2.在转染前，用Pac I处理目的质粒（一般一个60mm细胞盘需要6μg DNA）。
处理后质粒用乙醇沉淀并重悬于20μl无菌水中；
3.用PEI或其他转染试剂将6μg Pac I处理过的质粒转染细胞；
4.8个小时后移去混合液，加入4ml DMEM完全培养液（10%CBS，1%
Pen/Strep）；
5.在转染后7到10天用细胞刮（而不是胰酶）将细胞从瓶中刮下并移入50ml
锥形管。离心后将细胞重悬于2.0ml PBS或全培液中。于液氮中冻结细胞，37℃水浴中溶解，剧烈振荡。此步骤共进行4次。注意保存时不要反复冻融，可保存于-20℃；
6.将293细胞以50-70%的汇合率铺于60mm培养盘中，以30-50%的体积比加
入含病毒上清液。在感染后2-3天即可看到明显的细胞裂解或CPE现象；7.在有1/3到1/2的细胞脱离漂浮时，通常是感染后3-5天收集病毒。可进一
步通过Western blot或PCR（5μl病毒上清加上10μl PCR-grade Protease K，55℃消化1小时，然后煮沸样品5min，离心后取1-2μl进行PCR反应）证实重组腺病毒的存在；
8.按步骤5的方法收集病毒上清。在这种情况下一般至少可收集到107infectious
particles/ml的病毒。每轮的扩增应能提高一个数量级的梯度；
9.为了进一步扩增，将步骤8获得的病毒上清进一步感染100mm培养盘的细
胞，按步骤5的方法收集病毒，并进而将其感染150mm细胞培养盘中的293细胞，以获得足够量的病毒；
10.将15%CsCl和40%CsCl加入Beckman离心管中制备CsCl梯度溶液；
11.将最终富集病毒颗粒的病毒上清滴加于CsCl梯度溶液上；
12.超速离心，30000rpm，4度离心16个小时；
13.离心后，应有两条带。位置较高，颜色较弱的条带主要为腺病毒空壳，不具
感染能力；位置较低，颜色较亮的条带含有我们需要收集的活病毒颗粒。用16号针头将这一条带收集；
14.在TBS中透析一小时，随后在含有10％甘油的TBS中透析两次，每次一小
时；
15.将纯化的腺病毒分装于EP管中；
16.在Eppendorf Biophotometer中测量透析液中的总蛋白量，1μg病毒蛋白相当
于4×109病毒颗粒；
17.长期保存于-70度中，短期可保存于4度，切忌反复冻溶；
18.由于腺病毒对不同细胞株的感染效率存在差异，且考虑到病毒颗粒的细胞毒
副作用，通常通过梯度感染的方法确定所需的病毒用量。以相对细胞数1：1，10：1，100：1，1000：1的病毒颗粒感染靶细胞；加入相对培养液体积1：1000的Polybrene。在37度下平板离心30分钟；
19.感染8~12小时后换液。将含有病毒的培养液小心移入含有消毒液的废液缸
中，加入适量全培液。
参考文献：
1．https://www.360docs.net/doc/414641370.html,A，V ol.95,pp.2509–2514,March1998，A simplified system for generating recombinant adenoviruses.
2．Current Protocols in Human Genetics(2004)12.4.1-12.4.25.
包装产品注意事项
包装产品注意事项 产品包装注意事项包装产品的性能，主要包括产品的物态、外形、强度、重量、结构、价值、危险性等，这是进行包装时首先应考虑的问题。 ①产品物态。主要有固态、液态、气态、混合等，不同的物态，其包装容器也不同。 ②产品外形。主要有方形、圆柱形、多角形、异形等，其包装要根据产品外形特点进行设计，要求包装体积小、固定良好、存放稳定、且符合标准化要求。 ③产品强度。对于强度低、易受损伤的产品，要充分考虑包装的防护性能，在包装外面应有明显的标记。 ④产品重量。对于重量大的产品，要特别注意包装的强度，确保在流通中不受损坏。 ⑤产品结构。不同产品，往往结构不同，有的不耐压，有的怕冲击等。只有对产品结构充分地了解，才能对不同产品进行合适的包装。 ⑥产品价值。不同产品，价值差异很大，对价值高者应重点考虑。 ⑦产品危险性。对易燃、易爆、有毒等具有危险性产品，要确保安全，在包装外面应有注意事项和特定标记。 (2) 环境对产品的影响 产品在流通过程中，会遇到不同环境，它们对包装会产生不同影响，故应采取相应措施。 ①气象条件。主要有、温度、湿度、雨雪和空气等，它们对不同产品的影响也不同，这都需要针对不同气象条件分别加以考虑。 ②装卸条件。应考虑是人工装卸还是机械装卸，以及装卸次数等条件。 ③运输条件。产品在运输过程中，会受冲击、振动等作用，且不同的运输工具，对包装的影响也不同。主要应考虑产品固定与缓冲。 ④贮存条件。贮存多用堆码，包装应考察其耐压强度。另外，贮存还分室贮存和室外贮存，前者要注意防潮、防霉、防水等;后者要注意防雨雪、防、防风等。 (3) 包装方式的选择
包装方式的选择对产品保护甚为重要，只有对产品性能及流通条件作全面了解，制定几种方案，进行经济评估，才能找到合适的包装方式。 ①选择包装材料。根据产品性能选择与之相适应的包装材料来制作包装容器，同时选择合适的附属包装材料来包装产品。 ②选择包装方法。根据对产品保护强度的要求，使用方便，便于机械装卸和运输等来选择适当的包装工艺和包装方法。 常用的包装技法有哪些物品的种类、品种极多，流通条件也有很大差异，故包装技法种类很多，常用的有以下几种： (1)防潮包装 防潮包装是采用具有一定隔绝水蒸气能力的材料对物品进行包封，隔绝外界湿度对产品的影响，或在包装容器加干燥剂，以吸收包装残留潮气和由外界透人的潮气。 (2)防水包装 防水包装是为防止因水侵入包装容器而导致容物发生变质、损坏所采取的一定防护措施的包装。 (3)防锈包装 防锈包装是为防止包装金属物品的锈蚀损坏而采取的一定防护措施的包装。 (4)防霉包装 防霉包装是为防止含有机物物品在受霉菌作用时发生霉变和腐败，使物品质量受到损害而采取的一定防护措施的包装。 (5)防尘包装 防尘包装也称密封包装，是为防止粉尘进入包装容器影响产品质量的一种包装。 (6)收缩包装 收缩包装是用热收缩薄膜裹包物品或包装件，然后加热使薄膜收缩，从而包紧物品或包装件的一种包装。
纸塑包装材料的使用与注意事项
纸塑包装材料使用注意事项 一．结构 纸塑包装袋一般由两面组成，一面是透过和排放灭菌因子的纸，一面是不能渗透液体、空气和气体的透明复合薄膜（塑料膜），透明复合薄膜至少由两层（聚丙烯内层和聚酯外层）构成。空气消毒因子的交换在纸的一侧进行，由于材料的原因，同样具有良好的微生物屏障功能，而且塑面对包内物品可视，使包装物品一目了然和具有良好的抗渗能力。 二．优点：包内物品可视，良好的微生物屏障功能，良好的抗渗能力，可根据包装器械物品的长短、大小，选择规格合适纸塑包装进行裁剪，可用于高压蒸汽、环氧乙烷灭菌并在包装上印有两种化学变色指示区(EO灭菌前是粉红色，灭菌后变为黄色；高压蒸汽灭菌前是蓝色，灭菌后变为黑色) 三．缺点：临床科室存放备用的纸塑无菌包，易出现褶皱和封口裂开，包装硬质物时干燥性差，个别出现内塑面上滞留水珠，锐器易刺破纸塑袋的包装。2009年规范中规定仅用于单个器械的包装，平面卷带一般建议用于厚度不大于5CM 的物品。目前是医院广泛采用的产品，但其因存在单面透气，一些金属类器械在灭菌过程易产生冷凝水，纸塑包装袋不能用于下排气式灭菌器。 四．使用注意事项 1.纸塑袋包装使用封口机时, 应注意检查封口日期是否准确, 物品封口后 注意检查日期有效性。字迹变浅时, 及时增加打印机油墨。医用封口机的温度一般为180℃，使聚丙烯熔化为液态把薄膜挤入纸张纤维；纸塑包装的封纹宽度应≥６ｍｍ，封口必须同一连续形态，平整无皱褶,无气泡或者漏道。2.包装时要检查包装物品的清洁度和干燥度，高压蒸汽灭菌时器械清洗干燥不 完全，残留的油和水分容易浸湿纸面而造成湿包。 3.对尖锐器械部位进行保护，如尖剪等应用硅胶管或橡胶管套上，防止刺破纸 塑包装，导致灭菌失败； 4.纸塑袋必须合适裁剪和正确使用，以便去除空气，灭菌剂渗透，干燥。排出 不利的空气将成为热和水汽的障碍，所以密封前应去除尽可能多的空气。此外，包装袋不能装的太满，拉伸纸塑包装袋可能会在灭菌或搬动时导致纸张撕裂或封条破裂；另外器械挤满包装袋，袋内没有一定的空间，不利于蒸汽
腺病毒详解
腺病毒是一种无包膜的双链DNA病毒，基因组长约25-45kb，理论上可编码22-40个基因。衣壳（capsid）呈规则的20面体结构，直径约80-110nm。衣壳含有240个六联体（hexon）、12个五联体（penton）及12根纤毛（fiber），除此之外还有其他一些小蛋白，如VI、VIII、IX、IIIa和IVa2等。六联体是形成病毒衣壳20个三角形面的主要蛋白，12个顶端是5个五联体亚单位和3个纤毛蛋白构成的复合物，12根纤毛以五联体蛋白为基底由衣壳表面伸出，纤毛顶端形成头节区（knob）。五联体和纤毛的头节区可与细胞表面的病毒受体结合，在病毒感染细胞过程中起着非常重要的作用。 腺病毒含13%DNA和87%的蛋白质，病毒体分子量约为175×106。病毒基因组为线状双链DNA，大约含35kb～36kb，腺病毒12、18 和31型的DNA组成中，G+C mol%最低（48%～49%），属于对动物具有高致癌性基因型。腺病毒1、2、4、5、8等型的G+C mol%较高（61%），致癌性反而低或无。这是一种用于人腺病毒分离株的分组的标准，根据其基因同源性将人腺病毒分为A～F等6组。 腺病毒的基因组以线性的双链DNA形式存在，由蛋白VII和一种称为mu的小蛋白紧密地环绕在其周围，起到类组蛋白样的作用。另一种蛋白V将这种DNA-蛋白复合物连接起来，并通过蛋白VI与病毒衣壳连接在一起。在两条链的5′端各以共价键结合着一个被称为DNA 末端蛋白（pTP）复合物（DNA-TPC）的特化的结构，与腺病毒复制密切相关。腺病毒基因组的两端各有一段100bp的反向末端重复序列（ITR），是复制的起始位点。在左端ITR的3′侧有一段长约300bp的包装信号（ψ）介导腺病毒基因组包装入病毒衣壳。对腺病毒而言，只有包括两端的ITR和包装信号（ψ）的约0.5kb的序列是顺式作用元件，也就是说必须由腺病毒载体自身携带，而其他的30余种蛋白都可以通过辅助病毒（或细胞）反式补足。 病毒蛋白约11种（TP和PⅠ～PⅩ），其中有4种蛋白（病毒多肽PⅤ、PⅦ，末端蛋白TP、酶蛋白PⅩ）与病毒基因构成病毒核心，多肽PⅦ是主要的核心蛋白，如同组蛋白一样包裹病毒基因DNA。构成病毒衣壳的蛋白质约7种。多肽PⅡ是病毒衣壳中最丰富和最主要成分，六邻体是由3个PⅡ分子紧密相连组成。多肽PⅥ、PⅧ在六邻体与病毒核心之间形成连接桥，并与多肽PⅨ一起稳定着六邻体分子的晶格排列。5个分子多肽PⅢ相连构成五邻体的基座蛋白，PⅢa为五邻体的周围蛋白，也参与衣壳的组成，五邻体通过PⅤ与病毒核心相连。多肽PⅣ主要构成病毒三聚体纤突，纤突与病毒血凝活性相关，因血凝素（纤突）具有型特异性，常用血凝抑制试验（HI）对临床分离株进行分型。 分类及自上个世纪50年代发现并成功分离腺病毒以来，已陆续发现了100余个血清型，其中人腺病毒有49种，分为A、B、C、D、E 和F六个亚群（subgroup）。基因治疗常用的人的2型及5型腺病毒在血清学分类上均属C亚群，在DNA序列上有95%的同源性。二者的增殖能力非常强，滴度通常可以达到109pfu (plaque forming unit)/ml，其在单个细胞中的基因组拷贝数可达104（约占细胞总DNA的10%）。病毒颗粒比较稳定，通过CsCl梯度离心可以达到1010~1011pfu/ml，满足动物实验的要求。
腺病毒中文操作手册
腺病毒载体操作手册中文版 腺病毒重组系统 AdEasyTM操作手册 目录 第一章简介 1 第二章应用重组腺病毒的优点 2 第三章 AdEasyTM 技术 3 3.1 技术概况 3 3.2 AdEasyTM系统中产生重组腺病毒的时程 3 第四章主要流程 4 4.1 将基因克隆入AdEasyTM转移载体4 4.1.1 克隆的一般原则 4 4.1.2 构建重组AdEasyTM转移载体 5 4.2 细菌内AdEasyTM重组子的产生 5 4.2.1 共转化的一般原则 5 4.2.2 共转化方法 5 4.2.3 预期结果 5 4.3 AdEasyTM重组质粒的筛选和扩增6 4.4 AdEasyTM重组子转染QBI-293A 细胞 6 4.4.1 细胞铺板 6 4.4.2 磷酸钙转化技术 7 第五章常用技术 8 5.1 QBI-293A细胞培养 8 5.1.1 QBI-293A细胞的初始培养8 5.1.2 QBI-293A细胞的维持培养和增殖 8 5.1.3 QBI-293A细胞的冻存 8 5.2 QBI-293A细胞的转染和病毒空斑的产生 9 5.2.1 感染QBI-293A细胞 9 5.2.2 病毒空斑形成 9 5.2.3 琼脂糖覆盖被感染细胞 9 5.3 MOI测定 10 5.4 腺病毒感染力测定 10
5.4.1 X-Gal染色 11 5.5 重组腺病毒的筛选和纯化 11 5.5.1 挑选最佳重组腺病毒：表达和基因输送 11 5.5.2 病毒空斑挑选和小量扩增12 5.5.3 Western杂交 13 5.5.4 Southern杂交和点杂交 13 5.5.5 病毒裂解产物PCR 14 5.5.6 免疫测定 14 5.5.7 功能测定 14 5.6 病毒颗粒在QBI-293A细胞中的大量扩增 15 5.7 两次氯化铯密度梯度离心纯化重组腺病毒 16 5.7.1 不连续密度梯度离心 17 5.7.2 连续密度梯度离心 17 5.7.3 病毒溶液去盐和浓集 17 5.8 病毒滴度测定 18 5.8.1 O.D.260 nm (VP/ml) 19 5.8.2 空斑测定法 20 5.8.3 50%组织培养感染剂量法 20 第六章疑难解答 22 6.1 QBI-293A细胞培养 22 6.2 感染力测定 22 6.3 转移载体克隆 23 6.4 在BJ5183细胞中共转化和重组24 6.5 转染QBI-293A细胞 25 6.6 筛选和测定 25 6.7 在QBI-293A细胞中表达 26 6.8 重组腺病毒的扩增 26 6.9 纯化 26 6.10 病毒滴度测定 27 缩写英文全称中文全称 Ad Adenovirus 腺病毒 Ad5 Adenovirus serotype 5 血清5型腺病毒 AdV Adenoviral Vector 腺病毒载体Amp Ampicillin 氨苄青霉素 β-Gal β-Galactosidase β-半乳糖苷酶 bp Base Pair 碱基对
国际运输货物外包装注意事项
国际运输货物外包装注意事项 包装是影响运输质量的一个非常重要的因素，它可由托 运人自身完成，也可委托专业包装公司进行。包装材料的选 择要视货物品质而定，目的是使货物得到安全的保护和支 撑。常用的有木箱、纸箱等。不同国家对木箱的要求不同， 有些国家和地区木箱是要求熏蒸的。 钢琴、陶瓷、工艺品等偏重或贵重的物品请用木箱包装。 美国、加拿大、澳大利亚、新西兰等国，对未经过加工的原 木、或原木包装有严格的规定，必须在原出口国进行熏蒸， 并出示承认的熏蒸证，进口国方可接受货物进口。否则，罚 款或将货物退回原出口国。 欧洲对松树类的木制包装规定，货物进口时必须有原出 口国检疫局出示的：没有虫害的证明。 加工后的木制家具不用做熏蒸。 日常生活常用类物品如书籍、各种用具等可用结实的纸 箱自行包装，并最好做防潮处理。 易碎类的物品最好用东西填充好，避免损坏。条件允许，在纸箱内铺垫一层防水用品(例如：塑料袋、布等)。在同一包装箱内，轻重物品要合理搭配放置，以便搬运。 箱内最后要塞满填充物，要充实，可用卫生纸、纸巾、小衣 物等填充，以防在搬运挪动过程中箱内物品互相翻动、碰撞 而受到损坏。
【国际贸易运输方式】国际贸易海洋运输方式 [提要]国际贸易海洋运输方式:班轮运输(定期船运输) Liner Transport. 指按固定的航线和预先规定的时间表航行,沿途停靠若干固定的港口,从事这些港口的货运业务,并按事先公布的费率收取运费的船舶运输业... 国际贸易中，进出口商品的交付是通过各种运输方式完成 的。国际贸易运输方式的种类很多，各种运输方式都有其自身的 特点和独特的经营方式，了解各种国际贸易运输方式的特点和经 营方式，对于合理选择和正确利用各种运输方式，有着重要的意义。 一. 国际贸易运输的六大方式: 根据运输工具的不同, 可分为: 海洋、铁路、航空、邮政和国际多式联运等运输形式. 二. 国际贸易运输方式之一 - 海洋运输。海洋运输(Ocean Transportation)简称海运，它是利用货船在国内外港口之间通 过一定的航线和航区进行货物运输的一种运输方式。 海洋运输包括：
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包装设计要注意什么_包装设计注意事项 平时我们购买的商品大都有外包装，包装设计的好坏会直接影响到消费者的购买欲望，从而影响商品的销量。怎样的一个包装设计才算是好呢？本期乔布简历小编将为大家介绍一下包装设计注意事项，下面就一起来了解一下包装设计要注意什么吧~ 关键词：包装设计要注意什么,包装设计注意事项 包装设计除了精美外，还要符合并遵循可靠、适当、经济的原则。由于需要包装设计的产品种类繁多，性能用途也各不相同，对包装设计的要求也是大有不同，从业者在做包装设计时要考虑的问题也就比较多种多样。概括来说，做包装设计时主要注意以下几点： 1、产品本身的性能用途 在做包装设计时，首先要考虑的就是产品本身，不同形态的产品包装容器也不一样。此外还要考虑到产品的外形及重量，外包装的设计要符合包装体积小、存放安全、确保在运输流通中不易受损等原则。对于价值比较高的产品要最先考虑包装要使得不易受损的问题，而对于易燃易爆或有毒等危险性产品则要优先考虑安全性。 2、外在环境的影响 产品在运输及售卖流通的过程中，会遇到不同的环境，各种环境会对包装产生不同的影响，这点在包装设计时要充分考虑。针对不同的贮存条件，也要采取相应的措施。室内贮存的产品包装要注意防潮防霉等，室外贮存的产品则要考虑防光照防雨水，防风防雨雪等。 从业者在做包装设计时，要充分考虑到各种因素，这样才能保证商品在到消费者手中时完好无损。找工作意向为包装设计行业的小伙伴们也可以参考一下以上内容，加强对包装设计的理解认识~ 包装设计要注意什么_包装设计注意事项 https://www.360docs.net/doc/414641370.html,/knowledge/articles/5656b5410cf2f396f66c9d50
腺病毒常见问题与解答
腺病毒常见问题与解答 1、腺病毒载体对目的基因的长度是否有要求？ 有要求。对E1和E3双缺失的腺病毒载体，比如AdMax的Kit C、Kit D等，其总包装的 外源片断要求小于8 kb。而对于只有E1缺失或E3缺失的载体，比如Kit A、Kit B等，外源片断要求小于5 kb。注意，外源片断指包括启动子、外源基因和poly A等在内的整个插入片断。 2、我的试验需要多少总量的腺病毒载体？ 腺病毒介导外源基因的基因治疗研究一般分为体外培养细胞试验(体外试验)和动物试验(体内试验)两部分，不同的实验设计所需要的病毒量也不尽相同。根据经验，完成一个完 整的肿瘤治疗实验需要腺病毒的病毒量总量约为3×1012 VP左右. 3、如何提高腺病毒的活性？ 提高腺病毒的活性，关键应该是在病毒包装过程和扩增过程。纯化过程只是去掉有缺陷的病毒和细胞碎片等容易引起机体免疫反应的过程，如果扩增的病毒滴度高，那么纯化后就会更高的。 4、克隆到转移载体的基因中的5’和3’UTR（未翻译区）的额外的碱基会影响蛋白表达吗？ UTR尽可能短一些，特别是在5’要避免在mRNA里形成二级结构。在起始密码子ATG 前面可以加一小段（6-9bp）的碱基序列可以增强目的基因的表达，比如Kozak序列(GCCGCCACCATG)。 5、如何判断腺病毒载体是否能高效感染某种细胞？ 参照文献报道是很简单的办法，也可以用带报告基因的腺病毒先行预实验。 Ad5能高效感染绝大多数人类、小鼠等的体细胞（包括分裂和非分裂细胞），比如肝、肌肉、神经组织等。但对血液系统来源细胞和某些肿瘤细胞，比如乳腺癌、白血病细胞等，感染效率较低。 6、腺病毒载体在体外实验（in vitro）中应注意哪些问题？ 1）由于细胞表面受体的差异，腺病毒载体在不同的细胞中转导效率不同。可根据文献报道或用带报告基因的腺病毒载体判断病毒用量。 2）在细胞处于对数生长期时感染病毒效果较好。避免在消化细胞后立刻感染病毒，因为此时细胞膜上的病毒受体往往受到了暂时的破坏。培养过夜后再感染病毒，效果较好。 3）选择适当的转导MOI（病毒感染单位数/细胞数），可以在MOI为0.1~1000范围内进行试验( 10倍比稀释)。 4）感染病毒时细胞培养液的体积尽量小一些，以完全覆盖细胞为准。如24孔板可用200ul，6孔板1ml。 5）感染时间为90分钟，每15分钟轻轻晃动培养液一次，以混匀。 6）选择适当表达检测时间，一般感染病毒24h后就能检测到目的基因的表达，48小时表达达到较高水平。 7、用于体内试验的腺病毒，是否要求纯化？ 是的，病毒纯化是很必要的。因为细胞裂解液包含有缺损颗粒、大量的腺病毒fiber和penton蛋白（细胞毒素）、培养基、血清以及细胞碎片。这些杂质如果被注入动物体内，会
腺病毒中文操作手册
腺病毒中文操作手 册
腺病毒载体操作手册中文版腺病毒重组系统 AdEasyTM操作手册 目录 第一章简介 1 第二章应用重组腺病毒的优点 2 第三章AdEasyTM 技术 3 3.1 技术概况 3 3.2 AdEasyTM系统中产生重组腺病毒的时程 3 第四章主要流程 4 4.1 将基因克隆入AdEasyTM转移载体 4 4.1.1 克隆的一般原则 4 4.1.2 构建重组AdEasyTM转移载体5 4.2 细菌内AdEasyTM重组子的产生5 4.2.1 共转化的一般原则 5 4.2.2 共转化方法 5 4.2.3 预期结果 5 4.3 AdEasyTM重组质粒的筛选和扩增 6 4.4 AdEasyTM重组子转染QBI-293A 细胞 6 4.4.1 细胞铺板 6 4.4.2 磷酸钙转化技术7 第五章常见技术8 5.1 QBI-293A细胞培养8 5.1.1 QBI-293A细胞的初始培养8 5.1.2 QBI-293A细胞的维持培养和增殖8 5.1.3 QBI-293A细胞的冻存8 5.2 QBI-293A细胞的转染和病毒空斑的产生9 5.2.1 感染QBI-293A细胞9 5.2.2 病毒空斑形成9 5.2.3 琼脂糖覆盖被感染细胞9 5.3 MOI测定10 5.4 腺病毒感染力测定10
5.4.1 X-Gal染色11 5.5 重组腺病毒的筛选和纯化11 5.5.1 挑选最佳重组腺病毒：表示和基因输送11 5.5.2 病毒空斑挑选和小量扩增12 5.5.3 Western杂交13 5.5.4 Southern杂交和点杂交13 5.5.5 病毒裂解产物PCR 14 5.5.6 免疫测定14 5.5.7 功能测定14 5.6 病毒颗粒在QBI-293A细胞中的大量扩增15 5.7 两次氯化铯密度梯度离心纯化重组腺病毒16 5.7.1 不连续密度梯度离心17 5.7.2 连续密度梯度离心17 5.7.3 病毒溶液去盐和浓集17 5.8 病毒滴度测定18 5.8.1 O.D.260 nm (VP/ml) 19 5.8.2 空斑测定法20 5.8.3 50%组织培养感染剂量法20 第六章疑难解答22 6.1 QBI-293A细胞培养22 6.2 感染力测定22 6.3 转移载体克隆23 6.4 在BJ5183细胞中共转化和重组24 6.5 转染QBI-293A细胞25 6.6 筛选和测定25 6.7 在QBI-293A细胞中表示26 6.8 重组腺病毒的扩增26 6.9 纯化26 6.10 病毒滴度测定 27 缩写英文全称中文全称 Ad Adenovirus 腺病毒Ad5 Adenovirus serotype 5 血清5型腺病毒AdV Adenoviral Vector 腺病毒载体Amp Ampicillin 氨苄青霉素β-Gal β-Galactosidase β-半乳糖苷酶bp Base Pair 碱基对BSA Bovine Serum Albumin 小牛血清
病毒包装实验整体流程及原理#(精选.)
病毒感染细胞实验整体流程及原理 目的基因不能直接整合到大多数真核细胞，常用的手段是将目的基因包装成病毒来感染细胞，从而得到表达满足实验需求。 1、病毒的种类 病毒有很多种，常见的有慢病毒和腺病毒 1.1慢病毒 1.1.1原理 慢病毒（Lentivirus）是逆转录病毒的一种。构建的siRNA / miRNA慢病毒载体，与化学合成的siRNA 和基于瞬时表达载体构建的普通siRNA 载体相比，一方面可以扩增替代瞬时表达载体使用，另一方面，Lentivirus-siRNA 克隆经过慢病毒包装系统包装后，可用于感染依靠传统转染试剂难于转染的细胞系如原代细胞、悬浮细胞和处于非分裂状态的细胞，并且在感染后可以整合到受感染细胞的基因组，进行长时间的稳定表达。 1.1.2特点 1）直接包装成为假病毒颗粒，对分裂和非分裂细胞均有感染作用，适合RNAi 研究和体内实验中难以转染的细胞(比如神经元细胞、干细胞或其它原代细胞)。 2）可以通过简单方式，在短时间内获得稳定表达特定基因的多种细胞株。 3）可用于基因敲除、基因治疗和转基因动物研究。 4）无需任何转染试剂，操作简便。 5）可以根据客户需要制备多种标记。 1.1.3慢病毒包装简要流程： 1）含有目的基因的慢病毒RNAi 干扰载体的构建和质粒纯化提取。 2）慢病毒载体，包装系统共转染病毒包装细胞293T等。 3）培养48hrs - 72hrs 左右，收集含有病毒的上清培养液。 4）病毒的纯化和浓缩。 5）分装、- 80 ℃保存。 6）滴度测定目的基因检定，并出具检测报告。 1.2、腺病毒
1.2.1原理 腺病毒(Adenovirus，Ad)是一种无包膜的线状双链DNA病毒，其复制不依赖于宿主细胞的分裂。有近50个血清型，大多数Ad载体都是基于血清型2和5，通过转基因的方式取代E1和E3基因，降低病毒的复制能力。这些重组病毒仅在高水平表达E1和E3基因的细胞中复制，因此是一种适用于治疗的高效控制系统。 1.2.2特点 1）几乎可以感染所有类型的细胞 2）可以获得复制缺陷型(E1 和E3 缺失) 的腺病毒 3）病毒滴度高，产生病毒经过浓缩后可以达到1012 PFU/mL，能有效的进行增殖。 4）腺病毒载体感染宿主的范围比较广，制备容易，操作简单. 5）感染细胞时，不整合到染色体中，不存在激活致癌基因或插入突变等危险，生物安全性高。 1.2.3腺病毒包装简要流程 1）构建表达siRNA/miRNA 的腺病毒载体 2）采用PacI 消化纯化的质粒。 3）消化好的腺病毒表达载体转染293A 细胞，收获细胞以制备病毒粗提液。 4）将病毒粗提液感染293A 细胞以扩增病毒。 5）分装，-80℃保存。 1.3、慢病毒和腺病毒的比较
MicroRNA腺病毒表达系统使用手册0828
产品手册│ MirAd TM MicroRNA前体腺病毒表达系统 本产品仅限用于研究，严禁用于任何动物或人类疾病诊断。 本产品仅供购买方内部研究使用，未经ViGene生物科技有限公司书面许可，严禁转售。
目录│ 产品简介 4 产品组成 5 保存条件 5 使用安全注意事项 6 pMirAd 载体图谱 6 质粒扩增 6 病毒载体扩增 7 常见问题解答 8
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产品简介 MicroRNAs（miRNAs）是一类长度为18-24个核苷酸的非编码RNA分子。MiRNA通过与靶基因mRNA上的互补序列结合，降解mRNA或抑制mRNA的翻译。MiRNAs在细胞分化、增殖、凋亡和癌细胞发生中发挥重要的调控作用。MiRNAs来源于具有60-80个核苷酸茎环结构的microRNA前体（premir）和序列更长一些的microRNA初级转录产物（primir）。MiRNA在核内由RNA聚合酶II（polII）转录生成，最初产物primir具有帽子结构和多聚腺苷酸尾巴。 ViGene生物的mirAD-腺病毒microRNA前体表达系统包括三个相关产品：microRNA前体穿梭载体、microRNA前体腺病毒载体和预制microRNA前体腺病毒。 重组腺病毒是进行基因转移和表达的工具，功能强大且易于操作。腺病毒独特的生物学特征使它成为“载体的首选”，被科研工作者广泛应用。首先，它能够感染包括分裂、非分裂细胞和干细胞在内的多种细胞。第二，病毒滴度高。第三，高滴度的病毒可获得高感染效率和高表达量。第四，病毒进入细胞后，病毒基因组不整合到细胞染色体上，因此瞬时表达外源基因的重组腺病毒不会诱导宿主细胞中染色体的变化。ViGene生物选用的是应用最广泛的复制缺陷型的人类血清5型腺病毒，该腺病毒载体缺失E1和E3基因。E1基因在组装感染性病毒颗粒时必不可少，可在HEK293T细胞病毒包装过程中得到补充，而E3基因可有可无。由于E1和E3基因的缺失，腺病毒载体可插入高达7.5kb的外源基因。 pMir-microRNA precursor是基于microRNA前体表达系统的质粒。microRNA前体天然的茎环结构被克隆到质粒的SgfI和MluI双酶切位点。为了保持推测的发卡结构和诱导正确的内源性反应，miRNA茎环结构的两侧具有它的150-200bp的天然序列。MicroRNA前体在CMV启动子启动下表达，其上游有GFP荧光标记，并具有SV40 poly（A）加尾信号。穿梭载体含有SV40启动子启动的puromycin嘌呤霉素标记，可以用来进行稳转细胞株的筛选。穿梭载体还含有两个腺病毒ITR序列和两个与腺病毒Ad5同源的序列，可
重组腺病毒构建的标准操作规程
重组腺病毒构建的标准操作规程（编号：048） 1、目的及适用范围 该SOP用于规范真核细胞表达重组蛋白的操作。 2、主要仪器及试剂 电转仪、Adeasy-1系统（穿梭载体pshuttle-cmv,pAdtrack-CMV）、骨架病毒（pAdeasy-1）、重组菌（BJ5183感受态）、包装细胞（293A）、Taq酶。限制性内切酶、碱裂解法提取质粒溶液I、II、III、酚、氯仿 3、操作步骤 3.1目的基因的克隆：引物设计时要GOI中有没有Pme I/EcoRI和PacI酶切位点。 3.1.1通过限制酶切分析/PCR/基因测序确认GOI克隆到穿梭载体，翻译方向跟启动子方向相同。 3.1.2如果采用pShuttle 或pAdTrack，必须提供启动子和多聚腺苷酸信号。所有的穿梭载体必须包括一个Kozak 信号序列。 3.1.3因为在转化和转染前，用Pme I/EcoRI和PacI酶，所以要避免GOI中有这些酶的酶切位点。如果有PacI酶酶切位点，建议通过点突变除去。 3.1.4如果表达多个基因，避免头对头的方向，采用头尾相接的方式。 3.1.5建议在穿梭载体中，通过瞬时转染检测GOI的表达。 3.2制备电转 BJ5183 感受态细胞：BJ5183为链霉素抗性，固体和液体LB加终浓度为30μg/mL 的链霉素培养。划线培养、挑单菌落摇床培养，转接到200-300mL液体培养基中，37℃摇床培养至A550约0.8，转移到无菌离心管中冰浴10～30min，4℃3000rpm离心10min，用50mL灭菌的超纯水配制的10%甘油重悬,重复两次离心重悬，4℃3000rpm离心10min，用10mLWB重悬，4℃3000rpm离心10min最后用0.5mL重悬。分装20μL/管，-80℃冻存。 3.3用卡那抗性培养基培养2mL含有GOI穿梭质粒的细菌培养过夜。提取质粒DNA。推荐使用碱裂解法提取质粒，保证穿梭质粒的完整性可以提高在BJ5183细菌中重组的效率。 3.4 用Pme I或EcoRI线性化穿梭质粒：必须保证酶切完全。0.1μg-0.5μgDNA用300U的酶100μL 体系。电泳检测酶切是否完全。 3.5乙醇沉淀法回收纯化线性化的穿梭载体。 3.6 冰上操作：向20μLBJ5183感受态细胞中加入pAdeasy-1腺病毒骨架质粒和线性化的穿梭质粒，混匀，总体积不超过30μL。 3.7 将感受态和DNA混合物转移到用冰预冷的电转杯中，电击转化。电击完成后加入预热的LB 101
病毒包装实验整体规程及原理(慢病毒、腺病毒)
广州英思特生物科技有限公司为您提供高效快速的病毒包装实验外包服务， 病毒感染细胞实验整体流程及原理目的基因不能直接整合到大多数真核细胞，常用的手段是将目的基因包装成病毒来感染细胞，从而得到表达满足实验需求。 1、病毒的种类 1.1 1.1.1 体，一方面 1.1.2 1）研 。? 2）可以通过简单方式，在短时间内获得稳定表达特定基因的多种细胞株。 3）可用于基因敲除、基因治疗和转基因动物研究。 4）无需任何转染试剂，操作简便。 5）可以根据客户需要制备多种标记。 1.1.3慢病毒包装简要流程： 1）含有目的基因的慢病毒 RNAi 干扰载体的构建和质粒纯化提取。
2）慢病毒载体，包装系统共转染病毒包装细胞293T等。 3）培养 48hrs - 72hrs 左右，收集含有病毒的上清培养液。 4）病毒的纯化和浓缩。 5）分装、- 80 ℃保存。 6）滴度测定目的基因检定，并出具检测报告。 1.2 1.2.1 达E1 1.2.2 1） 2） 3） 4） 5） 1.2.3腺病毒包装简要流程 1）构建表达 siRNA/miRNA 的腺病毒载体 2）采用 PacI 消化纯化的质粒。 3）消化好的腺病毒表达载体转染 293A 细胞，收获细胞以制备病毒粗提液。4）将病毒粗提液感染 293A 细胞以扩增病毒。
5）分装，-80℃保存。 1.3、慢病毒和腺病毒的比较
2、构建目的基因到载体 2.1构建手段 一般是根据原始质粒信息确定克隆方案，有以下两种手段。 1）如果原始质粒与载体有匹配酶切位点，采用相应的内切酶切下相应片段，回收并连接到载体，酶切，并测序鉴定 DNA分子。质粒在宿主细胞体内外都可复制。通过个些特性，人们可以把一些目的DNA片断构建在质粒中，通过转化入大肠杆菌中，利用选择培养基来筛选从而不断的复制，来得到目的产物。
慢病毒转染手册
慢病毒（Lentivirus）载体是以HIV-1（人类免疫缺陷I型病毒）为基础发展起来的基因治疗载体。区别一般的逆转录病毒载体，它对分裂细胞和非分裂细胞均具有感染能力。 基本概述 慢病毒载体的研究发展得很快，研究的也非常深入。该载体可以将外源基因有效地整合到宿主染色体上，从而达到持久性表达。在感染能力方面可有效地感染神经元细胞、肝细胞、心肌细胞、肿瘤细胞、内皮细胞、干细胞等多种类型的细胞，从而达到良好的的基因治疗效果，在美国已经开展了临床研究，效果非常理想，因此具有广阔的应用前景。 慢病毒的应用 目前慢病毒也被广泛地应用于表达RNAi的研究中。由于有些类型细胞脂质体转染效果差，转移到细胞内的siRNA半衰期短，体外合成siRNA对基因表达的抑制作用通常是短暂的，因而使其应用受到较大的限制。采用事先在体外构建能够表达siRNA的载体, 然后转移到细胞内转录siRNA的策略，不但使脂质体有效转染的细胞种类增加，而且对基因表达抑制效果也不逊色于体外合成siRNA，在长期稳定表达载体的细胞中，甚至可以发挥长期阻断基因表达的作用。在所构建的siRNA表达载体中，是由RNA聚合酶Ⅲ启动子来指导RNA合成的，这是因为RNA聚合酶Ⅲ有明确的起始和终止序列，而且合成的RNA不会带poly A尾。当RNA聚合酶Ⅲ遇到连续4个或5个T时，它指导的转录就会停止，在转录产物3’端形成1~4个U。U6和H1 RNA启动子是两种RNA聚合酶Ⅲ依赖的启动子，其特点是启动子自身元素均位于转录区的上游，适合于表达～21ntRNA和～50ntRNA茎环结构（stem loop）。在siRNA表达载体中，构成siRNA的正义与反义链，可由各自的启动子分别转录,然后两条链互补结合形成siRNA；也可由载体直接表达小发卡状RNA(small hairpin RNA, shRNA), 载体包含位于RNA聚合酶Ⅲ启动子和4～5T转录终止位点之间的茎环结构序列，转录后即可折叠成具有1~4 个U 3 ’ 突出端的茎环结构，在细胞内进一步加工成siRNA。构建载体前通常要通过合成siRNA的方法，寻找高效的siRNA，然后从中挑选符合载体要求的序列，将其引入siRNA表达载体。 慢病毒载体
慢病毒生产及使用操作手册
慢病毒生产及使用操作手册 一、实验流程 制备慢病毒穿梭质粒及其辅助包装原件载体质粒，三种质粒载体分别进行高纯度无内毒素抽提，共转染293T细胞，转染后6 h 更换为完全培养基，培养48和72h后，分别收集富含慢病毒颗粒的细胞上清液，病毒上清液通过超离心浓缩病毒。以下内容由汉恒生物科技（上海）有限公司精心整理总结。 二、实验材料 （一）慢病毒载体、包装细胞和菌株 该病毒包装系统为三质粒系统，组成为pspax2, pMD2G, pHBLV TM系列质粒。 1、载体信息（见附录） 2、细胞株293T，慢病毒的包装细胞，为贴壁依赖型成上皮样细胞，生长培养基为DMEM(含10% FBS)。贴壁细胞经培养生长增殖形成单层细胞。 3、菌株大肠杆菌菌株DH5α。用于扩增慢病毒载体和辅助包装载体质粒。 三、包装细胞293T细胞的培养 （一）293T细胞的冻存 随着传代的次数增加，293T细胞会出现生长状态下降、突变等。为了防止此类现象的出现，我们需要在开始就对细胞进行大量冻存，以保证实验的稳定性和持续性。在细胞对数生长期进行冻存，增加细胞复苏成活率。 1、去掉上清液，加入PBS洗去残留的培养基； 2、加入%的胰酶，消化1～2min后，镜下观察细胞变圆，细胞间间隙加大时，去除胰酶，加入新鲜培养基吹打混匀，移入离心管中。 3、细胞计数，将细胞全部晃下，加入3mL 37 ℃预热的10％DMEM，用10mL 移液管进行吹打，较大力吹打6～8 次即可，不留死角，之后，将所有细胞吸出，置于15mL 离心管中，取50ul 混匀后的细胞于eppendorf 管中，加入450ul 10％DMEM，即为10 倍稀释，混匀，取10ul 细胞于计数板中计数。计数板上共 4 大格，每大格16 小格。计数时，4 大格均计数，总数除以4（得每大格细胞数），再乘以10（10 倍稀释），即为实际n万/mL 细胞浓度。
车间包装安全操作规程及注意事项二
车间包装安全操作规程及注意事项 1．领桶：厂长开领桶单后由车间叉车司机到空桶组办理领空桶手续，交车间包装负责人，核查品质合格方可使用。 2．空桶套胶袋：按照生产联络单的包装要求，在空桶内套相应的胶袋。如120KG桶套120KG的胶袋、200KG桶套200KG的胶袋等。 3．安装过虑网：依据包装指示进行过滤包装，白胶用80目的过虑网，防水胶用150目的过虑网，UV油用UV专用过滤袋包装，丙烯酸树脂（水性）用200目过滤网，丙烯酸树脂（油性）用300目过滤网，高温树脂用250目过滤网，特殊情况按指令执行。 4．校正磅秤：以20KG砝码来校正，允许误差为±0.2%。 5.穿戴防护用品：包装时要求员工穿戴适当防护用品方可上岗作业，如穿戴防止产生静电厂服、戴耐酸碱胶手套、防毒防尘口罩等。 6.包装：按照包装规格重量进行包装，包装时器具要求备齐、干净，包装的产品名称、类别、型号、重量与要求一致，包装出来的产品外观要求干净、美观。 7.贴标签：标签要求贴在桶身侧面正上方，统一位置，标签要与包装产品确定一致后粘贴，特殊情况按特殊要求粘贴。 8.保管器具：产品包装完毕后，要求彻底清洗机械，要妥善保管好工具器具，以待后用。 9.注意事项 1）严禁烟火：严禁带火种进出生产区域，不准在生产区内使用打
火机、手机等。 2）防止皮肤接触危险化学品：若接触液体，立刻使用大量清水冲洗皮肤至少5分钟，若症状严重，送医院治疗；同时移除污染衣物、鞋子，以肥皂清洗干净，衣物再使用前，予以清洗。 3）防止眼睛接触危险化学品：立刻用洗眼器持续冲洗眼睛至少30分钟，严重者送医院治疗。 4）防止吸入危险化学品：移患者到新鲜空气处，若呼吸停止，施行人工呼吸，若呼吸困难，由受训合格人员给予氧气，寻求医生治疗或送医院。 5）防止食入危险化学品：可催吐，用大量的清水漱口，并送医院治疗。 6）注意供电、供热及压力危害：不要随意乱动电气开关等，有问题请教主管或电工方可；发现有人触电，应立即使触电者脱离电源，静卧,呼吸心跳停止应及时给予人工呼吸及心脏挤压按摩。车间在生产或包装时会遇到温度和压力问题，反应釜及蒸气管道为压力容器，在操作时应小心防止受到蒸气烫伤。压缩空气及外购瓶装氮气，要防止管道阀门破裂等造成高压气体伤害，氧气瓶不得在地面随意滚动，使用时应固定牢固，防止碰倒发生意外。 7）防止静电：包装前将包装胶桶排整齐，并在地面洒水消除静电；在包装时严禁使用铁锤等敲打铁桶及使用铜质开桶器；在使用电子秤时要求必须夹上静电夹，清扫地面需使用竹扫把，禁用塑料扫把，禁
腺病毒的包装和感染PDF
腺病毒的包装，纯化和感染 技术背景：Adeasy系统利用了腺病毒具有的高感染能力，可高度浓缩等优点，并破坏了腺病毒基因组中的早期基因E1，使之成为较为安全、高效的病毒载体。利用带有E1基因的293细胞作为包装细胞，通过倍比扩增，富集病毒颗粒，并通过CsCl梯度离心，透析进行分离纯化。对绝大多数的细胞株可以达到近乎100％的感染效率。但需要指出的是Adeasy同样具有所有病毒载体或转染试剂都不可避免的细胞毒性问题。 所需试剂： ●293细胞； ●重组好的腺病毒质粒； ●Pac I限制性内切酶； ●质粒回收相关试剂； ●细胞培养、转染相关试剂； ●TBS：10mM Tris,0.9%NaCl,pH8.1; ●40%CsCl：28.45g CsCl溶于42.7ml的TBS中，4度保存； ●15%CsCl：9.085g CsCl溶于47.69ml的TBS中，4度保存； ●Beckman离心管：14*89mm，SW41转头； ●Polybrene(sigma)，10mg/ml； ●透析袋：Spectrum Co.（成卷供应，带少量甘油，硫化物与重金属）， MW=8000~14400； ●灭菌甘油。 操作流程： 1.293细胞（E1-transformed human embryonic kidney cells在转染前24小时接种 于1或2个60mm培养盘中，使之在转染时细胞汇合率为50-70%； 2.在转染前，用Pac I处理目的质粒（一般一个60mm细胞盘需要6μg DNA）。 处理后质粒用乙醇沉淀并重悬于20μl无菌水中； 3.用PEI或其他转染试剂将6μg Pac I处理过的质粒转染细胞；