菌落PCR实验步骤.doc
菌落PCR资料
PCR, 菌落, 资料
菌落PCR
菌落PCR与我们通常的普通DNA的PCR的不同在于，直接以单个菌作为模板。是一种可以快速鉴定菌落是否为含目的质粒的阳性菌落。操作简单，快接，阳性率较高，在转化鉴定中较常见。
操作方法：
1，挑取单个菌落，可以用高压灭菌的牙签。现在含抗性的平板上画线，做保种用，然后置于20ultriton－x100中搅和一下，将相应的菌和板子上的画线区做上对应的记号
2，将装有20ulTritonx－100的EP管100度煮2分钟
3，按照菌中预期包含的质粒加好PCR体系，建议做20ul体系，模板加煮过的菌的上清1ul 4，上机即可。退火温度可以稍低，虽然没有什么根据可言，但是个人经验，推荐比质粒PCR 时稍低
5，电泳，看结果，阳性的菌落对应的板子可以直接挑菌小摇，保种或者送测序都可以
我的做法是：
用枪头挑选单菌落到装有20uL水的pcr管中，然后悬浮菌液。
在做PCR时，吸取1uL做摸板，但电泳检测后，选有阳性克隆相对的菌液10uL与试管的液体培养基中培养。这样做，既初步检测了阳性克隆，又保存了所需要的菌落。
当然，在挑菌时也有用接种环挑的，有用牙签挑的，看个人的爱好了
我们都是直接拿牙签挑单菌落往PCR反应体系中搅拌一下，一般都能鉴定出来。想节省麻烦的话，还可以菌落鉴定同时挑单克隆，用1.5的EP管装1mL左右培养基，牙签挑出菌落后先在培养基上搅拌然后再放到PCR反应体系中。
把PCR体系先加好，用接种针直接往菌落上戳一下然后伸到体系里面晃晃就可以上机P了，我每次都是这样，可能是最方便的方法了。
取200ul水，牙签挑菌，煮沸5‘，冰浴5’，12000rpm，取上清5ul做模版。其他的和普通pcr一样。
我们都是用过夜培养的菌液0.3ul（不要超过0.5ul）做模板，很简单的，其它都不变。先94度5min 裂解菌，最好5min后再加入taq酶。
是的，菌落PCR不难。。但是如果发现结果出现非特异带，在目的带位置有很弱的条带出现，最好再用液体培养后再做一次PCR,我就因为这个阴性结果折腾了1个月。。扩培后再作菌落PCR就得到阳性结果了。。
我是这样做的,取菌液60ul至ep管中,沸水中煮5min,离心,取其中上清1ul作模板,屡试不爽
拿牙签点一下菌落然后再体系里面涮一下就可以了
如果觉得不可靠，就索性接个种，摇个小管，然后取1ul作模板
模板如果太多了，引物就不够用了，显然扩不出来，这种现象在质粒这种模板的PCR里面很多，你提出来的质粒不要忘记稀释
一般来说, 菌落PCR能够筛选阳性克隆. 象你的实验中出现的这种假阳性结果, 也不是什么太反常的事情, 细菌本身的基因组也是反应系统中的组分, 所以难免有些假阳性的结果. 建议多用几对不同的引物扩增, 以增加真阳性筛选结果.
一般会出现假阳性，可能是粘在菌落上的目的基因被污染，建议引物一个为目的基因一个为载体上的，用无菌牙签挑取菌落，在配好的PCR体系中赞一下，PCR反应条件为95度10分钟94度40秒退火55度40秒72度1分钟30个循环
建议酶切后鉴定时同时取一个未做酶切的质粒做对照，明确是否能切断，再考虑是否能切出目的片段。
假阳性并不高，可挑菌落摇菌12小时以上再取菌液pcr,初始变性温度可设为98度。
我们一般将接种好的菌液煮沸15min，4000rpm离心5min，用上清作模板，效果很好。
非常方便的方法,我做了不知多少次,从未失手.
1.挑取菌落加入50ul dd水中,振摇.
2.99度, 5'灭活菌液中的酶
3.12000rpm离心1'去除细胞碎片
4.取上清pcr,50ul体系取10ul
我做就是将菌株挑一点点加入PCR体系中,涮一涮.我没有煮沸和离心.剩下的菌落放到37度继续让它长大一些,方便接种.
刚做的时候强烈建议大家要做阴性对照和阳性对照,因为有时候会有假阳性,即使阴性对照也会在目的位置出现条带,只是亮度弱一些而已.
我的经验是:若是真阳性,会很亮,让你不会怀疑;如果似有似无,一般都是假阳性.
菌落PCR ，菌液PCR（菌液的体积不能过大，大了会影响PCR体系，导致扩增不出来，一般取0.3微升左右就行了）都可以的，一般10微升的PCR体系，跑样时用小梳孔，（凝胶使用第一次时做回收用，将溴酚兰及核酸以外的凝胶割下来，就可以再用来做鉴定胶了，一般鉴定用的旧胶用２次都是可以的，比较节省）。
理论上，基因特异性引物和载体上的通用引物都是可以的。最重要的是带marker,先判断大小。当然最后还要提质粒酶切鉴定一下。一般PCR阳性的菌，正确的可能性非常大。但也不排除PCR阳性，但酶切阴性的可能，因为如果基因是PCR后克隆到载体的，可能会存在碱基突变的可能。
所以需要PCR和酶切两种方法鉴定。但最终应以测序的结果为准。
跑得很好的电泳：200v，我的目的片断是400多pb，2%普通胶，跑了大概20分钟左右吧
菌落PCR很容易出现假阳性，可能与菌落本身的含量过于复杂所导致的
1。用载体引物来作一般可以降低假阳性。
2。菌落PCR作出来如果都是阳性或是阴性都不对，如果出现有的有，有的没有，那么可以将其摇成菌液，作菌液PCR，或是直接再次涂版，然后提取菌落作PCR，如果个个都是，证明准确。
3。菌落PCR的假阳性很引物本身有很大的关系，所以建议鉴定做好还是酶切最为可靠，我吃过很多关于菌落PCR的亏，所以建议还是酶切
试一下热启动，可以消除引物二聚体。
分子生物学综合实验报告
分子生物学综合试验报告
综合实验Ⅰ.Southern杂交 （质粒DNA提取、PCR技术体外扩增DNA、质粒载体和外源DNA的连接反应、 地高辛标记的Southern杂交） 一.实验目的 1.学习Southern杂交的原理及操作方法。 2.学习碱裂解法提取质粒的原理。 3.学习PCR反应的基本原理和实验技术；了解引物设计的一般要求。 4.掌握DNA体外连接的基本技能，了解连接反应的注意事项。 二.实验原理 利用染色体DNA与质粒DNA的变性与复性的差异而达到分离的目的。在碱变性条件下，染色体DNA的氢键断裂，双螺旋解开而变性，质粒DNA氢键也大部分断裂，双螺旋也有部分解开，但共价闭合环状结构的两条互补链不会完全分离，当pH=的乙酸钠将其pH调到中性时，变性的质粒DNA又恢复到原来的碱裂解法提取质粒的主要原理是：利用染色体DNA与质粒DNA的变性与复性的差异而构型，而染色体DNA不能复性，形成缠绕的致密网状结构，离心后，由于浮力密度不同，染色体DNA与大分子RNA、蛋白质-SDS复合物等一起沉淀下来而被除去。 聚合酶链反应（PCR）是体外酶促合成DNA片段的一种技术，PCR 进行的基本条件：DNA模板（在RT-PCR中模板是RNA）、引物、dNTP （dATP、dTTP、dGTP、dCTP）、Taq DNA聚合酶、反应缓冲体系。 PCR循环由三个步骤组成：变性、退火、延伸。每一个循环的产物可作为下一个循环的模板，通过30个左右循环后，目的片段的扩增可达106倍。
DNA片段之间的连接是通过DNA连接酶的催化实现的。DNA连接酶催化具有平末端或互补粘性末端的DNA片段间相邻碱基通过3’,5’磷酸二酯键连接起来。最常用的来源于T4噬菌体的T4DNA连接酶。对于平末端或互补的粘性末端可直接进行连接反应。一个片段是平末端，另一片段为粘性末端或两个片段都是粘性末端但不配对，则需要通过各种方式使其可一匹配或通过平末端进行连接。通常采用末端补平、加同聚物尾、加接头等方式是目的片段之间能够匹配。 地高辛随机引物法标记的原理：在随机引物法标记的反应液中，有随机合成的六聚核苷酸作为引物，dATP、dCTP、dGTP、dTTP和D1G-11-dUTP作为合成底物，以单链DNA作为模板，在Klenow酶的作用下，合成插入地高辛的DNA链。以地高辛标记的探针与靶基因DNA链杂交后，再通过免疫反应进行检测。一般通过酶标记地高辛抗体检测，就可以肯定杂交反应的存在。免疫检验一般用碱性磷酸酶系统，BClP/NBT显色，敏感性很高。 三．实验准备 1.实验材料： 含质粒的大肠杆菌DH5α，LB液体培养基， LB平板培养基 2.实验试剂： Taq DNA聚合酶，10×反应缓冲液（含25mmol MgCl2），dNTP，引物（P1、P2），溴乙啶 (EB) ，点样缓冲液Loading buffer（10×）：%溴酚蓝，40%甘油，目的基因及载体， 2×ligation 缓冲液，T4 DNA连接酶， L CaCl2，氨苄青霉素（100mg/mL）， TBE电泳缓冲液（5×）， DIG Random Labeling Mix（高效），Anti-DIG-AP Conjugate， BCIP/NBT Stock Solution，Blocking Reagent。 20×SSC：柠檬酸钠，3M NaCl，2×SSC：柠檬酸钠， NaCl， EDTA，变性液： NaOH， NaCl，中和度： Tris-HCl、、3M NaCl，Standard buffer：5×SSC、%(w/v) N-Lauroylsarcosine, % (w/v) SDS, 1% Blocking Reagent，Standard buffer+50% formamide，Anti-DIG-AP 碱性磷酸酶标记抗地高辛单抗体，BCIP/NBT储备液，冲洗液：0. 1M
生物实验4 实时定量PCR 实验报告
实验四定量PCR扩增 姓名：李宗翰专业：环境工程学号：1432999 同组人姓名：刘雪飞 一、实验目的 复习定量PCR原理，熟悉绝对定量的操作流程 二、实验原理 实时荧光定量PCR是在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号累积实时监测整PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。在PCR扩增的指数时期，模板的Ct 值和该模板的起始拷贝数存在线性关系，通过Ct值和标准曲线的分析对起始模板进行定量分析 三、实验仪器及材料 real time PCR仪(ABI7500, RotorGene 3000)，微量移液器，Tip头，0.2ml光学薄壁管，8联PCR管，1.5ml离心管，SYBR Mix，引物及108 copy/ul 标准品 四、实验步骤 1、标准样品稀释：取4个1.5ml的离心管，写上标记107，106, 105, 104，向每管加入90μl ddH2O，取10μl 108copy/ul 的标样加入到107管中，充分混匀后，从管中取10μl 107copy/ul的液体到106管中。按上述操作依次稀释，得到5个倍数的标准样品。注意，每次稀释都要换Tip头。 2、配制预混液：取119μl ddH2O、7μl引物4204f、7μl引物4448r和7μl Rox 到装有175μl SYBR Mix液的1.5ml离心管中，混匀。 3、分装预混液：取7个小离心管，分别标记108、107、106、105、10 4、UNK （未知样）、NTC（阴性对照）。向其中分别加入42μl预混液和4.7μl模板（1-5号加标样、6号加未知样、7号加等量ddH2O），混匀。 4、戴上手套取两个8联管，并排放置管架上。分别取上述样品20μl至第1-7管中（第8管空出），每个样品两个重复，共14个样品。将加好样的8联管振荡。 5、设置分析仪参数如下：95℃3min；95℃15s+60℃40s为一个循环，循环次数40，融解曲线温度范围60~95℃。振荡好的样品进机进行PCR扩增。 6、扩增后利用软件分析C T值及未知样的定量结果。
DNA提取及PCR扩增实验报告.doc
PCR扩增及DNA琼脂糖凝胶电泳 刘琳1131428 环境科学 一、实验目的 1．学习并掌握PCR扩增的基本原理与实验技术。 2．对扩增后的DNA进行琼脂糖凝胶电泳试验，并分析相应结果。 二、实验原理 1. PCR扩增 多聚酶链反应（PCR）技术的原理类似于DNA的天然复制过程。在微量离心管中加入适量缓冲液，加入微量模板DNA、四种脱氧核苷酸（dNTP）、耐热T aq聚合酶及两个合成DNA的引物，而后加热使模板DNA在高温下（94℃）变性，双链解链，这是所谓变性阶段。降低溶液温度，使合成引物在低温（55℃）与模板DNA互补退火形成部分双链，这是所谓退火阶段。溶液反应温度升至中温（72℃），在Tap酶作用下，用四种dNTP为原料，引物为复制起点，模板DNA的一条双链在解链和退火之后延伸为两条双链，这是延伸阶段。如此反复，在同一反应体系中可重复高温变性、低温退火和DNA合成这一循环，使产物DNA重复合成，并在重复过程中，前一循环的产物DNA可作为后一循环的模板DNA而参与DNA的合成，使产物DNA的量按指数方式扩增。经过30～40个循环，DNA扩增即可完成。 2. DNA琼脂糖凝胶电泳实验 DNA分子在高于其等电点的溶液中带负电，在电场中向阳极移动。在一定的电场强度下，DNA分子的迁移速度取决于分子筛效应，即分子本身的大小和构型是主要的影响因素。DNA分子的迁移速度与其相对分子量成反比。不同构型的DNA分子的迁移速度不同。该电泳方法以琼脂凝胶作为支持物，利用DNA分子在泳动时的电荷效应和分子筛效应，达到分离混合物的目的。 三、实验材料 仪器：PCR扩增仪、0.2ul薄壁管、1.5ml离心管、移液枪、枪头、微波炉、电泳仪、水平电泳槽、制胶版、紫外透射仪。 试剂：TapDNA聚合酶、dNTP、buffer、两种引物、16S全长DNA样本、无菌ddH2O、模板DNA 、TBE、琼脂糖、EB、显色剂。 四、实验步骤 1. PCR扩增 本次试验选择细菌16S rDNA V3区片段进行扩增。 1.1 根据计算，首先取1.5ml离心管按照 2.5ul 10×Buffer 、1 ul dNTP、0.5 ul 341GC、 0.5 ul 534、0.125 ul Taq、19.375u ddH2O的比例配置足量的PCR反应体系。 1.2 分别向9个薄壁管中分别加入24 ul的反应体系，并分别添加8种不同的模版，并于第9个薄壁管中加入无菌ddH2O作为阴性对照。 1.3 将薄壁管放入PCR扩增仪中，按照预定程序进行PCR扩增。其中循环过程需要达到30~40次。程序如下： 预变性：94℃3min 循环：94℃变性30s 55℃退火30s 72℃延伸30s 末次延伸：72℃5min
RT-PCR实验报告课件
逆转录pcr rt-pcr 为反转录rcr （reverse transcription pcr ）和实时pcr （real time pcr ）共同的缩写。逆转录pcr ，或者称反转录pcr(reverse transcription-pcr, rt-pcr) ，是聚合酶链式反应(pcr) 的一种广泛应用的变形。在rt-pcr 中，一条rna 链被逆转录成为互补dna，再以此为模板通过pcr 进行dna 扩增。 由一条rna 单链转录为互补dna(cdna) 称作“逆转录”，由依赖rna 的dna 聚合酶（逆转录酶）来完成。随后，dna 的另一条链通过脱氧核苷酸引物和依赖rna 的dna 聚合酶完成，随每个循环倍增，即通常的pcr 。原先的rna 模板被rna 酶h 降解，留下互补dna。 rt-pcr 的指数扩增是一种很灵敏的技术，可以检测很低拷贝数的rna 。rt-pcr 广泛应用于遗传病的诊断，并且可以用于定量监测某种rna 的含量。（检测基因表达的方法，参见northern blot 法。） rt-pcr 有时候也会指代实时pcr(real-time pcr) 。为了与逆转录pcr 相区别，通常被写作“定量pcr ”(quantitative pcr) 或者rtq-pcr(real-time quantitative pcr) 。 实时pcr 实时pcr(real-time pcr) ，属于定量pcr （q-pcr ）的一种，以一定时间内dna 的增幅量为基础进行dna 的定量分析。real time pcr 的定量使用萤光色素，目前有二种方法。 一种是在ds dna 中插入特异的萤光色素；另一种使用一种能与增幅dna 序列中特定寡核酸序 列相结合的一种萤光探针（probe ）。real time pcr 与reverse transcription pcr 相结合，能用微量的rna 来找出特定时间、细胞、组织内的特别表达的遗传基因。这两种rt pcr 的组合又被称之为“定量rt-pcr （quantitative rt-pcr ）” rt-pcr 技术相关试剂 oligo: 多聚体，相当于mrna 引物 amv （m-mlv）：逆转录酶 dntp ：脱氧核苷酸 rnase ：rna 酶抑制剂 pcr buffer ：rt-pcr 缓冲液 mgcl2 ：2 价镁离子 pcr 各步骤的目的 （一）预变性： 破坏dna 中可能存在的较难破坏的二级结构。使dna 充分变性，减少dna 复杂结构对扩增的影响，以利于引物更好的和模板结合，特别是对于基因组来源的dna 模板，最好不要吝 啬这个步骤。此外，在一些使用热启动taq 酶的反应中，还可激活taq 酶，从而使pcr 反应得以顺利进行。 （二）变性-- 退火-- 延伸循环： ①模板dna 的变性：模板dna 经加热至93℃左右一定时间后，使模板dna 双链或经pcr 扩增形成的双链dna 解离，使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮反应作准备； ②模板dna 与引物的退火( 复性) ：模板dna 经加热变性成单链后，温度降至55℃左右，引物与模板dna 单链的互补序列配对结合； ③引物的延伸：dna 模板-- 引物结合物在taqdna 聚合酶的作用下，以dntp 为反应原料，靶序列为模板，按碱基配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板dna 链互补的半保留复制链。 （三）pcr 仪扩增循环后72 度延伸10 分钟 用pcr 仪扩增时,( 变性. 退火, 延伸) 循环完成后, 继续72 度延伸了10 分钟的原因：
PCR实验报告
PCR实验报告 7月19日高遄 实验目的：了解PCR技术原理，掌握最基础的PCR实验步骤。 实验试剂：模板DNA，Mg2+，buffer，dNTPs，Taq DNA聚合酶，引物，H2O，石蜡油。 实验原理： ●PCR全称聚合酶链反应，是体外快速扩增特定基因或DNA序列最常用的方法。 ●基本原理：首先将双链DNA分子在临近沸点的温度下加热分离成2条单链DNA分子，DNA聚合酶以单链DNA为模板并利用反应混合物中的四种脱氧核苷三磷酸合成新的DNA互补链。PCR反应时，只要在试管内加入模板DNA、PCR引物、四种核苷酸及适当浓度的Mg2+，DNA聚合酶就能在数小时内将目标序列扩增100万倍以上。 （1）双链模板DNA分子首先在高温下解开成长的单链，短链引物分子立即与该模板DNA 两端的特定序列相结合，产生双链区。 （2）DNA聚合酶从引物处开始复制其互补链，迅速产生与目标序列完全相同的复制品。（3）在后续反应中，无论是起始模板DNA还是经复制的杂合DNA双链，都会在高温下解开成为单链，体系中的引物分子再次与其互补序列相结合，聚合酶也再度复制模板 DNA。 （4）由于在PCR反应中选用的一对引物，是按照与扩增区域两端序列彼此互补的原则设计的，因此每一条新生链的合成都是从引物的退火结合位点开始并朝反方向延伸的，每一条新合成的DNA链上都有新的引物结合位点。 （5）整个PCR的反应全过程，即DNA解链（变性）、引物与模板DNA结合（退火）、DNA 合成（链的延伸）三步可以被不断重复。经多次循环之后，反应混合物中所含有的双链DNA分子数，即两条引物结合位点之间的DNA区段的拷贝数，理论上的最高值应该是2^n，能进一步满足遗传分析的需要。 ●试剂作用： （1）引物：DNA复制的起始点，针对复制DNA片段的两端，有5’引物和3’引物 （2）Taq DNA聚合酶：促进dNTPs与模板结合。 （3）Buffer：Tris-HCl反应缓冲液，Taq DNA聚合酶提供一个最适酶催反应条件。 （4）Mg2+：对PCR扩增效率影响很大，浓度过高可降低PCR扩增的特异性，浓度过低则影响PCR扩增产量甚至使PCR扩增失败而不出扩增条带。 （5）dNTPs：底物，在引物引导下合成与模板互补的DNA新链。 （6）石蜡油：防止PCR加热过程中DNA蒸发。 ●试剂配置体积： （1）热启动：94℃，5~10min （2）变性：94℃，45~60s。 （3）退火：50~65℃，1min。退火温度计算：Tm-（5℃~10℃），Tm（解链温度）=4（G+C）+2（A+T）。 （4）延伸：72℃，1~1.5min。 （5）步骤（2）~（4）热循环25~30个周期 （6）保温：延伸72℃，10min ●产物检测：凝胶电泳。
实验二PCR扩增(聚合酶链式反应)
实验二 PCR扩增（聚合酶链式反应） 一、实验目的 1.学习聚合酶链式反应概念及技术方法； 2.掌握聚合酶链式反应操作过程。 二、实验原理（聚合酶链式反应） PCR是聚合酶链式反应，是以单链DNA为模板，4种dNTP为底物，在模板3’末端有引物存在的情况下，用酶进行互补链的延伸，多次反复的循环能使微量的模板DNA得到极大程度的扩增。在微量离心管中，加入与待扩增的DNA片段两端已知序列分别互补的两个引物、适量的缓冲液、微量的DNA膜板、四种dNTP溶液、耐热Taq DNA聚合酶、Mg2+等。 反应时先将上述溶液加热，使模板DNA在高温下变性，双链解开为单链状态；然后降低溶液温度，使合成引物在低温下与其靶序列配对，形成部分双链，称为退火；再将温度升至合适温度，在Taq DNA聚合酶的催化下，以dNTP为原料，引物沿5’→3’方向延伸，形成新的DNA片段，该片段又可作为下一轮反应的模板，如此重复改变温度，由高温变性、低温复性和适温延伸组成一个周期，反复循环，使目的基因得以迅速扩增。因此PCR循环过程为三部分构成：模板变性、引物退火、热稳定DNA聚合酶在适当温度下催化DNA链延伸合成 1．模板DNA的变性 模板DNA加热到90-95℃时，双螺旋结构的氢键断裂，双链解开成为单链，称为DNA的变性，以便它与引物结合，为下轮反应作准备。变性温度与DNA中G-C含量有关，G-C间由三个氢键连接，而A-T间只有两个氢键相连，所以G-C含量较高的模板，其解链温度相对要高些。故PCR中DNA变性需要的温度和时间与模板DNA的二级结构的复杂性、G-C含量高低等均有关。对于高G-C含量的模板DNA在实验中需添加一定量二甲基亚砜（DMSO），并且在PCR循环中起始阶段热变性温度可以采用97℃，时间适当延长，即所谓的热启动。 2．模板DNA与引物的退火 将反应混合物温度降低至37-65℃时，寡核苷酸引物与单链模板杂交，形成DNA模板-引物复合物。退火所需要的温度和时间取决于引物与靶序列的同源性程度及寡核苷酸的碱基组成。一般要求引物的浓度大大高于模板DNA的浓度，并由于引物的长度显著短于模板的长度，因此在退火时，引物与模板中的互补序列的配对速度比模板之间重新配对成双链的速度要快得多，退火时间一般为1-2min。 3．引物的延伸 DNA模板-引物复合物在Taq DNA聚合酶的作用下，以dNTP为反应原料，靶序列为模板，按碱基配对与半保留复制原理，合成一条与模板DNA链互补的新链。重复循环变性-退火-延伸三过程，就可获得更多的“半保留复制链”，而且这种新链又可成为下次循环的模板。延伸所需要的时间取决于模板DNA的长度。在72℃条件下，Taq DNA聚合酶催化的合成速度大约为40-60个碱基/秒。经过一轮“变性-退火-延伸”循环，模板拷贝数增加了一倍。在以后的循环中，新合成的DNA都可以起模板作用，因此每一轮循环以后，DNA拷贝数就增加一倍。每完成一个循环需2-4min，一次PCR经过30-40次循环，约2-3h。扩增初期，扩增的量呈直线上升，但是当引物、模板、聚合酶达到一定比值时，酶的催化反应趋于饱和，便出现所谓的“平台效应”，即靶DNA产物的浓度不再增加。
PCR扩增反应的操作实验报告1
PCR扩增反应的操作实验报告 实验原理: 以单链DNA为模板，4种dNTP为底物，在模板3’末端有引物存在的情况下，用酶进行互补链的延伸，多次反复的循环能使微量的模板DNA得到极大程度的扩增。在微量离心管中，加入与待扩增的DNA片段两端已知序列分别互补的两个引物、适量的缓冲液、微量的DNA膜板、四种dNTP溶液、耐热Taq DNA聚合酶、Mg2+等。反应时先将上述溶液加热，使模板DNA在高温下变性，双链解开为单链状态；然后降低溶液温度，使合成引物在低温下与其靶序列配对，形成部分双链，称为退火；再将温度升至合适温度，在Taq DNA 聚合酶的催化下，以dNTP为原料，引物沿5’→3’方向延伸，形成新的DNA片段，该片段又可作为下一轮反应的模板，如此重复改变温度，由高温变性、低温复性和适温延伸组成一个周期，反复循环，使目的基因得以迅速扩增。因此PCR循环过程为三部分构成：模板变性、引物退火、热稳定DNA聚合酶在适当温度下催化DNA链延伸合成。 实验步骤:一、PCR反应的条件 PCR反应条件为温度、时间和循环次数。 1．温度与时间的设置 （1）变性温度与时间：变性温度低，解链不完全是导致PCR失败的最主要原因。 一般情况下，93℃～94℃ lmin足以使模板DNA变性，若低于93℃则需延长时间，但温度不能过高，因为高温环境对酶的活性有影响。此步若不能使靶基因模板或PCR产物完全变性，就会导致PCR失败。 （2）退火（复性）温度与时间：退火温度是影响PCR特异性的较重要因素。变性后温度快速冷却至40℃～60℃，可使引物和模板发生结合。由于模板 DNA比引物复杂得多，引物和模板之间的碰撞结合机会远远高于模板互补链之间的碰撞。退火温度与时间，取决于引物的长度、碱基组成及其浓度，还有靶基序列的长度。对于20个核苷酸，G+C含量约50%的引物，55℃为选择最适退火温度的起点较为理想。 （3）延伸温度与时间：Taq DNA聚合酶的生物学活性：70～80℃，150核苷酸/S/酶分子；70℃，60核苷酸/S/酶分子；55℃，24核苷酸/S/酶分子；高于90℃时，DNA合成几乎不能进行。 （4）PCR反应的延伸温度一般选择在70～75℃之间，常用温度为72℃，过高的延伸温度不利于引物和模板的结合。PCR延伸反应的时间，可根据待扩增片段的长度而定，一般1kb以内的DNA片段，延伸时间1min是足够的。 3～4kb的靶序列需3～4min；扩增10kb需延伸至15min。延伸进间过长 会导致非特异性扩增带的出现。对低浓度模板的扩增，延伸时间要稍长些。 2．循环次数 循环次数决定PCR扩增程度。PCR循环次数主要取决于模板DNA的浓度，一般的循环次数选在30～40次之间，循环次数越多，非特异性产物的量亦随之增多。 二、PCR扩增产物分析 PCR产物是否为特异性扩增，其结果是否准确可靠，必须对其进行严格的分析与鉴定，才能得出正确的结论。PCR产物的分析，可依据研究对象和目的不同而采用不同的分析方法。
PCR实验报告
PCR实验报告 7月19日高遗 实验目的：了解PCF技术原理，掌握最基础的PCF实验步骤。 实验试剂：模板DNA Mg2+ buffer，dNTPs Taq DNA聚合酶，引物，H2Q石蜡油。实验原理：PCF全称聚合酶链反应，是体外快速扩增特定基因或DNAJ列最常用的方法。 基本原理：首先将双链DNA分子在临近沸点的温度下加热分离成2条单链DNA分子，DNA聚合酶以单链DNA为模板并利用反应混合物中的四种脱氧核苷三磷酸合成新的DNA互补链。PCF反应时，只要在试管内加入模板DNAPCF引物、四种核苷酸及适当浓度的Mg2+ DNA聚合酶就能在数小时内将目标序列扩增100万倍以上。 (1)双链模板DNA分子首先在高温下解开成长的单链，短链引物分子立即与该模板DNA 两端 的特定序列相结合，产生双链区。 (2)DNA聚合酶从引物处开始复制其互补链，迅速产生与目标序列完全相同的复制品。 (3)在后续反应中，无论是起始模板DNA还是经复制的杂合DNA双链，都会在高温下解开 成为单链，体系中的引物分子再次与其互补序列相结合，聚合酶也再度复制模板DNA (4)由于在PCR反应中选用的一对引物，是按照与扩增区域两端序列彼此互补的原则设计 的，因此每一条新生链的合成都是从引物的退火结合位点开始并朝反方向延伸的，每一条新合成的DNA链上都有新的引物结合位点。 (5)整个PCR勺反应全过程，即DNA解链(变性)、弓I物与模板DNA吉合(退火)、DNA 合 成(链的延伸)三步可以被不断重复。经多次循环之后，反应混合物中所含有的双 链DNA分子数，即两条引物结合位点之间的DNA区段的拷贝数，理论上的最高值应该是25，能进一步满足遗传分析的需要。 试剂作用： (1)引物：DNA M制的起始点，针对复制DNA片段的两端，有5'引物和3'引物 (2)Taq DNA聚合酶：促进dNTPs与模板结合。 (3)Buffer : Tris-HCl反应缓冲液，Taq DNA聚合酶提供一个最适酶催反应条件。 (4)Mg2+:对PCF扩增效率影响很大，浓度过高可降低PCF T增的特异性，浓度过低则影 响PCF扩增产量甚至使PCF扩增失败而不出扩增条带。 (5)dNTPs：底物，在引物引导下合成与模板互补的DNA新链。 (6)石蜡油：防止PCF加热过程中DNA蒸发。 试剂配置体积： 温度和时间： (1) 热启动：94C，5~10min (2) 变性：94C，45~60s。 (3) 退火：50~65C，1min。退火温度计算：Tm- (5C~10C)，Tm(解链温度)=4 (G+C +2 (A+T)o (4) 延伸：72C，1~1.5min。 (5) 步骤(2) ~ (4)热循环25~30个周期 (6) 保温：延伸72C，10min 产物检测：凝胶电泳。 实验步骤: (1)设计20卩l体系各试剂配比:
实验四-逆转录PCR-(RT-PCR)
实验四-逆转录PCR-(RT-PCR)
实验四逆转录PCR (RT-PCR) 【实验目的】 1．了解用逆转录PCR法获取目的基因的原理。 2．学习和掌握逆转录PCR的技术和方法。 【实验原理】 聚合酶链式反应（PCR）过程利用模板变性，引物退火和引物延伸的多个循环来扩增DNA序列。因为上一轮的扩增产物又作为下一轮扩增的模板，是一个指数增长的过程，使其成为检测核酸和克隆基因的一种非常灵敏的技术。一般经25-35轮循环就可使模板DNA扩增达106 倍。RT-PCR将以RNA为模板的cDNA（complement DNA）合成（即RNA的反转录（RT，reversetranscription）），同cDNA 的PCR结合在一起的技术，提供了一种基因表达检测、定量和cDNA克隆的快速灵敏的方法。由于cDNA 包括了编码蛋白的完整序列而且不含内含子，只要略经改造便可直接用于基因工程表达和功能研究，因此RT-PCR成为目前获得目的基因的一种重要手段。 RT-PCR技术灵敏而且用途广泛，可用于检测细胞中基因表达水平、表达差异，细胞中RNA病毒的含量和直接克隆特定基因的cDNA序列。RT-PCR比其他包括Northern印迹、RNase保护分析、原位杂交及S1核酸酶分析在内的RNA分析技术，更灵敏，更易于操作。 RT-PCR的基本原理（图4.1）。首先是在逆转录酶的作用下从RNA合成 cDNA，即总RNA中的mRNA在体外被反向转录合成DNA拷贝，因拷贝DNA的核苷酸序列完全互补于模板mRNA，称之为互补DNA（cDNA）；然后再利用DNA聚合酶，以cDNA第一链为模板，以四种脱氧核苷三磷酸（dNTP）为材料，在引物的引导下复制出大量的cDNA或目的片段。 在RT时，有3种引物可选择（表4.1) 。用1）和2）方法，理论上是扩增的所有的cDNA，还要用此产物做PCR的模板继续扩增。如果用3）方法，先要去https://www.360docs.net/doc/4615720873.html,查它的序列，并用oligo等软件设计引物。 RT-PCR可以一步法或两步法的形式进行。两步法RT-PCR比较常见，在使用一个样品检测或克隆多个基因的mRNA时比较有用。在两步法RT-PCR中，每一步都在最佳条件下进行。cDNA的合成首先在逆转录缓冲液中进行，然后取出1/10的反应产物进行PCR。而一步法RT-PCR具有其它优点（表4.2），cDNA合成和扩增反应在同一管中进行，不需要打开管盖和转移，有助于减少污染。还可以得到更高的灵敏度，最低可以达到0.1pg总RNA，因为整个cDNA样品都被扩增。对于成功的一步法 RT-PCR，一般使用基因特异性引物(GSP)起始cDNA的合成。 由图4.1不难看出，随机引物法是三种方法中特异性最低的。引物在整个转录本的多个位点退火，产生短的，部分长度的cDNA。这种方法经常用于获取5'末端序列及从带有二级结构区域或带有逆转录酶不能复制的终止位点的RNA模板获得cDNA。为了获得最长的cDNA，需要按经验确定每个RNA样品中引物与RNA的比例。随机引物的起始浓度范围为50到250ng每20μl反应体系。因为使用随机引物从总RNA合成的cDNA主要是核糖体RNA，所以模板一般选用poly(A)+RNA。 Oligo(dT)起始比随机引物特异性高。它同大多数真核细胞mRNA 3'端所发现的poly(A)尾杂交。因为poly(A)+RNA大概占总RNA的1%到2％，所以与使用随机引物相比，cDNA的数量和复杂度要少得多。因为其较高的特异性，oligo(dT)一般不需要对RNA和引物的比例及poly(A)+选择进行优化。建议每20μl反应体系使用0.5μg oligo(dT)。oligo(dT)12-18适用于多数RT-PCR。 基因特异性引物（GSP）对于逆转录步骤是特异性最好的引物。GSP是反义寡聚核苷，可以特异性地同RNA目的序列杂交，而不象随机引物或oligo(dT)那样同所有RNA退火。用于设计PCR引物的规则同样适用于逆转录反应GSP的设计。GSP可以同与mRNA 3'最末端退火的扩增引物序列相同，
荧光定量PCR实验报告
荧光定量PCR实验报告 目前需要检测抗癌药 A在不用时间点对某抑癌基因B表达的影响，根据该药物在文献 记录中发挥作用的时间点0小时，6小时，24小时给予药物，并已提取各时间点细胞的总 RNA，请设计相关实验来检测药物A对基因B转录水平影响。 一、实验原理 所谓实时荧光定量 PCR技术，是指在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个PCR 进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。 研究表明，每个模板的 Ct值与该模板的起始拷贝数的对数存在线性关系，起始拷贝数越多，Ct值越小。利用已知起始拷贝数的标准品可作出标准曲线，其中横坐标代表起始拷贝数的对数，纵坐标代 Ct值。因此，只要获得未知样品的Ct值，即可从标准曲线上计算出 该样品的起始拷贝数。 荧光定量PCR所使用的荧光化学可分为两种：荧光探针和荧光染料。本实验主要采用SYBR荧光染料。在PCR 反应体系中，加入过量 SYBR荧光染料，SYBR荧光染料特异性地掺入DNA双链后，发射荧光信号，而不掺入链中的SYBR染料分子不会发射任何荧光信号，从而保证荧光信号的增加与PCR产物的增加完全同步。 二、实验试剂和器材 因RNA已提取，即应准备反转录和做PCR的试剂： 逆转录酶（M-MLV ），核糖核酸酶抑制剂（RNasin），dNTP，Taq DNA聚合酶（Taq DNA polymerase）,随机弓丨物（Random primers），琼脂糖（agarose）均为美国Promega 公司产品；荧光定量试剂盒：Hot Start Fluoresce nt PCR Core Reage nt Kits（SYBR Green I） , BBI 公司，合适的抑癌基因A的引物、3-actin引物。 器材： ABI 7300 Real-Time PCR System RS-28高速低温离心机 超低温冰箱 微量移液器 三、实验步骤 <1>，根据该药物在文献记录中发挥作用的时间点，用抗癌药A在0小时，6小时，24小时 给予药物，并已提取各时间点细胞的总RNA <2>反转录（RT ）: 反转录反应液组成如下表：
实验三PCR扩增制备目的基因
反转录 概念 反转录是以RNA为模板,通过反转录酶,合成DNA的过程，是DNA生物合成的一种特殊方式。区分:反转录与逆转录不等同。反转录是进行基因工程过程中，人为地提取出所需要的目的基因的信使RNA，并以之为模板人工合成DNA的过程；逆转录是RNA类病毒自主行为，在整合到宿主细胞内以RNA为模板形成DNA的过程。二者虽同为RNA→DNA的过程，但地点不同，相对性的来说，反转录在体外，逆转录在体内。 2反转录酶与反转录过程 反转录过程由反转录酶催化，该酶也称依赖RNA的DNA聚合酶（RDDP），即以RNA为模板催化DNA链的合成。合成的DNA链称为与RNA互补DNA（cDNA）。反转录酶存在于一些RNA病毒中，可能与病毒的恶性转化有关。人类免疫缺陷病毒（HIV）也是一种RNA 病毒，含有反转录酶。在小鼠及人的正常细胞和胚胎细胞中也有反转录酶，推测可能与细胞分化和胚胎发育有关。 大多数反转录酶都具有多种酶活性，主要包括以下几种活性。 ①DNA聚合酶活性；以RNA为模板，催化dNTP聚合成DNA的过程。此酶需要RNA为引物，多为色氨酸的tRNA，在引物tRNA3′－末端以5′→3′方向合成DNA。反转录酶中不具有3′→5′外切酶活性，因此没有校正功能，所以由反转录酶催化合成的DNA出错率比较高。 ②RNase H活性；由反转录酶催化合成的cDNA与模板RNA形成的杂交分子，将由RNase H从RNA5′端水解掉RNA分子。 ③DNA指导的DNA聚合酶活性；以反转录合成的第一条DNA单链为模板，以dNTP为底物，再合成第二条DNA分子。
除此之外，有些反转录酶还有DNA内切酶活性，这可能与病毒基因整合到宿主细胞染色体DNA中有关。反转录酶的发现对于遗传工程技术起了很大的推动作用，目前它已成为一种重要的工具酶。用组织细胞提取mRNA并以它为模板，在反转录酶的作用下，合成出互补的DNA(cDNA)，由此可构建出cDNA文库(cDNA library)，从中筛选特异的目的基因，这是在基因工程技术中最常用的获得目的基因的方法。 反转录的简要过程表示如下： 反转录酶的作用是以dNTP为底物，以RNA为模板，tRNA(主要是色氨酸tRNA)为引物，在tRNA3′桹H末端上，按5′→3′方向，合成一条与RNA模板互补的DNA单链，这条DNA单链叫做互补DNA(complementary DNA, cDNA)，它与RNA模板形成RNADNA杂交体。随后又在反转录酶的作用下，水解掉RNA链，再以cDNA为模板合成第二条DNA链。至此，完成由RNA指导的DNA合成过程。 3生物学意义 反转录的发现有重要的理论意义和实践意义。 （1）对分子生物学的中心法则进行了修正和补充，修正后的中心法则表示为：是指遗传信息从DNA传递给RNA，再从RNA传递给蛋白质，即完成遗传信息的转录和翻译的过程。也可以从DNA传递给DNA，即完成DNA的复制过程。这是所有有细胞结构的生物所遵循的法则。某些病毒中的RNA自我复制（如烟草花叶病毒等）和在某些病毒中能以RNA为模板逆转录成DNA的过程（某些致癌病毒）。有些病毒（如阮病毒，即疯牛病病毒）以蛋白质直接形成蛋白质。
PCR实验报告(分子生物学实验)
PCR Lin Chengyu Bio 04 2010030007; Cooperator: Yuan Xiaowen Experiment date: 2012-03-22 Submit Date: 2012-03-23 1Introduction 1.1Background information PCR (polymerase chain reaction) is a technique for amplifying DNA sequences in vitro. It was invented by Kary Mullis and his colleagues in 1985. It is widely used in gene cloning, mutation, sequencing and detection. 1.2Objectives (1)Learn the principle and method of PCR (Polymerase Chain Reaction). (2)Comprehend the significance of PCR technique in DNA manipulation. 1.3Major principles One typical PCR cycle consists of three steps: denaturation, annealing and extension. (1)Denaturation Figure 1 Step 1: denaturation As shown in Figure 1, the target double-strand DNA can be separated into single-strand DNA under high temperature (about 50 ℃). (2)Annealing
聚合酶链式反应PCR实验报告
实验二聚合酶链式反应（PCR） 一、实验原理 聚合酶链式反应（PCR）是利用DNA片段旁侧两个短的单链引物，在体外快速扩增特异DNA片段的技术。它应用热稳定的聚合酶，通过双链DNA模板的热变性、引物退火和引物延伸的重复循环，DNA片段以指数方式增加了百万倍。从非常微量的DNA甚至单个细胞所含有的DNA起始，可产生ug量的PCR产物。 二、器材与试剂 1.器材：移液器，EP管，热盖PCR仪，电泳仪，量筒，锥形瓶，微波炉，电子天平，紫外照色仪 2.试剂：引物，模板，Taq DNA聚合酶，原料（dNTPs），缓冲液与Mg2+，H2O, 2*PCRmix溶液，DNA染料 三、实验步骤 PCR反应体系的建立 取离心管，依次加入试剂混匀 1．H2O 12μl 2．模板1μl 3．引物T7 1μl 4．引物sp6 1μl 5．2*PCRmix 15μl PCR仪的热循环反应 把离心管放入PCR仪中，由变性--退火--延伸三个基本反应步骤构成
1.模板DNA的变性：模板DNA经加热至94℃左右一定时间后，使模板DNA 双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离，使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮反应作准备； 2.模板DNA与引物的退火(复性)：模板DNA经加热变性成单链后，温度降至 56℃左右，引物与模板DNA单链的互补序列配对结合； 3.引物的延伸：经加热至72℃左右DNA模板--引物结合物在TaqDNA聚合酶 的作用下，以dNTP为反应原料，靶序列为模板，按碱基互补配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板DNA链互补的半保留复制链。重复该循环30次，每次需要2-3分钟。 电泳检测结果 扩增产物在琼脂糖凝胶电泳中，电泳结束后，放到紫外照射仪中进行透射，电泳明胶显示清晰的条带，如下图所示加入的为1号样，出现在500bp左右条带，而预算结果为扩增出492bp条带，故实验成功。
pcr扩增实验报告
pcr扩增实验报告 篇一：DNA提取及PCR扩增实验报告 PCR扩增及DNA琼脂糖凝胶电泳 刘琳1131428 环境科学 一、实验目的 1．学习并掌握PCR扩增的基本原理与实验技术。 2．对扩增后的DNA进行琼脂糖凝胶电泳试验，并分析相应结果。 二、实验原理 1. PCR扩增 多聚酶链反应（PCR）技术的原理类似于DNA的天然复制过程。在微量离心管中加入适量缓冲液，加入微量模板DNA、四种脱氧核苷酸（dNTP）、耐热Taq聚合酶及两个合成DNA的引物，而后加热使模板DNA在高温下（94℃）变性，双链解链，这是所谓变性阶段。降低溶液温度，使合成引物在低温（55℃）
与模板DNA互补退火形成部分双链，这是所谓退火阶段。溶液反应温度升至中温（72℃），在Tap酶作用下，用四种dNTP 为原料，引物为复制起点，模板DNA的一条双链在解链和退火之后延伸为两条双链，这是延伸阶段。如此反复，在同一反应体系中可重复高温变性、低温退火和DNA合成这一循环，使产物DNA 重复合成，并在重复过程中，前一循环的产物DNA可作为后一循环的模板DNA而参与DNA的合成，使产物DNA 的量按指数方式扩增。经过30～40个循环，DNA扩增即可完成。 2. DNA琼脂糖凝胶电泳实验 DNA分子在高于其等电点的溶液中带负电，在电场中向阳极移动。在一定的电场强度下，DNA分子的迁移速度取决于分子筛效应，即分子本身的大小和构型是主要的影响因素。DNA分子的迁移速度与其相对分子量成反比。不同构型的DNA分子的迁移速度不同。该电泳方法以琼脂凝胶作为支持物，利用DNA
分子在泳动时的电荷效应和分子筛效应，达到分离混合物的目的。 三、实验材料 仪器：PCR扩增仪、薄壁管、离心管、移液枪、枪头、微波炉、电泳仪、水平电泳槽、制胶版、紫外透射仪。 试剂：TapDNA聚合酶、dNTP、buffer、两种引物、16S全长DNA样本、无菌ddH2O、模板DNA 、TBE、琼脂糖、EB、显色剂。 四、实验步骤 1. PCR扩增 本次试验选择细菌16S rDNA V3区片段进行扩增。 根据计算，首先取离心管按照10×Buffer 、1 ul dNTP、ul 341GC、ul 534、ul Taq、ddH2O的比例配置足量的PCR反应体系。 分别向9个薄壁管中分别加入24 ul 的反应体系，并分别添加8种不同的模版，并于第9个薄壁管中加入无菌ddH2O作为阴性对照。
PCR实验报告-实时荧光
实验报告书 药物对大鼠局部脑缺血再灌注保护作用下EGF、 BDNF基因表达情况 报告时间：2012年9月22日
荧光定量PCR（qPCR）实验过程 客户名：郑杰胜 实验名称：药物对大鼠局部脑缺血再灌注保护作用下EGF、BDNF 基因表达情况 1. 实验材料与仪器 高纯总RNA快速提取试剂盒购自Generay公司； 逆转录试剂盒RevertAid First Strand cDNA synthesis Kit购自Fermentas公司； qPCR试剂IQ SYBR Green Supermix购自Bio-Rad公司。 OD值测量仪器(高精度分光光度计)为Merinton SMA4000； 定量PCR仪为CFX connect Real-Time PCR System，配套使用的分析软件为BIO-RAD CFX Manager。 相关耗材(Tip头、EP管等)购自Thermal Scientific Fisher公司，均为无RNase、DNase和无热源的分子生物学耗材。 2. 实验方法与操作步骤 2.1 Trizol法提取细胞总RNA 注：本实验共27个大鼠脑组织样本，分别标注为： 第3天取材样本： 正常组CK3d-1、CK3d-2、CK3d-3； 模型组M3d-1、M3d-2、M3d-3； 治疗组T3d-1、T3d-2、T3d-3； 第7天取材样本： 正常组CK7d-1、CK7d-2、CK7d-3； 模型组M7d-1、M7d-2、M7d-3； 治疗组T7d-1、T7d-2、T7d-3； 第14天取材样本：
正常组CK14d-1、CK14d-2、CK14d-3； 模型组M14d-1、M14d-2、M14d-3； 治疗组T14d-1、T14d-2、T14d-3； 1)组织约200mg用液氮研磨至粉末状，加1ml Trizol 继续研磨至匀浆，室温放 置~15min，使其充分裂解。 2)12,000rpm 离心5min，弃沉淀 3)用1ml针筒，26-G号针头抽吸裂解液15-20次，以剪切基因组DNA。 4)按200ul氯仿/ml Trizol 加入氯仿，剧烈振荡混匀30s。 5)室温12,000rpm 离心5min。 6)吸取上层水相，至另一离心管中，加入150ul无水乙醇，混匀。 7)将上述溶液全部（包括沉淀）转移到套放于2ml收集管内的GenClean柱中， 室温放置2min，12000rpm离心1分钟。 8)弃去废液，加入45ul RPE Solution，12000rpm，室温离心30s。 9)重复步骤6。 10)弃去废液，将柱子放回收集管，10000rpm，室温离心30s。 11)将柱子转移至RNase-free的 1.5ml离心管中，在柱内膜的中央小心加入 40ulDEPC-H2O，55~80℃放置2分钟。 12)12000rpm，室温离心1min。（H2O、TE或0.5%SDS均须用DEPC处理并高 压灭菌。） 2.2 RNA纯度的测定和RNA的定量 以相应溶剂为对照(Blank)，取2μl RNA溶液于Merinton SMA4000检测，观察A260/A280 、A260/A230比值及连续波长吸收峰，并计算RNA溶液浓度，判断RNA提取质量：A260/A280>2.0且<2.3，则可以满足后续RT-qPCR所需。 OD值检测结果另附。见于最终报告“4.补充文件”文件夹。 2.4逆转录实验 1)把以下试剂加入到EP管中（总共12 μl）： 总RNA x μl(约1μg)