DNA提取及PCR扩增实验报告
PCR扩增及DNA琼脂糖凝胶电泳
刘琳1131428 环境科学
一、实验目的
1．学习并掌握PCR扩增的基本原理与实验技术。
2．对扩增后的DNA进行琼脂糖凝胶电泳试验，并分析相应结果。
二、实验原理
1. PCR扩增
多聚酶链反应（PCR）技术的原理类似于DNA的天然复制过程。在微量离心管中加入适量缓冲液，加入微量模板DNA、四种脱氧核苷酸（dNTP）、耐热T aq聚合酶及两个合成DNA的引物，而后加热使模板DNA在高温下（94℃）变性，双链解链，这是所谓变性阶段。降低溶液温度，使合成引物在低温（55℃）与模板DNA互补退火形成部分双链，这是所谓退火阶段。溶液反应温度升至中温（72℃），在Tap酶作用下，用四种dNTP为原料，引物为复制起点，模板DNA的一条双链在解链和退火之后延伸为两条双链，这是延伸阶段。如此反复，在同一反应体系中可重复高温变性、低温退火和DNA合成这一循环，使产物DNA重复合成，并在重复过程中，前一循环的产物DNA可作为后一循环的模板DNA而参与DNA的合成，使产物DNA的量按指数方式扩增。经过30～40个循环，DNA扩增即可完成。
2. DNA琼脂糖凝胶电泳实验
DNA分子在高于其等电点的溶液中带负电，在电场中向阳极移动。在一定的电场强度下，DNA分子的迁移速度取决于分子筛效应，即分子本身的大小和构型是主要的影响因素。DNA分子的迁移速度与其相对分子量成反比。不同构型的DNA分子的迁移速度不同。该电泳方法以琼脂凝胶作为支持物，利用DNA分子在泳动时的电荷效应和分子筛效应，达到分离混合物的目的。
三、实验材料
仪器：PCR扩增仪、0.2ul薄壁管、1.5ml离心管、移液枪、枪头、微波炉、电泳仪、水平电泳槽、制胶版、紫外透射仪。
试剂：TapDNA聚合酶、dNTP、buffer、两种引物、16S全长DNA样本、无菌ddH2O、模板DNA 、TBE、琼脂糖、EB、显色剂。
四、实验步骤
1. PCR扩增
本次试验选择细菌16S rDNA V3区片段进行扩增。
1.1 根据计算，首先取1.5ml离心管按照
2.5ul 10×Buffer 、1 ul dNTP、0.5 ul 341GC、
0.5 ul 534、0.125 ul Taq、19.375u ddH2O的比例配置足量的PCR反应体系。
1.2 分别向9个薄壁管中分别加入24 ul的反应体系，并分别添加8种不同的模版，并于第9个薄壁管中加入无菌ddH2O作为阴性对照。
1.3 将薄壁管放入PCR扩增仪中，按照预定程序进行PCR扩增。其中循环过程需要达到30~40次。程序如下：
预变性：94℃3min
循环：94℃变性30s
55℃退火30s
72℃延伸30s
末次延伸：72℃5min
1.4 PCR扩增完成后，将样品取出并保存于15℃环境中。
2. DNA琼脂糖凝胶电泳实验
2.1称取0.2g琼脂糖粉末，放到一锥形瓶中，加入适量的0.5×TBE电泳缓冲液。然后置微波炉加热至完全溶化，溶液透明。摇匀，待冷却至60℃左右，在胶液内加入适量的EB。2.2 取有机玻璃制胶板槽，在一端插好梳子，在槽内缓慢倒入已冷至60℃左右的胶液，使之形成均匀水平的胶面。
2.3 待胶凝固后，小心拔起梳子，使加样孔端置阴极段放进电泳槽内。
2.4 在槽内加入0.5×TBE电泳缓冲液，至液面覆盖过胶面。取1μl缓冲液和5μl待测DNA 样品混合后，用移液枪滴加至凝胶的加样孔中。
2.5 接通电泳仪和电泳槽，并接通电源，调节稳压输出，电压最高不超过5V/cm，开始电泳。点样端放阴极端。根据经验调节电压使分带清晰。
2.6 观察溴酚兰的带（蓝色）的移动。当其移动至距胶板前沿约1cm处，可停止电泳。2.7 在紫外透视仪的样品台上重新铺上一张保鲜膜，赶去气泡平铺，然后把凝胶放在上面。关上样品室外门，打开紫外灯，通过观察孔进行观察。
五、实验结果与讨论
如图所示：从左至右，分别是模版
1-8号，第9列为阴性对照。
前8列均有明显的条带出现，而阴
性对照无显示，说明扩增整体效果很
好。图中有上下两条线，上面一条线所
覆盖的条带基本可以代表扩增的产生
的片段位置，参照图可以看出扩增片段
在200bp左右。在第9个阴性对照的第
二条线处可以看到较为模糊的条带，并
非是出现假阴性，而是由于二聚物而产
生的条带。通过该条带与最右侧的
marker对比可知该片段出现在100bp左
右，并非由于实验操作等问题而产生的
污染。
实验的照片显示实验结果有拖尾
现象，但是并不影响后续实验。在实验
过程中由于有些试剂加到了管壁上面，
并没有完全加入，可能会出现一些误差。另外在第1列条带中出现了其他的亮带，可能是由于在前期的扩增实验中滴加试剂时由于量过少而进行的摇匀和融合等操作产生了非特异性扩增，也有可能是因为胶板制作过程中梳子的位置不合适或者胶板制作时边缘处不够均匀导致产生污染。但总体而言，实验结果较为满意。
六、实验注意事项
1.由于PCR技术非常敏感，可使一个DNA分子得以扩增，装有PCR试剂的离心管打开之前，应先在微量离心机上作瞬间离心使液体沉积于管底。PCR扩增反应的条件，要控制好温度、时间和循环次数。
2.最好在加完所有其它反应成分后才加模板DNA。
3.配琼脂糖时应使其完全溶化后方可制胶。
4.EB具有致癌作用，配制及使用时应带一次性手套。并在专门的实验室内使用。
七、实验收获
1.通过本次实验学习并掌握了PCR反应的基本原理、实验过程及技术。
2.通过本次实验掌握了电泳实验分离DNA的原理和方法。
八、思考题
1、如果你的研究中要扩增大肠杆菌某个酶的基因，你如何进行相关实验？
通过PCR扩增出想要的片段，然后通过凝胶电泳实验进行回收，并与合适的载体连接，转化进感受态细胞。经过培养提取质粒，进行酶切或PCR验证，测序最终验证，保存菌种2.一对引物序列为5‘-GACTCCAGTCGAATCTACCA-3’和
5‘-AACCGTGGCGACACCGCTAA请计算它们的Tm值及选择合适的退火温度，如果按你算的退火温度做PCR时没有得到相应的产物，你怎么解决？
5‘-GACTCCAGTCGAATCTACCA-3’
Tm值=4（G+C）+2(A+T)-(5～10℃)
=4（3+7）+2（6+4）-(5～10℃)
=60℃-(5～10℃)
=50~55℃
5‘-AACCGTGGCGACACCGCTAA’
Tm值=4（G+C）+2(A+T) -(5～10℃)
=4(5+7)+2(6+2) -(5～10℃)
=64℃-(5～10℃)=54~59℃
因此退火温度可以选择在55℃
可以通过分析几个逐步提高退火温度的反应以提高特异性。开始低于估算的Tm5℃，以2℃为增量，逐步提高退火温度。较高的退火温度会减少引物二聚体和非特异性产物的形成。为获得最佳结果，两个引物应具有近似的Tm值。引物对的Tm差异如果超过5℃，就会令引物在循环中使用较低的退火温度而表现出明显的错误起始。如果两个引物Tm不同，将退火温度设定为比最低的Tm低5℃或者为了提高特异性，可以在根据较高Tm设计的退火温度先进行5个循环，然后在根据较低Tm设计的退火温度进行剩余的循环。这使得在较为严紧的条件下可以获得目的模板的部分拷贝。
山脊线山谷线提取实验报告
山脊线山谷线提取实验报告 实验内容描述： 山脊线和山谷线构成了地形起伏变化的分界线（骨架线），因此它对于地形地貌研究具有重要意义；另一方面，对于水文物理过程研究而言，由于山脊、山谷分别代表示分水性与汇水性，山脊线和山谷线的提取实质上也是分水线与汇水线的提取。 本次实验通过某区域栅格DEM掌握山脊线和山谷线这两个基本地形特征信息的理论及其基于DEM的提取方法与原理；同时，熟练掌握利用ArcGIS软件对这两个地形特征信息的提取方法。 实验原理： 1.本实验基于规则格网DEM数据使用平面曲率与坡形组合法提取山脊线和山谷线，首先利用DEM数据提取地面的平面曲率及地面的正负地形，取正地形上平面曲率的大值即为山脊，负地形上平面曲率的大值为山谷。实际应用中，由于平面曲率的提取比较繁琐，而坡向变率（SOA）在一定程度上可以很好地表征平面曲率。因此，提取过程中可以SOA代替平面曲率。 2.主要用到以下理论知识： 1）坡向变率：是指在提取坡向基础上，提取坡向的变化率，亦即坡向之坡度（Slope of Aspect，SOA）。它可以很好地反应等高线弯曲程度； 2）反地形DEM数据：求取原始DEM数据层的最大高程值，记为H，通过公式（H-DEM），得到与原来地形相反的DEM数据层，即反地形DEM数据； 3）地面坡向变率SOA：地面坡向变率在所提取的地表坡向矩阵的基础上沿袭坡度的求算原理，提取地表局部微小范围内坡向的最大变化情况。但是SOA在提取过程中在北面坡将会有误差产生，所以要将北坡坡向的坡向变率误差进行纠正，其公式为： SOA=(( [SOA1]+[ SOA2] )-Abs( [SOA1]-[ SOA2] ))/2 其中：SOA1为原始DEM数据层坡向变率，SOA2为反地形DEM数据层坡向变率。 4）焦点统计 5）ArcScan自动矢量化 流程图
分子生物学综合实验报告
分子生物学综合试验报告
综合实验Ⅰ.Southern杂交 （质粒DNA提取、PCR技术体外扩增DNA、质粒载体和外源DNA的连接反应、 地高辛标记的Southern杂交） 一.实验目的 1.学习Southern杂交的原理及操作方法。 2.学习碱裂解法提取质粒的原理。 3.学习PCR反应的基本原理和实验技术；了解引物设计的一般要求。 4.掌握DNA体外连接的基本技能，了解连接反应的注意事项。 二.实验原理 利用染色体DNA与质粒DNA的变性与复性的差异而达到分离的目的。在碱变性条件下，染色体DNA的氢键断裂，双螺旋解开而变性，质粒DNA氢键也大部分断裂，双螺旋也有部分解开，但共价闭合环状结构的两条互补链不会完全分离，当pH=的乙酸钠将其pH调到中性时，变性的质粒DNA又恢复到原来的碱裂解法提取质粒的主要原理是：利用染色体DNA与质粒DNA的变性与复性的差异而构型，而染色体DNA不能复性，形成缠绕的致密网状结构，离心后，由于浮力密度不同，染色体DNA与大分子RNA、蛋白质-SDS复合物等一起沉淀下来而被除去。 聚合酶链反应（PCR）是体外酶促合成DNA片段的一种技术，PCR 进行的基本条件：DNA模板（在RT-PCR中模板是RNA）、引物、dNTP （dATP、dTTP、dGTP、dCTP）、Taq DNA聚合酶、反应缓冲体系。 PCR循环由三个步骤组成：变性、退火、延伸。每一个循环的产物可作为下一个循环的模板，通过30个左右循环后，目的片段的扩增可达106倍。
DNA片段之间的连接是通过DNA连接酶的催化实现的。DNA连接酶催化具有平末端或互补粘性末端的DNA片段间相邻碱基通过3’,5’磷酸二酯键连接起来。最常用的来源于T4噬菌体的T4DNA连接酶。对于平末端或互补的粘性末端可直接进行连接反应。一个片段是平末端，另一片段为粘性末端或两个片段都是粘性末端但不配对，则需要通过各种方式使其可一匹配或通过平末端进行连接。通常采用末端补平、加同聚物尾、加接头等方式是目的片段之间能够匹配。 地高辛随机引物法标记的原理：在随机引物法标记的反应液中，有随机合成的六聚核苷酸作为引物，dATP、dCTP、dGTP、dTTP和D1G-11-dUTP作为合成底物，以单链DNA作为模板，在Klenow酶的作用下，合成插入地高辛的DNA链。以地高辛标记的探针与靶基因DNA链杂交后，再通过免疫反应进行检测。一般通过酶标记地高辛抗体检测，就可以肯定杂交反应的存在。免疫检验一般用碱性磷酸酶系统，BClP/NBT显色，敏感性很高。 三．实验准备 1.实验材料： 含质粒的大肠杆菌DH5α，LB液体培养基， LB平板培养基 2.实验试剂： Taq DNA聚合酶，10×反应缓冲液（含25mmol MgCl2），dNTP，引物（P1、P2），溴乙啶 (EB) ，点样缓冲液Loading buffer（10×）：%溴酚蓝，40%甘油，目的基因及载体， 2×ligation 缓冲液，T4 DNA连接酶， L CaCl2，氨苄青霉素（100mg/mL）， TBE电泳缓冲液（5×）， DIG Random Labeling Mix（高效），Anti-DIG-AP Conjugate， BCIP/NBT Stock Solution，Blocking Reagent。 20×SSC：柠檬酸钠，3M NaCl，2×SSC：柠檬酸钠， NaCl， EDTA，变性液： NaOH， NaCl，中和度： Tris-HCl、、3M NaCl，Standard buffer：5×SSC、%(w/v) N-Lauroylsarcosine, % (w/v) SDS, 1% Blocking Reagent，Standard buffer+50% formamide，Anti-DIG-AP 碱性磷酸酶标记抗地高辛单抗体，BCIP/NBT储备液，冲洗液：0. 1M
果胶提取实验报告1
桔皮中果胶提取技术的试验分析 【摘要】酸浸提法提取果胶具有快速、简便、易于控制、提取率较高等特点，用盐酸浸提、乙醇沉淀法进行了从桔皮中提取果胶的工艺试验。用单因素试验进行工艺参数的优化，其适合的工艺条件是：液料质量比为20；浸提液pH值为2；浸提温度为90℃。 关键词：桔皮果胶提取工艺工艺参 引言：果胶是一种亲水性植物胶，属于多糖类物质，广泛存在于高等植物的根、茎、叶、果的细胞壁中。通常人们所说的果胶系指原果胶、果胶和果胶酸的总称，是一种高分子聚合物，分子量介于20 000-400 000之间。其基本结构是D一吡喃半乳糖醛酸，以1，4甙链连接成的长链，其中部分半乳糖醛酸被甲醇酯化 [1]。 胶凝剂、增稠剂、稳定剂和乳化剂，随着功能性多糖的开发研究，果胶作为水溶性膳食纤维，越来越受到重视。应用必定会越来越广泛[2-4]。我国是柑桔的主要产地，柑桔皮中果胶含量可达10%～30%。从桔皮中提取果胶不仅有极大的工业价值，而且对综合开发、利用柑桔资源，提高原材料利用率，减少环境污染，有重要的实际意义[2,4,6]。果胶的提取一般有酸提取法、离子交换法、微生物法和微波加热处理法等方法[5-9],由于酸提取法具有快速、简便且提取率高的优点，国内外大多采用此法。果胶分离沉淀主要有乙醇沉淀法和盐析法。国内主要采用乙醇沉淀法，而国外多用盐析法或不经沉淀直接喷雾干燥。针对我国情况而言，对乙醇沉淀法已有大量研究，而本实验也是在总结
别人成果的基础上进行对比以及提取工艺条件的优化。 1材料与方法 1．1 材料 桔皮采用成熟新鲜、无病虫果害的晚熟蜜桔，人工取皮，在40℃下干燥，粉碎至1～3 mm，待用。 盐酸、乙醇、氢氧化钠、无水氯化钙、冰醋酸和甲基红，均为化学纯。1．2 果胶提取方法 果胶提取工艺为：原料→洗涤→失活→干燥→粉碎→酸提取→过滤→浓缩→冷却→乙醇沉淀→离心分离→干燥→称量→粉碎→果胶。 剔除腐烂变质、发黑的桔皮，用清水洗净后，放入烧杯中，加水，加热至90 ℃保温5～10 min，使酶失活,捞出桔皮，将桔皮在40 ℃下干燥，切碎。将20 g原料加入用HC1预先配制的、具有一定pH值和温度的酸溶液中，维持所需的温度达到一定的提取时间，并不断搅拌。趁热用布氏漏斗过滤得果胶提取液。将滤液用旋转蒸发仪在60-70 ℃下浓缩至原体积的1／3时为止。果胶浸提液冷却至常温后加入1倍体积的95 乙醇，搅拌、静置2 h，使果胶沉淀析出。用布氏漏斗过滤得粗果胶。在60-70 ℃干燥，粉碎即得果胶粉。随后进行提取物中果胶含量的测定和提取率的计算。 1．3 试验方法 单因素试验,分别研究不同液料质量比对果胶提取率的影响(浸 提液pH值3、温度80℃、浸提时间45 min)；不同浸提液pH值对果胶提取率的影响(浸提液温度80℃、液料质量比10、浸提时间45 min)；不
生物实验4 实时定量PCR 实验报告
实验四定量PCR扩增 姓名：李宗翰专业：环境工程学号：1432999 同组人姓名：刘雪飞 一、实验目的 复习定量PCR原理，熟悉绝对定量的操作流程 二、实验原理 实时荧光定量PCR是在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号累积实时监测整PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。在PCR扩增的指数时期，模板的Ct 值和该模板的起始拷贝数存在线性关系，通过Ct值和标准曲线的分析对起始模板进行定量分析 三、实验仪器及材料 real time PCR仪(ABI7500, RotorGene 3000)，微量移液器，Tip头，0.2ml光学薄壁管，8联PCR管，1.5ml离心管，SYBR Mix，引物及108 copy/ul 标准品 四、实验步骤 1、标准样品稀释：取4个1.5ml的离心管，写上标记107，106, 105, 104，向每管加入90μl ddH2O，取10μl 108copy/ul 的标样加入到107管中，充分混匀后，从管中取10μl 107copy/ul的液体到106管中。按上述操作依次稀释，得到5个倍数的标准样品。注意，每次稀释都要换Tip头。 2、配制预混液：取119μl ddH2O、7μl引物4204f、7μl引物4448r和7μl Rox 到装有175μl SYBR Mix液的1.5ml离心管中，混匀。 3、分装预混液：取7个小离心管，分别标记108、107、106、105、10 4、UNK （未知样）、NTC（阴性对照）。向其中分别加入42μl预混液和4.7μl模板（1-5号加标样、6号加未知样、7号加等量ddH2O），混匀。 4、戴上手套取两个8联管，并排放置管架上。分别取上述样品20μl至第1-7管中（第8管空出），每个样品两个重复，共14个样品。将加好样的8联管振荡。 5、设置分析仪参数如下：95℃3min；95℃15s+60℃40s为一个循环，循环次数40，融解曲线温度范围60~95℃。振荡好的样品进机进行PCR扩增。 6、扩增后利用软件分析C T值及未知样的定量结果。
DNA提取及PCR扩增实验报告.doc
PCR扩增及DNA琼脂糖凝胶电泳 刘琳1131428 环境科学 一、实验目的 1．学习并掌握PCR扩增的基本原理与实验技术。 2．对扩增后的DNA进行琼脂糖凝胶电泳试验，并分析相应结果。 二、实验原理 1. PCR扩增 多聚酶链反应（PCR）技术的原理类似于DNA的天然复制过程。在微量离心管中加入适量缓冲液，加入微量模板DNA、四种脱氧核苷酸（dNTP）、耐热T aq聚合酶及两个合成DNA的引物，而后加热使模板DNA在高温下（94℃）变性，双链解链，这是所谓变性阶段。降低溶液温度，使合成引物在低温（55℃）与模板DNA互补退火形成部分双链，这是所谓退火阶段。溶液反应温度升至中温（72℃），在Tap酶作用下，用四种dNTP为原料，引物为复制起点，模板DNA的一条双链在解链和退火之后延伸为两条双链，这是延伸阶段。如此反复，在同一反应体系中可重复高温变性、低温退火和DNA合成这一循环，使产物DNA重复合成，并在重复过程中，前一循环的产物DNA可作为后一循环的模板DNA而参与DNA的合成，使产物DNA的量按指数方式扩增。经过30～40个循环，DNA扩增即可完成。 2. DNA琼脂糖凝胶电泳实验 DNA分子在高于其等电点的溶液中带负电，在电场中向阳极移动。在一定的电场强度下，DNA分子的迁移速度取决于分子筛效应，即分子本身的大小和构型是主要的影响因素。DNA分子的迁移速度与其相对分子量成反比。不同构型的DNA分子的迁移速度不同。该电泳方法以琼脂凝胶作为支持物，利用DNA分子在泳动时的电荷效应和分子筛效应，达到分离混合物的目的。 三、实验材料 仪器：PCR扩增仪、0.2ul薄壁管、1.5ml离心管、移液枪、枪头、微波炉、电泳仪、水平电泳槽、制胶版、紫外透射仪。 试剂：TapDNA聚合酶、dNTP、buffer、两种引物、16S全长DNA样本、无菌ddH2O、模板DNA 、TBE、琼脂糖、EB、显色剂。 四、实验步骤 1. PCR扩增 本次试验选择细菌16S rDNA V3区片段进行扩增。 1.1 根据计算，首先取1.5ml离心管按照 2.5ul 10×Buffer 、1 ul dNTP、0.5 ul 341GC、 0.5 ul 534、0.125 ul Taq、19.375u ddH2O的比例配置足量的PCR反应体系。 1.2 分别向9个薄壁管中分别加入24 ul的反应体系，并分别添加8种不同的模版，并于第9个薄壁管中加入无菌ddH2O作为阴性对照。 1.3 将薄壁管放入PCR扩增仪中，按照预定程序进行PCR扩增。其中循环过程需要达到30~40次。程序如下： 预变性：94℃3min 循环：94℃变性30s 55℃退火30s 72℃延伸30s 末次延伸：72℃5min
RT-PCR实验报告课件
逆转录pcr rt-pcr 为反转录rcr （reverse transcription pcr ）和实时pcr （real time pcr ）共同的缩写。逆转录pcr ，或者称反转录pcr(reverse transcription-pcr, rt-pcr) ，是聚合酶链式反应(pcr) 的一种广泛应用的变形。在rt-pcr 中，一条rna 链被逆转录成为互补dna，再以此为模板通过pcr 进行dna 扩增。 由一条rna 单链转录为互补dna(cdna) 称作“逆转录”，由依赖rna 的dna 聚合酶（逆转录酶）来完成。随后，dna 的另一条链通过脱氧核苷酸引物和依赖rna 的dna 聚合酶完成，随每个循环倍增，即通常的pcr 。原先的rna 模板被rna 酶h 降解，留下互补dna。 rt-pcr 的指数扩增是一种很灵敏的技术，可以检测很低拷贝数的rna 。rt-pcr 广泛应用于遗传病的诊断，并且可以用于定量监测某种rna 的含量。（检测基因表达的方法，参见northern blot 法。） rt-pcr 有时候也会指代实时pcr(real-time pcr) 。为了与逆转录pcr 相区别，通常被写作“定量pcr ”(quantitative pcr) 或者rtq-pcr(real-time quantitative pcr) 。 实时pcr 实时pcr(real-time pcr) ，属于定量pcr （q-pcr ）的一种，以一定时间内dna 的增幅量为基础进行dna 的定量分析。real time pcr 的定量使用萤光色素，目前有二种方法。 一种是在ds dna 中插入特异的萤光色素；另一种使用一种能与增幅dna 序列中特定寡核酸序 列相结合的一种萤光探针（probe ）。real time pcr 与reverse transcription pcr 相结合，能用微量的rna 来找出特定时间、细胞、组织内的特别表达的遗传基因。这两种rt pcr 的组合又被称之为“定量rt-pcr （quantitative rt-pcr ）” rt-pcr 技术相关试剂 oligo: 多聚体，相当于mrna 引物 amv （m-mlv）：逆转录酶 dntp ：脱氧核苷酸 rnase ：rna 酶抑制剂 pcr buffer ：rt-pcr 缓冲液 mgcl2 ：2 价镁离子 pcr 各步骤的目的 （一）预变性： 破坏dna 中可能存在的较难破坏的二级结构。使dna 充分变性，减少dna 复杂结构对扩增的影响，以利于引物更好的和模板结合，特别是对于基因组来源的dna 模板，最好不要吝 啬这个步骤。此外，在一些使用热启动taq 酶的反应中，还可激活taq 酶，从而使pcr 反应得以顺利进行。 （二）变性-- 退火-- 延伸循环： ①模板dna 的变性：模板dna 经加热至93℃左右一定时间后，使模板dna 双链或经pcr 扩增形成的双链dna 解离，使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮反应作准备； ②模板dna 与引物的退火( 复性) ：模板dna 经加热变性成单链后，温度降至55℃左右，引物与模板dna 单链的互补序列配对结合； ③引物的延伸：dna 模板-- 引物结合物在taqdna 聚合酶的作用下，以dntp 为反应原料，靶序列为模板，按碱基配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板dna 链互补的半保留复制链。 （三）pcr 仪扩增循环后72 度延伸10 分钟 用pcr 仪扩增时,( 变性. 退火, 延伸) 循环完成后, 继续72 度延伸了10 分钟的原因：
颗粒自由沉淀实验报告
建筑与测绘工程学院 《水处理实验设计与技术》 实验报告
实验1 颗粒自由沉淀实验 颗粒自由沉淀实验是研究浓度较低时的单颗粒的沉淀规律。一般是通过沉淀柱静沉实验，获取颗粒沉淀曲线。它不仅具有理论指导意义，而且也是给水排水处理工程中沉砂池设计的重要依据。 一、实验目的 加深对自由沉淀特点、基本概念及沉淀规律的理解。 掌握颗粒自由沉淀实验的方法，并能对实验数据进行分析、整理、计算和绘制颗粒自由沉淀曲线。 二、实验原理 浓度较低的、粒状颗粒的沉淀属于自由沉淀，其特点是静沉过程中颗粒互不干扰、等速下沉，其沉速在层流区符合Stokes （斯托克斯）公式。 但是由于水中颗粒的复杂性，颗粒粒径、颗粒相对密度很难或无法准确地测定，因而沉淀效果、特性无法通过公式求得而是通过静沉实验确定。 由于自由沉淀时颗粒是等速下沉，下沉速度与沉淀高度无关，因而自由沉淀可在一般沉淀柱内进行，但其直径应足够大，一般应使内径D ≥100mm 以免颗粒沉淀受柱壁干扰。 具有大小不同颗粒的悬浮物静沉总去除率η与截留沉速u 0剩余颗粒重量百分率P 的关系如下： ()dP P u u P s ?+-=00 001η ( 1 ) 此种计算方法也称为悬浮物去除率的累积曲线计算法。 设在一水深为H 的沉淀柱内进行自由沉淀实验，如图1所示。实验开始，沉淀时间为0，此时沉淀柱内悬浮物分布是均匀的，即每个断面上颗粒的数量与粒径组成相同，悬浮物浓度为C 0（mg/L ），此时去除率η=0。 实验开始后，不同沉淀时间t i ，颗粒最小沉淀速度u i 相应为： i i t H u = ( 2 ) 此即为t i 时间内从水面下沉到池底（此处为取样点）的最小颗粒d i 所具有的沉速。此时取样点处水样悬浮物浓度为C i ，而： 00 0011η=-=-=-i i i P C C C C C ( 3 ) 此时去除率η0，表示u ≥u i （d ≥d i ）的颗粒除去率，而：
PCR实验报告
PCR实验报告 7月19日高遄 实验目的：了解PCR技术原理，掌握最基础的PCR实验步骤。 实验试剂：模板DNA，Mg2+，buffer，dNTPs，Taq DNA聚合酶，引物，H2O，石蜡油。 实验原理： ●PCR全称聚合酶链反应，是体外快速扩增特定基因或DNA序列最常用的方法。 ●基本原理：首先将双链DNA分子在临近沸点的温度下加热分离成2条单链DNA分子，DNA聚合酶以单链DNA为模板并利用反应混合物中的四种脱氧核苷三磷酸合成新的DNA互补链。PCR反应时，只要在试管内加入模板DNA、PCR引物、四种核苷酸及适当浓度的Mg2+，DNA聚合酶就能在数小时内将目标序列扩增100万倍以上。 （1）双链模板DNA分子首先在高温下解开成长的单链，短链引物分子立即与该模板DNA 两端的特定序列相结合，产生双链区。 （2）DNA聚合酶从引物处开始复制其互补链，迅速产生与目标序列完全相同的复制品。（3）在后续反应中，无论是起始模板DNA还是经复制的杂合DNA双链，都会在高温下解开成为单链，体系中的引物分子再次与其互补序列相结合，聚合酶也再度复制模板 DNA。 （4）由于在PCR反应中选用的一对引物，是按照与扩增区域两端序列彼此互补的原则设计的，因此每一条新生链的合成都是从引物的退火结合位点开始并朝反方向延伸的，每一条新合成的DNA链上都有新的引物结合位点。 （5）整个PCR的反应全过程，即DNA解链（变性）、引物与模板DNA结合（退火）、DNA 合成（链的延伸）三步可以被不断重复。经多次循环之后，反应混合物中所含有的双链DNA分子数，即两条引物结合位点之间的DNA区段的拷贝数，理论上的最高值应该是2^n，能进一步满足遗传分析的需要。 ●试剂作用： （1）引物：DNA复制的起始点，针对复制DNA片段的两端，有5’引物和3’引物 （2）Taq DNA聚合酶：促进dNTPs与模板结合。 （3）Buffer：Tris-HCl反应缓冲液，Taq DNA聚合酶提供一个最适酶催反应条件。 （4）Mg2+：对PCR扩增效率影响很大，浓度过高可降低PCR扩增的特异性，浓度过低则影响PCR扩增产量甚至使PCR扩增失败而不出扩增条带。 （5）dNTPs：底物，在引物引导下合成与模板互补的DNA新链。 （6）石蜡油：防止PCR加热过程中DNA蒸发。 ●试剂配置体积： （1）热启动：94℃，5~10min （2）变性：94℃，45~60s。 （3）退火：50~65℃，1min。退火温度计算：Tm-（5℃~10℃），Tm（解链温度）=4（G+C）+2（A+T）。 （4）延伸：72℃，1~1.5min。 （5）步骤（2）~（4）热循环25~30个周期 （6）保温：延伸72℃，10min ●产物检测：凝胶电泳。
利用ArcGIS水文分析工具提取河网的具体操作
利用ArcGIS水文分析工具提取河网的操作ArcGIS 水文分析工具提取河网 DEM包含有多种信息，ArcToolBox提供了利用DEM提取河网的方法，但是操作比较烦琐（帮助可参看Hydrologic analysis sample applications），今天结合我自己的使用将心得写出来与大家分享。提取河网首先要有栅格DEM，可以利用等高线数据转换获得。在此基础上，要经过洼地填平、水流方向计算、水流积聚计算和河网矢量转化这几个不步骤。 1．洼地填平 DEM洼地（水流积聚地）有真是洼地和数据精度不够高所造成的洼地。洼地填平的主要作用是避免DEM 的精度不够高所产生的（假的）水流积聚地。洼地填平使用ArctoolBox->Spatial Analysis Tools->Hydrol ogy->Fill工具。 2．水流方向计算 水流方向计算就可以使用上一步所生成的DEM为源数据了（如果使用未经洼地填平处理的数据，可能会造成精度下降）。这里主要使用ArctoolBox->Spatial Analysis Tools->Flow Direction 工具。输入的DE M采用第一步的Fill1_exam1 3．水流积聚计算 这里主要使用ArctoolBox->Spatial Analysis Tools->Flow Accumulation工具流向。栅格数据就是第二步所获得的数据（FlowDir_fill1）。可以看到，生成的水流积聚栅格已经可以看到所产生的河网了。现在所需要做的就是把这些河网栅格提取出来。可以把产生的河网的支流的象素值作为阀值来提取河网栅格。
4．提取河网栅格 使用spatial analyst中的栅格计算器，将所有大于河网栅格阀值的象素全部提取出来。至于这个阀值是多少因具体情况而定。通常是要大于积聚计算后得到栅格的最低河流象素值。这里采用的是500这个值。最 后生成只有0、1值的栅格数据。其中1表示是河网，0是非河网。 5．生成河网矢量 这里主要使用ArctoolBox->Spatial Analysis Tools->Stream to Feature工具.Input Stream raster 为第 四步只有0、1值的河网栅格。流向栅格使用第二步所生成的栅格数据。
(完整版)咖啡因提取及鉴定实验报告
咖啡因提取及鉴定实验报告 题目：茶叶中咖啡因的提取分离及结构鉴定 实验目的： 1. 了解天然产物及其提取的概念和一般分离方法 2. 了解并学会使用回流提取的原理和操作 3. 了解如何用升华法提纯有机固体 4. 对从茶叶中提取咖啡因的整个过程必须了解 咖啡因的理化性质：咖啡因（含结晶水时）是无色针状结晶，味苦,能溶于水(2%)、乙醇（2%）、（氯仿12%）、苯（1%）等，在100℃时即失 去结晶水，并开始升华，120℃升华显著，178 ℃时升华很快， 融点为234.5 ℃，呈弱碱性。在植物中，咖啡因常与有机酸、 丹宁等结合呈盐的形式存在。咖啡因属于甲基黄嘌呤的生物 碱。纯的咖啡因是白色的，强烈苦味的粉状物。它的化学式是 C8H10N4O2。分子量，194.19 。 咖啡因的结构式： 实验原理：本实验从茶叶中提取咖啡因是用适当的溶剂（95%乙醇），在回流装置中连续提取并用蒸馏装置除去乙醇，得到粗制咖啡因，最后通 过升华提纯得到。 实验仪器及试剂：（1）仪器： 两个圆底烧瓶、两个三口烧瓶、一个直行冷凝管、两个1000ml烧杯、 两个500ml烧杯，两个50ml烧杯蒸发皿、玻璃漏斗、蒸馏头、水浴 锅、砂浴锅、温度计（250℃）、滤纸、刮刀、酒精灯、石棉网、电热 套 （2）试剂： 100g茶叶、乙醇（95%）、生石灰 实验步骤： 1.粗提8:00 称量茶叶100g并研碎 9:00 安装回流装置，将称量好的茶叶装入三口烧瓶中，并加入800ml 95%的乙醇。 9:30 开始回流
(1)连续萃取：称取100g绿茶叶，研细，放入回流提取装置中。在三 口烧瓶中加入95%乙醇，用电热套加热，连续提取。当提取液的 颜色变的很淡，立即停止加热。将仪器改成蒸馏装置，回收提取 液中的大部分乙醇。 (3)中和酸除水：残液倒入蒸发皿中，拌入生石灰40 g，在蒸气 浴上加热，不断搅拌，蒸干为止。随着温度升高，从浓绿色溶液变为糊状液。最后变为绿色粉末 (4)焙炒：把蒸发皿放在石棉网上，焙炒片刻，除尽水分。 2、升华 (1)仪器安装：在蒸发皿上放一张用大号针刺有许多小孔的圆 形滤纸，再把一只直径和蒸发皿相当的玻璃漏斗盖在上面，漏斗 颈部疏松地塞一小团棉花
实验二PCR扩增(聚合酶链式反应)
实验二 PCR扩增（聚合酶链式反应） 一、实验目的 1.学习聚合酶链式反应概念及技术方法； 2.掌握聚合酶链式反应操作过程。 二、实验原理（聚合酶链式反应） PCR是聚合酶链式反应，是以单链DNA为模板，4种dNTP为底物，在模板3’末端有引物存在的情况下，用酶进行互补链的延伸，多次反复的循环能使微量的模板DNA得到极大程度的扩增。在微量离心管中，加入与待扩增的DNA片段两端已知序列分别互补的两个引物、适量的缓冲液、微量的DNA膜板、四种dNTP溶液、耐热Taq DNA聚合酶、Mg2+等。 反应时先将上述溶液加热，使模板DNA在高温下变性，双链解开为单链状态；然后降低溶液温度，使合成引物在低温下与其靶序列配对，形成部分双链，称为退火；再将温度升至合适温度，在Taq DNA聚合酶的催化下，以dNTP为原料，引物沿5’→3’方向延伸，形成新的DNA片段，该片段又可作为下一轮反应的模板，如此重复改变温度，由高温变性、低温复性和适温延伸组成一个周期，反复循环，使目的基因得以迅速扩增。因此PCR循环过程为三部分构成：模板变性、引物退火、热稳定DNA聚合酶在适当温度下催化DNA链延伸合成 1．模板DNA的变性 模板DNA加热到90-95℃时，双螺旋结构的氢键断裂，双链解开成为单链，称为DNA的变性，以便它与引物结合，为下轮反应作准备。变性温度与DNA中G-C含量有关，G-C间由三个氢键连接，而A-T间只有两个氢键相连，所以G-C含量较高的模板，其解链温度相对要高些。故PCR中DNA变性需要的温度和时间与模板DNA的二级结构的复杂性、G-C含量高低等均有关。对于高G-C含量的模板DNA在实验中需添加一定量二甲基亚砜（DMSO），并且在PCR循环中起始阶段热变性温度可以采用97℃，时间适当延长，即所谓的热启动。 2．模板DNA与引物的退火 将反应混合物温度降低至37-65℃时，寡核苷酸引物与单链模板杂交，形成DNA模板-引物复合物。退火所需要的温度和时间取决于引物与靶序列的同源性程度及寡核苷酸的碱基组成。一般要求引物的浓度大大高于模板DNA的浓度，并由于引物的长度显著短于模板的长度，因此在退火时，引物与模板中的互补序列的配对速度比模板之间重新配对成双链的速度要快得多，退火时间一般为1-2min。 3．引物的延伸 DNA模板-引物复合物在Taq DNA聚合酶的作用下，以dNTP为反应原料，靶序列为模板，按碱基配对与半保留复制原理，合成一条与模板DNA链互补的新链。重复循环变性-退火-延伸三过程，就可获得更多的“半保留复制链”，而且这种新链又可成为下次循环的模板。延伸所需要的时间取决于模板DNA的长度。在72℃条件下，Taq DNA聚合酶催化的合成速度大约为40-60个碱基/秒。经过一轮“变性-退火-延伸”循环，模板拷贝数增加了一倍。在以后的循环中，新合成的DNA都可以起模板作用，因此每一轮循环以后，DNA拷贝数就增加一倍。每完成一个循环需2-4min，一次PCR经过30-40次循环，约2-3h。扩增初期，扩增的量呈直线上升，但是当引物、模板、聚合酶达到一定比值时，酶的催化反应趋于饱和，便出现所谓的“平台效应”，即靶DNA产物的浓度不再增加。
PCR扩增反应的操作实验报告1
PCR扩增反应的操作实验报告 实验原理: 以单链DNA为模板，4种dNTP为底物，在模板3’末端有引物存在的情况下，用酶进行互补链的延伸，多次反复的循环能使微量的模板DNA得到极大程度的扩增。在微量离心管中，加入与待扩增的DNA片段两端已知序列分别互补的两个引物、适量的缓冲液、微量的DNA膜板、四种dNTP溶液、耐热Taq DNA聚合酶、Mg2+等。反应时先将上述溶液加热，使模板DNA在高温下变性，双链解开为单链状态；然后降低溶液温度，使合成引物在低温下与其靶序列配对，形成部分双链，称为退火；再将温度升至合适温度，在Taq DNA 聚合酶的催化下，以dNTP为原料，引物沿5’→3’方向延伸，形成新的DNA片段，该片段又可作为下一轮反应的模板，如此重复改变温度，由高温变性、低温复性和适温延伸组成一个周期，反复循环，使目的基因得以迅速扩增。因此PCR循环过程为三部分构成：模板变性、引物退火、热稳定DNA聚合酶在适当温度下催化DNA链延伸合成。 实验步骤:一、PCR反应的条件 PCR反应条件为温度、时间和循环次数。 1．温度与时间的设置 （1）变性温度与时间：变性温度低，解链不完全是导致PCR失败的最主要原因。 一般情况下，93℃～94℃ lmin足以使模板DNA变性，若低于93℃则需延长时间，但温度不能过高，因为高温环境对酶的活性有影响。此步若不能使靶基因模板或PCR产物完全变性，就会导致PCR失败。 （2）退火（复性）温度与时间：退火温度是影响PCR特异性的较重要因素。变性后温度快速冷却至40℃～60℃，可使引物和模板发生结合。由于模板 DNA比引物复杂得多，引物和模板之间的碰撞结合机会远远高于模板互补链之间的碰撞。退火温度与时间，取决于引物的长度、碱基组成及其浓度，还有靶基序列的长度。对于20个核苷酸，G+C含量约50%的引物，55℃为选择最适退火温度的起点较为理想。 （3）延伸温度与时间：Taq DNA聚合酶的生物学活性：70～80℃，150核苷酸/S/酶分子；70℃，60核苷酸/S/酶分子；55℃，24核苷酸/S/酶分子；高于90℃时，DNA合成几乎不能进行。 （4）PCR反应的延伸温度一般选择在70～75℃之间，常用温度为72℃，过高的延伸温度不利于引物和模板的结合。PCR延伸反应的时间，可根据待扩增片段的长度而定，一般1kb以内的DNA片段，延伸时间1min是足够的。 3～4kb的靶序列需3～4min；扩增10kb需延伸至15min。延伸进间过长 会导致非特异性扩增带的出现。对低浓度模板的扩增，延伸时间要稍长些。 2．循环次数 循环次数决定PCR扩增程度。PCR循环次数主要取决于模板DNA的浓度，一般的循环次数选在30～40次之间，循环次数越多，非特异性产物的量亦随之增多。 二、PCR扩增产物分析 PCR产物是否为特异性扩增，其结果是否准确可靠，必须对其进行严格的分析与鉴定，才能得出正确的结论。PCR产物的分析，可依据研究对象和目的不同而采用不同的分析方法。
指纹提取实验报告
指纹提取实验报告 篇一:指纹实验报告 中央民族大学生命与环境科学学院遗传学实验报告人类指纹的采集识别与分析 2014年11月9日人类指纹的采集识别与分析前言 遗传学研究中根据遗传性状的表现特征将其分为两类，即数量性状(quantitative character)和质量性状(qualitative character)。质量性状通常差异显著，呈不连续变异， 由主基因决定，杂交子代的表型呈现出一定的比例，可直接采用孟德尔遗传原理进行分析。 数量性状不同于质量性状，数量性状是可以度量的性状，呈连续变异，由多基因决定，各基 因作用微小并且是累加的，呈剂量效应，因此通常要采用统计学方法分析。指纹性状就是属 于数量形状。 1880年hey fauld及william herschel相继提出利用指纹鉴定个人身份的 设想。 galton研究了有血缘关系的人群的指纹证明了指纹花样对人来说是一个稳定的性状。 1924 年挪威女科学家bonnevie提出指嵴数计数法。指纹在胚胎 发育第13周开始形成，第 19周完成。因此如有某种遗传或生理因素造成嵴纹发育不良既能在指纹上反映出来。本实
验中，同学采用石墨粉填充沟纹再用透明胶粘手指的方法取自己的指纹，并利用这些指纹进 行指嵴数计数、分析，从而对多基因遗传的特点有了更深刻地认识。 1. 材料和方法&设备和方法2b铅笔一只;约20cm×10cm的复印纸一张;透明胶带;直尺一把个人电脑及adobe photoshop软件;拍照设备一台。 2. 实验原理 1.人类指纹的形成:指纹是指人手上的条状纹路，它们的形成依赖 于胚胎发育时的环境 和遗传因素。指纹属于多基因遗传，在胚胎第12~13周(也有人提出15,16周)即已形成并 保持终生不变。每个人的指纹都是独一无二的，两人之间甚至双胞胎之间， 不存在相同的手 指指纹。拥有相同指纹的可能性在10亿分之一以下。因此指纹被称做是无法伪造的身份证。 对一个个体而言，指纹具有唯一性和稳定性。 2.肤(皮纹)与指纹皮纹包括指纹、掌纹和褶纹。指纹为最常用的 皮纹。大量研究表明， 某些遗传病，特别是一些染色体病和先天畸形常伴有特殊的皮纹异常。所以 皮纹检查可以 作为某些遗传病诊断的辅助指标。 3.指纹分析的常用指标—— a.类型——3类:弓(a) ，箕(l)，斗(w) ,6亚类:as ，at ; lu ，lr ; ws，wd ;b.总嵴纹数——trc (tfrc ，指纹总嵴线数 c.atd角d.指纹强度指数(pattern intensity index, pid )——pid = (2 w +l)
质粒DNA的提取实验报告
质粒DNA的提取 一、实验方法 碱裂解法抽提质粒DNA 二、实验原理 基于质粒DNA与染色体DNA变性与复性的差异。 三、实验步骤 1）质粒提取 1. 10,000g,1min离心收集1.5－5ml菌液沉淀于1.5ml离心管中。 2. 加入100μl溶液1，振荡至彻底悬浮。 3. 加入200μl溶液2，立即轻柔颠倒离心管6次，使菌体充分裂解，随后将离心管冰上放置3分钟 4. 加入150μl溶液3，立即温和颠倒离心管数次，冰上放置3分钟，10，000g离心10min。 5. 将步骤4的上清转移至新的离心管（尽量去除杂质），加入等体积的苯酚/氯仿/异戊醇混合均匀10，000g离心5min。 6. 将步骤5的上清转移至新的离心管，加入2倍体积的无水乙醇，室温放置5－10min，沉降DNA 7. 10，000g离心10分钟,弃乙醇，保留沉淀，加入1ml 70％的乙醇洗涤沉淀，10，000g离心5分钟 8. 倒掉乙醇溶液，用吸水纸吸净管壁上的水珠，室温蒸发痕量乙醇 9. 加入适量含RNase的TE或灭菌双蒸水溶解质粒DNA 2）质粒鉴定→琼脂糖凝胶电泳 灌胶：胶中加入荧光染料(SYBR Green I) 加样：质粒+上样缓冲液→混匀 电泳 结果观察：UV灯下 四、实验结果 五、实验分析 裂解细胞中除含有质粒DNA外，还含有基因组DNA、各种RNA、蛋白质和脂类等物质，因此用碱裂解法除去杂质 1、防止DNA裂解：Solution 1 1）、所含糖增加溶液黏度，维持渗透压，防止DNA受机械剪切作用降解 2）、所含EDTA抑制酶活性 2、溶解与变性：Solution2 1)强碱使质粒DNA和染色体DNA变性
PCR实验报告
PCR实验报告 7月19日高遗 实验目的：了解PCF技术原理，掌握最基础的PCF实验步骤。 实验试剂：模板DNA Mg2+ buffer，dNTPs Taq DNA聚合酶，引物，H2Q石蜡油。实验原理：PCF全称聚合酶链反应，是体外快速扩增特定基因或DNAJ列最常用的方法。 基本原理：首先将双链DNA分子在临近沸点的温度下加热分离成2条单链DNA分子，DNA聚合酶以单链DNA为模板并利用反应混合物中的四种脱氧核苷三磷酸合成新的DNA互补链。PCF反应时，只要在试管内加入模板DNAPCF引物、四种核苷酸及适当浓度的Mg2+ DNA聚合酶就能在数小时内将目标序列扩增100万倍以上。 (1)双链模板DNA分子首先在高温下解开成长的单链，短链引物分子立即与该模板DNA 两端 的特定序列相结合，产生双链区。 (2)DNA聚合酶从引物处开始复制其互补链，迅速产生与目标序列完全相同的复制品。 (3)在后续反应中，无论是起始模板DNA还是经复制的杂合DNA双链，都会在高温下解开 成为单链，体系中的引物分子再次与其互补序列相结合，聚合酶也再度复制模板DNA (4)由于在PCR反应中选用的一对引物，是按照与扩增区域两端序列彼此互补的原则设计 的，因此每一条新生链的合成都是从引物的退火结合位点开始并朝反方向延伸的，每一条新合成的DNA链上都有新的引物结合位点。 (5)整个PCR勺反应全过程，即DNA解链(变性)、弓I物与模板DNA吉合(退火)、DNA 合 成(链的延伸)三步可以被不断重复。经多次循环之后，反应混合物中所含有的双 链DNA分子数，即两条引物结合位点之间的DNA区段的拷贝数，理论上的最高值应该是25，能进一步满足遗传分析的需要。 试剂作用： (1)引物：DNA M制的起始点，针对复制DNA片段的两端，有5'引物和3'引物 (2)Taq DNA聚合酶：促进dNTPs与模板结合。 (3)Buffer : Tris-HCl反应缓冲液，Taq DNA聚合酶提供一个最适酶催反应条件。 (4)Mg2+:对PCF扩增效率影响很大，浓度过高可降低PCF T增的特异性，浓度过低则影 响PCF扩增产量甚至使PCF扩增失败而不出扩增条带。 (5)dNTPs：底物，在引物引导下合成与模板互补的DNA新链。 (6)石蜡油：防止PCF加热过程中DNA蒸发。 试剂配置体积： 温度和时间： (1) 热启动：94C，5~10min (2) 变性：94C，45~60s。 (3) 退火：50~65C，1min。退火温度计算：Tm- (5C~10C)，Tm(解链温度)=4 (G+C +2 (A+T)o (4) 延伸：72C，1~1.5min。 (5) 步骤(2) ~ (4)热循环25~30个周期 (6) 保温：延伸72C，10min 产物检测：凝胶电泳。 实验步骤: (1)设计20卩l体系各试剂配比:
实验四-逆转录PCR-(RT-PCR)
实验四-逆转录PCR-(RT-PCR)
实验四逆转录PCR (RT-PCR) 【实验目的】 1．了解用逆转录PCR法获取目的基因的原理。 2．学习和掌握逆转录PCR的技术和方法。 【实验原理】 聚合酶链式反应（PCR）过程利用模板变性，引物退火和引物延伸的多个循环来扩增DNA序列。因为上一轮的扩增产物又作为下一轮扩增的模板，是一个指数增长的过程，使其成为检测核酸和克隆基因的一种非常灵敏的技术。一般经25-35轮循环就可使模板DNA扩增达106 倍。RT-PCR将以RNA为模板的cDNA（complement DNA）合成（即RNA的反转录（RT，reversetranscription）），同cDNA 的PCR结合在一起的技术，提供了一种基因表达检测、定量和cDNA克隆的快速灵敏的方法。由于cDNA 包括了编码蛋白的完整序列而且不含内含子，只要略经改造便可直接用于基因工程表达和功能研究，因此RT-PCR成为目前获得目的基因的一种重要手段。 RT-PCR技术灵敏而且用途广泛，可用于检测细胞中基因表达水平、表达差异，细胞中RNA病毒的含量和直接克隆特定基因的cDNA序列。RT-PCR比其他包括Northern印迹、RNase保护分析、原位杂交及S1核酸酶分析在内的RNA分析技术，更灵敏，更易于操作。 RT-PCR的基本原理（图4.1）。首先是在逆转录酶的作用下从RNA合成 cDNA，即总RNA中的mRNA在体外被反向转录合成DNA拷贝，因拷贝DNA的核苷酸序列完全互补于模板mRNA，称之为互补DNA（cDNA）；然后再利用DNA聚合酶，以cDNA第一链为模板，以四种脱氧核苷三磷酸（dNTP）为材料，在引物的引导下复制出大量的cDNA或目的片段。 在RT时，有3种引物可选择（表4.1) 。用1）和2）方法，理论上是扩增的所有的cDNA，还要用此产物做PCR的模板继续扩增。如果用3）方法，先要去https://www.360docs.net/doc/6d2480461.html,查它的序列，并用oligo等软件设计引物。 RT-PCR可以一步法或两步法的形式进行。两步法RT-PCR比较常见，在使用一个样品检测或克隆多个基因的mRNA时比较有用。在两步法RT-PCR中，每一步都在最佳条件下进行。cDNA的合成首先在逆转录缓冲液中进行，然后取出1/10的反应产物进行PCR。而一步法RT-PCR具有其它优点（表4.2），cDNA合成和扩增反应在同一管中进行，不需要打开管盖和转移，有助于减少污染。还可以得到更高的灵敏度，最低可以达到0.1pg总RNA，因为整个cDNA样品都被扩增。对于成功的一步法 RT-PCR，一般使用基因特异性引物(GSP)起始cDNA的合成。 由图4.1不难看出，随机引物法是三种方法中特异性最低的。引物在整个转录本的多个位点退火，产生短的，部分长度的cDNA。这种方法经常用于获取5'末端序列及从带有二级结构区域或带有逆转录酶不能复制的终止位点的RNA模板获得cDNA。为了获得最长的cDNA，需要按经验确定每个RNA样品中引物与RNA的比例。随机引物的起始浓度范围为50到250ng每20μl反应体系。因为使用随机引物从总RNA合成的cDNA主要是核糖体RNA，所以模板一般选用poly(A)+RNA。 Oligo(dT)起始比随机引物特异性高。它同大多数真核细胞mRNA 3'端所发现的poly(A)尾杂交。因为poly(A)+RNA大概占总RNA的1%到2％，所以与使用随机引物相比，cDNA的数量和复杂度要少得多。因为其较高的特异性，oligo(dT)一般不需要对RNA和引物的比例及poly(A)+选择进行优化。建议每20μl反应体系使用0.5μg oligo(dT)。oligo(dT)12-18适用于多数RT-PCR。 基因特异性引物（GSP）对于逆转录步骤是特异性最好的引物。GSP是反义寡聚核苷，可以特异性地同RNA目的序列杂交，而不象随机引物或oligo(dT)那样同所有RNA退火。用于设计PCR引物的规则同样适用于逆转录反应GSP的设计。GSP可以同与mRNA 3'最末端退火的扩增引物序列相同，