混合培养中晶体磷酸铁的异化还原能力

混合培养中晶体磷酸铁的异化还原能力

孙宏飞，曲东*，张磊

(西北农林科技大学资源环境学院，陕西杨凌 712100)

[摘 要]采用厌氧混合培养方法，以3种典型的水稻土浸提液作为接种液，研究了晶体磷酸铁的微生物还原过程。以Fe(II)浓度及游离磷酸盐浓度变化为指标，探讨了不同来源的微生物导致的晶体磷酸铁还原反应及对不同碳源利用能力的差异。结果表明，3种来源于水稻土的微生物均能够利用葡萄糖、乙酸盐以及丙酮酸盐作为唯一电子供体，使晶体磷酸铁发生异化生物代谢，产生Fe(II)并释放磷酸盐，并且Fe(II)产生量与磷酸盐释放具有极显著的相关关系；晶体磷酸铁的还原速率及铁还原量明显低于无定型氧化铁，导致这一现象的原因可能与形成蓝铁矿有关；体系中可溶性磷酸盐数量对利用葡萄糖为碳源的铁还原反应有显著的影响，在缺乏可溶性磷酸盐的环境下，可能通过抑制发酵微生物生长，阻断了葡萄糖发酵生成有机酸和H2的过程，从而使磷酸铁的异化还原不能发生。

[关键词] 晶体磷酸铁；异化Fe(III)还原；不同碳源利用；水稻土

[中图分类号] [文献标识码] A [文章编码]

微生物介导的铁还原对厌氧环境中磷素的地球生物化学循环过程有着显著的影响。研究表明，南方酸性和中性水稻土磷的释放与铁的氧化还原密切相关[1~3]。稻田土壤磷的有效性在很大程度上受铁形态转化的制约，淹水过程能使氧化铁还原，导致土壤中磷素有效性的明显提高及无机磷形态的变化[4]。章永松[5]提出，淹水过程可导致结晶度差的铁氧化物的增多，引起土壤对磷的吸附量显著增加。而曹宁等[4]的研究表明，无定型铁氧化物的还原无疑导致了吸附态磷的释放。在土壤的无机磷形态中，晶体态磷酸铁是Fe-P的重要组成部分。那么，淹水过程能否引起晶体态磷酸铁的迅速还原呢？虽然普遍认为晶体磷酸铁具有一定的生物有效性，但目前仍缺少确切的实验数据证明晶体磷酸铁的微生物还原潜力。对于土壤中铁的氧化还原过程研究主要集中在氧化铁矿物的转化，而针对晶体态磷酸铁的研究资料较少。针对不同氧化铁的纯培养试验发现[6]，比表面积大的无定型氧化铁（ferrihydrite）和弱晶体氧化铁（如纤铁矿，lepidocrocite）能够被铁还原微生物全部及部分还原，而针铁矿和赤铁矿等晶体氧化铁的微生物还原速率极低。不同水稻土中的铁还原研究表明[7]，微生物还原的铁可占土壤总铁量的20%左右，占游离氧化铁的60%～75%，而且无定型氧化铁仅占微生物还原铁的50%~65%，说明其中晶体态铁的还原同样具有重要地位。所以，探明这些晶体铁的还原，对于深入认识土壤中微生物铁还原机理具有重要的理论意义。目前，针对微生物铁还原的研究多都是以水稻土或沉积物为研究模式来进行的[8，9]。这虽然比较真实的反映了这一过程的自然特征，但由于水稻土中影响因素复杂，背景干扰大，数据分析比较困难。因此，本研究采用混合培养方法，以晶体磷酸铁为铁源，通过接种不同来源的土壤微生物，以期探讨厌氧培养条件下晶体磷酸铁的生物还原能力及在不同碳源条件下还原能力的差异。

1 材料和方法

1.1供试土壤及接种液制备

供试的水稻土样品分别采自吉林省吉林市丰满区前二道乡、四川省邛崃市迥龙镇、江西省安福县竹江乡店上村。先后于2000年2~9月采集0~20cm耕层土壤，自然风干，磨细，过1mm筛。土样的基本性质参见文献[9]。将风干过1 mm筛的供试水稻土以m（水稻土）∶v（去离子水）= 1∶9的比例在30 ℃下淹水1周。将培养后的土样置离心机中，于700 r/min离心10 min，取上清液用作微生物接种液。来源于3种水稻土的接种液分别用“SC”（由四川水稻土样品中提取的微生物）、“JL”（由吉林水稻土样品中提取的微生物）和“JX”（由江西水稻土样品中提取的微生物）表示。

[收稿日期]

[基金项目] 教育部博士学科点专项科研基金（20020712009）；国家自然科学基金（40271067）

[作者简介] 孙宏飞，女，河南周口人，在读硕士，主要从事环境化学方向的研究。

[通讯作者] 曲东（1960-），男，河南陕县人，教授，博士，主要从事土壤环境化学方向的研究。E-mail:dongqu@https://www.360docs.net/doc/6e4728020.html,。

1.2 供试铁源

试验采用晶体磷酸铁为铁源，将其配制成含铁量为581.2mg/L 的悬液，用超声波分散。为了比较磷酸铁的还原程度，试验中以人工合成的无定形氧化铁[ferrihydrite ，用Fe (OH )3表示]作为对比。无定形氧化铁按照Schwertmann 的方法合成[10]。制备的Fe (OH )3悬液用AAS 法测定的铁含量为576.6mg/L 。

1.3 微生物营养来源

混合培养中提供微生物生长所需的碳源为10mmol/L 的葡萄糖、乙酸盐和丙酮酸，氮源为1.0g/L 的NH 4Cl 。为了强化微生物活性，设置了添加5mmol/L 的磷酸缓冲液[11]（KH 2P04-K 2HPO 4摩尔比为0.5809）的处理。微生物所需的其它元素和生长因子由接种液来提供。 1.4 试验方案及测定方法

试验按铁源分为晶体磷酸铁和无定形氧化铁处理；按碳源种类分为葡萄糖、乙酸盐和丙酮酸盐处理；按接种液的来源分为3种，即SC、JL和JX；磷源设置添加磷酸缓冲液及不添加磷酸缓冲液的处理（用1ml无菌水补充），以比较磷酸盐对磷酸铁还原的影响。在研究晶体磷酸铁微生物还原能力的处理中，选用葡萄糖作为碳源，并加入氮源和磷源，同时设置相同碳、氮、磷源条件下以无定形氧化铁为铁源的处理作为对照；在研究不同碳源条件下磷酸铁还原能力的处理中，选用葡萄糖、乙酸盐和丙酮酸盐作为碳源，加入氮源，但不添加磷源，以上各处理中分别接种3种不同来源的接种液。培养试验中采用10ml的血清瓶，分别加入铁源、碳源、氮源、磷源及接种液各1ml。培养试验所用的磷酸铁悬液、Fe (OH )3悬液、磷酸缓冲液及NH 4Cl直接采用高压灭菌，葡萄糖、乙酸盐和丙酮酸盐等碳源采用细菌滤器（<0.22μm）过滤除菌。充氮除氧后于30℃下避光恒温培养。采样及测定方法见参考文献[9]。

2 结果与分析

2.1 晶型磷酸铁的微生物还原

磷酸铁悬液中接种3种水稻土微生物后Fe(II)产生量的变化由图1所示。在混合培养中不同处理都表现为随培养时间的延长Fe(II)产生量不断增大，说明来源于3种水稻土的厌氧微生物都能以葡萄糖作为电子供体还原磷酸铁，证明晶体FePO 4具有一定的生物还原能力。异化Fe(III)还原是微生物介导的生物学过程，与微生物的生长密切相关，所以可用表征微生物生长动力学的Logistic 方程描述。Logistic 方程的表达式为：Y=a/[1+b·exp(-cx)]。用Logistic 方程拟合的晶体FePO 4还原过程的参数见表1。利用参数a 可得出Fe(III)还原的最大潜势，即最大Fe(II)累积量；参数c 表示速率常数；用参数a 和c 可求出最大反应速率Vmax ，其数值等于0.25ac ；最大Fe(II)累积量和加入氧化铁量的比值可以得出Fe(III)的还原率；r 和s 分别表示相关系数和偏差。

表1用Logistic 方程拟合的磷酸铁还原参数

Table 1 The Logistic model fits of dissimilatory Ferric phosphate reduction in different treatments

Logistic 方程参数 Logistic model parameters 处理 Treatments

a b c r s

Fe(III)还原率(%) Reaction rate

Vmax mg/(L ·d )

SC 325.3 15.37 0.181 0.994 16.04 67.60 14.68 JL 395.7 19.87 0.073 0.989 13.37 82.23 7.172 JX

403.2 20.73 0.090

0.996 11.03

83.79 9.112

由表1看出，不同来源的微生物所进行的铁还原反应的速率有所不同，来源于四川水稻土的微生物（SC）导致的铁还原的速率最快，Vmax 为14.68 mg/(L ·d )，而吉林（JL）和江西水稻土的微生物（JX）的铁还原速率(Vmax )分别为7.172和9.112 mg/(L ·d )。到培养结束时，接种四川和江西水稻土的微生物的富集培养中累积的Fe(II)相同，而接种吉林土的微生物的培养中Fe(II)累积量则相对较少。吉林和江西水稻土的微生物还原磷酸铁的潜力较大，表现为用Logistic 方程拟合的最终Fe(III)量计算的潜在铁还原率较高，可达到82.23%和83.79%，而接种四川水稻土微生物的处理仅

为67.60%。

不同来源微生物对无定型氧化铁的还原情况如图2所示。SC处理在厌氧培养3d后其铁还原反应就达到平衡，Fe(II)累积量达到了最大值，还原率为95.3%。JL和JX处理的铁还原在21d后才快速增加，Fe(II)的产生量在32d后达到最大值，其Fe(III)还原率分别为92.1% 和96.3%。这一结果一方面说明3种水稻土中的微生物均能使Fe(III)还原为Fe(II)，另一方面也表明无定型氧化铁比晶型磷酸铁更易被微生物还原。比较图1和图2发现，从两种形态的铁还原速率来看，在培养前期都是SC处理进行得最快，其次为JX处理，最后是JL处理。晶型磷酸铁的微生物还原速率整体上小于无定

型铁。Fe(III)被微生物还原后产生的Fe(II)主要以菱铁矿（FeCO 3）

、磁铁矿（Fe 3O 4）或蓝铁矿[Fe 3(PO 4)2·8H 2O]等形式存在。在微生物利用无定型氧化铁的还原试验中，产生的菱铁矿是主要产物，其可以被0.5mol ·L -1的HCl溶解，产生的Fe 2+可以用比色法测定。在反应温度较高时中会有很少量的黑色磁铁矿出现，可通过磁性法检测。磁铁矿不能被稀HCl浸提，同时结合的Fe(III)也难以被微生物还原[6]，这可能是无定型铁的还原率未达到100%的主要原因之一。在晶型磷酸铁的还原过程中，由于还原反应同时产生大量的磷酸盐，将会显著增加形成蓝铁矿的数量。同样，蓝铁矿中的Fe(II)也不易被稀HCl浸提，所以导致测定出的最终Fe(III)还原量及计算出的铁还原率比无定型氧化铁处理显著偏低。

F e （I I ）浓度/m g -1

L F e （I I ）c o n c e n t r a t i o n

培养时间/d Incubation time

F e （I I ）浓度/m g -1

L F e （I I ）c o n c e n t r a t i o n

培养时间/d Incubation time

图1不同来源的微生物对磷酸铁的异化还原 图2不同来源的微生物对无定型铁的异化还原 Fig.1 Dissimilatory reduction of Ferric phosphate by Fig.2 Dissimilatory reduction of Phosphorus by

different resources of microbe

different resources of microbe

2.2 磷酸铁生物还原过程中磷素的累积

接种不同微生物的磷酸铁还原过程中磷酸盐的释放情况由图3所示。由于体系中加入了一定数量的磷酸盐缓冲液，所以图中的数值为测定的磷酸盐量减去加入量所得的结果。

释放的磷浓度/m g -1

L R e l e a s e d P c o n c e n t r a t i o n

培养时间/d Incubation time

图3磷酸铁生物还原过程中磷素的释放

Fig.3 Released phosphate during dissimilatory reduction of Ferric phosphate

由图3可以看出，PO 43-

产生的趋势与Fe(II)的累积趋势一致。在接种四川水稻土微生物的厌氧

培养中，前26d的PO 43-产生速率很快，随后趋于稳定；接种江西和吉林水稻土微生物的培养中，PO 43-产生速率在培养21d后才迅速增大，3个处理中磷酸盐的释放量也表现：SC>JX>JL，在培养后期后2

种处理仍然表现出不断增加的趋势。由晶型磷酸铁还原反应产生的Fe(II)与磷酸盐数量比较，体系中测定的磷酸盐数量相对偏少，其原因还有待进一步深入探讨。但游离磷酸盐产生量与Fe(II)的累积具有相同趋势已充分说明了晶型磷酸铁可被微生物还原利用的事实。 2.3不同碳源条件下磷酸铁的异化还原及磷酸盐的释放

铁还原微生物对不同碳源的利用能力一直是广泛关注的问题之一，Lovley发现的GS-15菌株是

一种以乙酸盐为唯一电子供体的铁还原菌[12]，

表明不同铁还原微生物可能具有不同的碳源利用特征[4, 9, 13]

。考虑到混合培养中铁还原微生物可能存在共营养和共代谢的因素，试验中分别选用了葡萄糖

（Glu），乙酸盐（Ac -）和丙酮酸盐（Pyr）3种碳源，并且在反应体系中不加入磷缓冲液，其微生物生长所需要的磷将依赖磷酸铁还原产物来提供。

如图4、5和6中的左图所示，以不同碳源为电子供体的铁还原微生物均经历了一定的适应期后才开始还原反应。3种碳源处理中，以丙酮酸为碳源的铁还原启动最快，厌氧培养16d 后Fe(II)产生量开始迅速增加，其还原速率最快，Fe(II)累积量也最多；以乙酸盐为碳源的铁还原启动相对较慢，且接种3种来源的微生物所表现出的铁还原反应的启动时间有所不同，表现为SC>JL>JX 处理，而铁还原反应速率和Fe(II)累积量表现为JX>JL>SC 处理的结果；以葡萄糖为碳源的磷酸铁的还原中，总体上铁还原反应最慢，Fe(II)的累积也很少，表明在缺少可溶性磷源的环境中微生物利用葡萄糖为碳源的铁还原过程受到明显的抑制。从碳源利用情况来看，相同摩尔数的丙酮酸较容易被利用，但丙酮酸是3个C 原子而乙酸盐是2个C 原子，不易比较，但所加入的碳源相对于电子受体来说始终是过量的，仍然可以认为丙酮酸更易被利用。

F e (I I ) / m g L

-1

培养时间 / d Incubation time P O 43-

/ m g L

-1

培养时间 / d Incubation time

图4四川水稻土微生物还原FePO 4时Fe(II)和PO 43-的产生量

Fig.4 Concentration of Fe(II) and PO 43- when Ferric phosphate is reduced by anaerobe of Sichuan paddy

F e (I I ) / m g L

-1

培养时间/d Incubation time

P O 43-

/m g L

-1

培养时间/d

Incubation time

图5吉林水稻土微生物还原FePO 4时Fe(II)和PO 43-的产生量

Fig.5 Concentration of Fe(II) and PO 43- when Ferric phosphate is reduced by anaerobe of Jilin paddy

F

e

(

I

I

)

/

m

g

L

-

1

培养时间/d

Incubation time

P

O4

3

-

/

m

g

L

-

1

培养时间 / d

Incubation time

图6江西水稻土微生物还原FePO4时Fe(II)和PO43-的产生量

Fig.6 Concentration of Fe (II) and PO43- when Ferric phosphate is reduced by anaerobe of Jiangxi paddy 图4、5和6中的右图反映了不同碳源利用条件下磷酸铁还原过程中磷素的释放情况。厌氧培养过程中磷酸盐的产生的累积与Fe(II)的累积有相同趋势。

3 讨 论

由上述结果可以看出，难溶性的晶体磷酸铁具有一定的微生物还原能力。以磷酸铁为铁源的各处理的培养体系中，Fe(Ⅱ)累积量和PO43-的产生量之间呈线性相关关系，相关系数在0.983～0.999之间，达到了极显著水平（P<0.01），且PO43-产生的趋势与Fe(II)的累积趋势一致，Fe(Ⅱ)和PO43-产生过程同步进行。这一结果为水稻土淹水条件下有效磷含量增加的试验结果[4]提供了新的理论依据，同时也为晶体态铁（III）化合物的微生物还原可能性提供了新的证据。微生物的来源，不同的碳源及磷酸盐的存在与否都会对铁（III）的还原反应产生显著影响，表明不同来源微生物的铁还原反应中碳源利用特征不同。丙酮酸是铁还原微生物易于利用的电子供体，在限制可溶性磷源的环境中微生物可直接利用丙酮酸和乙酸盐为碳源和能源使铁（III）还原，而对于利用葡萄糖的铁还原反应来说，可溶性磷源是重要的限制因素。铁还原微生物不是直接利用葡萄糖，而是以葡萄糖的发酵产物如乙酸、甲酸、丙酸和氢气等作为异化铁还原微生物代谢利用的碳源和能源。无机磷作为发酵微生物必需的营养基质，磷素缺乏将抑制发酵微生物的生长繁殖，导致葡萄糖发酵产氢和产生有机酸过程的强烈抑制，从而使得利用其产物为碳源的铁（III）还原过程难以发生。这与Dassonville[14]报道的外加的葡萄糖在厌氧水稻土培养期间被发酵后才可能被硫酸盐还原菌和产甲烷菌利用的结果是一致的。因此，选择葡萄糖作为碳源时，必须补充适量的磷源才能促进厌氧铁还原过程进行。另一方面，在含有充足磷酸盐的体系中，铁还原过程常会产生蓝铁矿[15]，将会使部分磷酸盐被固定，从而影响铁的氧化还原循环及磷酸盐的有效性，在土壤环境化学研究中应加以重视。

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Dissimilatory reduction capability of crystal ferric phosphate

in enrichment cultivation

SUN Hong-fei, QU Dong, ZHANG Lei

(College of Resources and Environmental Science, Northwest A & F University, Yangling, Shaanxi 712100, China)

Abstract: The process of dissimilatory reduction of Ferric phosphate by microbs is investigated through adopting anaerobic enrichment cultivation in which three kinds of water-extracted paddy soil solution were inoculated and ferric fhosphate as election acceptor of dissimilatory iron respiration was added. Offering three kinds of microbes different substrates, the differences of reductive ability are discussed when Fe(II) and dissociative phosphate concentration are determined during anoxic incubation. The results show that microbs coming from three paddies metabolize Ferric Phosphate utilizing glucose, acetate and pyruvate as only electron donor and release Fe(II) and phosphate. Besides both are closely correlated. Mean reductive rate and Fe(II) accumulation of ferric phosphate are less than those of amorphous Fe(III). One of probable causes is the formation of Vivianite[Fe3(PO4)2·8H2O]. In enrichment cultivation dissoluble phosphate has a distinct effect on dissimilatory iron reduction when utilizing glucose as substrate. Fermentive microbes are inhibited without dissoluble phosphate, and glucose couldn’t run acidogenic fermentation to produce organic acid and H2. Consequently dissimilatory reduction of Ferric phosphate can’t occur.

Keywords: crystal ferric phosphate; dissimilatory Fe(III) reduction; different substrates; paddies