内脏脂肪素对巨噬细胞MMP-9的作用及其机制探讨

内脏脂肪素对巨噬细胞MMP-9的作用及其机制探讨

范虞琪;何奔;王彬尧

【摘要】目的研究内脏脂肪素(visfatin)对巨噬细胞基质金属蛋白酶-9(MMP-9)的作用及其机制.方法体外诱导THP-1单核细胞转化为巨噬细胞.为明确visfatin对MMP-9的作用,细胞分为两组:①巨噬细胞+visfatin 12 h组;②巨噬细胞+visfatin 24 h组,两组的visfatin的质量浓度均为:0(对照组)、50、100、200、400 ng/mL.采用RT-PCR和Western blotting测定MMP-9基因和蛋白表达,明胶酶谱法检测MMP-9的活性.为明确visfatin对MMP-9的作用机制,细胞分为五组:①巨噬细胞未加刺激组(对照组);②巨噬细胞+ MAPK p38、ERK1/2、JNK信号通路抑制剂预处理1 h后加visfatin(200 ng/mL)24 h组;③巨噬细胞+过氧化物酶体增殖剂活化受体(PPARγ)天然及人工配体/ RXR配体预处理1 h后加visfatin(200

ng/mL)24 h组;④巨噬细胞+visfatin(200 ng/mL)24 h组(Vis200组);⑤巨噬细胞+visfatin(200 ng/mL)刺激不同时间组(5、10、15、30、60 min).Western blotting检测MMP-9蛋白和PPARγ蛋白表达及visfatin刺激下巨噬细胞p38、ERK1/2、JNK MAPK磷酸化水平.结果 Visfatin能促进MMP-9基因及蛋白表达(P<0.05,P<0.01),同时增强了MMP-9的活性(P<0.01).p38 MAPK、ERK1/2 MAPK通路抑制剂及RXR配体抑制visfatin对MMP-9表达具有上调作

用;visfatin能促进p38 MAPK和ERK1/2 MAPK的磷酸化,但不影响PPARγ蛋白的表达.结论 Visfatin增加了巨噬细胞炎症因子的表达,该作用与p38 MAPK和ERK1/2 MAPK信号通路有关;RXR可能参与了该过程.

【期刊名称】《上海交通大学学报（医学版）》

【年(卷),期】2009(029)009

【总页数】6页(P1057-1061,1065)

【关键词】内脏脂肪素;基质金属蛋白酶;丝裂原活化蛋白激酶;视黄醛X受体;动脉粥样硬化

【作者】范虞琪;何奔;王彬尧

【作者单位】上海交通大学,医学院仁济医院心内科,上海,200001;上海交通大学,医学院仁济医院心内科,上海,200001;上海交通大学,医学院仁济医院心内科,上

海,200001

【正文语种】中文

【中图分类】R543.1;Q786;R-33

动脉粥样硬化(atherosclerosis，AS)与肥胖相关性疾病的关系密切。目前，脂肪细胞分泌因子对于心血管疾病的影响，特别是对AS斑块稳定性的作用正受到高度关注。内脏脂肪素(visfatin)作为一种新发现的脂肪细胞分泌因子，已经被证实能调节糖代谢和影响内皮功能，并能调控微循环形成[1-2]。然而，有关visfatin对炎症反应的影响报道很少。基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinases，MMPs)是影响AS斑块稳定性的重要因子。在AS斑块炎症入侵部位，巨噬细胞分泌大量MMPs，加剧了炎症反应和斑块的不稳定性，而MMP-9是MMPs家族中导致斑块破裂的最主要因素。近年来研究发现，巨噬细胞是AS斑块处MMP-9的主要来源。因此，本研究探讨了visfatin对巨噬细胞炎症因子MMP-9的作用及其机制，旨在为AS的预防和治疗提供新的思路。

1 材料与方法

1.1 材料人单核细胞株THP-1细胞(中国科学院上海细胞所)；RPMI-1640培养基

(Gibco)；胎牛血清(四季清公司)；visfatin(Axxora)；RT试剂盒(Qiagen)；佛波

醇(Calbiochem)；TRIzol(Invitrogen)；Taq酶(New England Biolabs)；BCA蛋白检测试剂盒(Pierce)；p38丝裂原活化蛋白激酶(mitogen activated protein kinases，MAPK)抑制剂SB203580(SB)、ERK1/2 MAPK抑制剂PD98059(PD)、JNK MAPK抑制剂SP600125(SP)、视黄醛X受体(retinoid X receptor，RXR)天然配体9-顺式维甲酸(9-cis RA)(Sigma)；过氧化物酶体增殖剂活化受体(peroxisome proliferators-activated receptor γ，PPARγ)配体

Pioglitazone(piog)和15d-PGJ2(PGJ2)(Cayman Chemical)；β-actin兔抗人单

克隆抗体(Abcam)；PPARγ鼠抗人单克隆抗体(Santa Cruz)；p38 MAPK、P-

p38 MAPK、ERK1/2、P-ERK1/2 MAPK、JNK MAPK、P-JNK MAPK兔抗人单克隆抗体(Cell Signaling Technology)；MMP-9兔抗人单克隆抗体(Abcam)；红外标记羊抗兔多克隆抗体(Abcam)。

1.2 方法

1.2.1 细胞诱导和分组：THP-1细胞采用含10%胎牛血清的RPMI-1640培养基培养。按1×106 /孔的细胞密度，将细胞转入六孔板；在培养液中加入100 nmol/L 的佛波醇刺激48 h，使悬浮细胞分化为贴壁生长的巨噬细胞。PBS清洗3次，更

换无血清的RPMI-1640继续培养。为明确visfatin对MMP-9的作用，分为两组：①巨噬细胞+visfatin 12 h组；②巨噬细胞+visfatin 24 h组，两组的visfatin的

质量浓度均为：0(对照组)、50、100、200、400 ng/mL。为明确visfatin对MMP-9的作用机制，细胞分为五组：①巨噬细胞未加刺激组(对照组)；②巨噬细

胞+MAPK p38、ERK1/2、JNK信号通路抑制剂预处理1 h后加visfatin(200

ng/mL)24 h组；③巨噬细胞+过氧化物酶体增殖剂活化受体(PPARγ)天然及人工

配体/ RXR配体预处理1 h后加visfatin(200 ng/mL)24 h组；④巨噬细胞

+visfatin(200 ng/mL)24 h 组(Vis200)；⑤巨噬细胞+visfatin(200 ng/mL)刺激

不同时间组(5、10、15、30、60 min)。MTT法估算细胞活力，干预前后细胞存

活率>95%。

1.2.2 RT-PCR检测MMP-9 mRNA的表达：按TRIzol使用说明提取RNA。取2 μg总RNA，用Oligo-dT37℃孵育60 min反转录合成cDNA，并合成以下引物(上海生工生物技术公司)：MMP-9(115 bp)上游引物：5’-ACTACTGTGCCTTIGAGTCC-3’，下游引物：5’-AGAATCGCCAGTACTTCCC-3’； GAPDH(208 bp)上游引物：5’-AACGGATTTGGTCGTAG-3’，下游引物：5’-GGAAGATGGTGATGGGATT-3’。按以下条件行PCR反应：95℃预变性5 min，94℃ 30 s，55℃ 30 s，72℃ 30 s， 25个循环；72℃延伸5 min。采用1.0%琼脂糖凝胶对PCR产物进行电泳，检测净光密度，以GAPDH mRNA表达量为内参，以同组细胞MMP-9 mRNA表达量和GAPDH mRNA表达量的比值进行半定量分析。

1.2.3 Western blotting检测MMP-9蛋白、PPARγ蛋白表达及p38、ERK1/2、JNK MAPK磷酸化水平：4℃细胞裂解液裂解细胞收取总蛋白，BCA法测定蛋白

浓度。25 μg蛋白样品与上样缓冲液混合后变性，10%SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳。室温下100 V×90 min湿转法转膜，5%牛奶室温封闭1 h。结合I抗室温2 h，

结合Ⅱ抗室温1 h。洗膜、蛋白条带扫描(Odyssey)后定量分析。

1.2.4 明胶酶谱法检测MMP-9活性：巨噬细胞经vsifatin刺激24 h后收集细胞

培养上清液。BCA法测量蛋白后调节上样蛋白量。10%SDS聚丙烯酰胺凝胶(含

0.1%明胶)垂直电泳，100 V×150 min。室温下，凝胶置于复性缓冲液

(25%Triton X-100)中复性30 min。换用孵育液(50mmol/L Tris、0.2 mol/L NaCl、5 mmol/L CaCl2、0.02% Brij 35)37℃孵育12 h。使用0.5% (w/v)考马

斯亮蓝R-250染色30 min，考马斯亮蓝R-250褪色液脱色。对降解带进行拍照，光密度扫描分析。

1.3 统计学处理采用SPSS 13.0软件包进行统计学处理，所有数据用表示，组间比较采用t检验。P<0.05表示差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 Visfatin对MMP-9的作用

2.1.1 Visfatin对巨噬细胞MMP-9 mRNA表达的影响：在巨噬细胞+visfatin 12 h组，100 ng/mL visfatin即可促进MMP-9 mRNA的表达，与对照组比较差异有统计学意义(P<0.01)；当visfatin质量浓度达到400 ng/mL时，MMP-9 mRNA表达较对照组上升1.8倍(P<0.01)。在巨噬细胞+visfatin 24 h组，50 ng/mL visfatin即可使MMP-9 mRNA表达较对照组上升1.26倍(P<0.05)；当visfatin质量浓度达到400 ng/mL时，MMP-9 mRNA表达上升2.4倍

(P<0.01)(图1)。可见，visfatin呈时间依赖性和剂量依赖性促进巨噬细胞MMP-9 mRNA的表达。

2.1.2 Visfatin对巨噬细胞MMP-9蛋白表达的影响(图2)：在巨噬细胞+visfatin 12 h组和巨噬细胞+visfatin 24 h组，50 ng/mL visfatin即可促进MMP-9蛋白的表达(P<0.05和P<0.01)；当visfatin的质量浓度达到400 ng/mL时，MMP-9蛋白表达较对照组上升

3.7倍和5.3倍(P<0.01)(图2)。可见，visfatin呈时间依赖性和剂量依赖性促进巨噬细胞MMP-9蛋白的表达。

2.1.3 Visfatin对MMP-9基质降解作用的影响：在巨噬细胞+visfatin 12 h组，100 ng/mL visfatin即可促进MMP-9的基质降解作用(P<0.01)；当visfatin的质量浓度达到400 ng/mL时，MMP-9的基质降解作用较对照组上升5.2倍(P<0.01)。在巨噬细胞+visfatin 24 h组，50 ng/mL visfatin即可促进MMP-9的基质降解作用(P<0.01)；当visfatin的质量浓度达到400 ng/mL时，MMP-9的基质降解作用较对照组上升7.7倍(P<0.01)(图3)。可见，Visfatin呈时间依赖性和剂量依赖性促进巨噬细胞MMP-9的基质降解作用。

2.2 Visfatin对MMP-9的作用机制

2.2.1 PPARγ配体和RXR配体对visfatin上调MMP-9作用的影响：RXR配体9-cis RA(9-cis)抑制visfatin对MMP-9的上调作用，而PPARγ配体无此作用，提

示RXR可能参与了调节visfatin对MMP-9的调控作用(图4)。

图 1 Visfatin对巨噬细胞MMP-9 mRNA表达的影响(n=3)Fig 1 Effects of visfatin on MMP-9 mRNA expression in macrophages(n=3)①P<0.05,

②P<0.01 vs control group

图 2 Visfatin对巨噬细胞MMP-9蛋白表达的影响(n=3)Fig 2 Effects of visfatin on MMP-9 protein expression in macrophages(n=3)①P<0.05, ②P<0.01 vs control group

图 3 Visfatin对巨噬细胞MMP-9活性的影响(n=3)Fig 3 Effects of visfatin on MMP-9 invasive activity in macrophages(n=3)①P<0.01 vs control group

图4 PPARγ配体和RXR配体对visfatin上调MMP-9作用的影响(n=3)Fig 4 Effects of PPARγ ligand and RXR ligand on visfatin activity(n=3)①P<0.01 vs control group; ②P<0.01 vs Vis200 group

2.2.2 Visfatin不调节PPARγ蛋白表达：visfatin对PPARγ蛋白的表达无调节作

用(图5)，而PPARγ配体对visfatin的作用也无影响，证实visfatin对MMP-9

表达的调节不需要PPARγ参与。

2.2.3 p38、JNK、ERK1/2 MAPK抑制剂对visfatin上调巨噬细胞MMP-9作用

的影响：p38 MAPK抑制剂SB和ERK1/2 MAPK抑制剂PD抑制了visfatin对MMP-9的上调作用，而JNK MAPK抑制剂SP无此作用(图6)。

2.2.4 Visfatin对p38 MAPK和ERK1/2 MAPK的磷酸化作用：如图7所示，5 min时visfatin即可促进p38 MAPK的磷酸化，在15 min时达到顶峰(较对照组增高

3.5倍)，并开始逐渐下降；但在60 min时，仍较对照组显著上升(P<0.05)。

同样，visfatin在5 min时即可激活ERK1/2，而在30 min时激活作用达到高峰，较对照组增高2.9倍。结合p38 MAPK和ERK1/2 MAPK抑制剂抑制visfatin对MMP-9的上调作用，可证实p38 MAPK和ERK1/2 MAPK参与了visfatin对MMP-9的上调作用,但visfatin对JNK MAPK则无上述作用。

图 5 Visfatin对PPARγ的表达无调节作用Fig 5 Visfatin does not modulate PPARγ expression

图 6 p38 MAPK及ERK1/2 MAPK抑制剂抑制visfatin对MMP-9的上调作用

(n=3)Fig 6 p38 MAPK inhibitor and ERK1/2 inhibitor blocked visfatin activity(n=3)①P<0.05, ②P<0.01 vs control group; ③P<0.01 vs Vis200 group

图 7 Visfatin促进p38 MAPK和ERK1/2 MAPK的磷酸化(n=3)Fig 7 Visfatin activated p38 MAPK and ERK1/2 MAPK(n=3)①P<0.05, ②P<0.01 vs control group

3 讨论

研究[1-2]发现，脂肪细胞分泌因子同AS的发生、发展关系密切，其不仅参与调

节血脂和影响糖代谢，还能影响内皮细胞功能，并参与微血管的形成。更重要的是，脂肪细胞分泌因子能调节炎症因子的产生，而炎症因子在决定斑块稳定性方面起着极其重要的作用。AS斑块处巨噬细胞分泌各种炎症因子，如肿瘤坏死因子α、白

介素-1、MMPs等，增加了AS斑块局部的炎症和不稳定性，导致急性心血管事

件发生[3]。

MMPs作为含锌的肽链内切酶家族，其主要生物学功能是参与血管壁的主要成分

细胞外基质的降解和重构。MMPs表达和活性增高可以导致AS斑块基质的降解，引起AS斑块破裂[4]。Lindsey等[5]通过MMP-9基因敲除小鼠的心肌梗死模型

研究进一步证实，降低MMP-9能增加AS斑块的稳定性。由于巨噬细胞是

MMP-9表达的主要来源，因此，研究各种因子对巨噬细胞MMP-9的表达和酶活性的影响，可以为临床治疗AS疾病提供思路。

Visfatin是一种新发现的脂肪细胞分泌因子，参与炎症因子的调节。visfatin能上

调单核细胞MMP-9 mRNA及MMP-9活性[6]，促进内皮细胞产生MMP-2/-9

及单核细胞趋化蛋白-1[7]。Visfatin还能促进肿瘤坏死因子α和白介素-8的表达[6]。然而，对于visfatin能否调控巨噬细胞MMP-9的表达及活性未见相关报道。本研究发现，visfatin能促进MMP-9基因和蛋白的表达；同时，visfatin也增强

了MMP-9的基质降解作用，说明vinsfatin作为一种炎症介质参与了AS的发生。MAPK信号通路是体内细胞信号转导通路中的重要环节。大量研究证实，MAPK

不仅参与细胞增殖、凋亡、迁移及分化，还在AS发生、发展过程中调控炎症因子的表达。有研究[8]证实，p38及ERK1/2均参与佛波醇对单核细胞MMP-9的上

调作用。Lim等[3]指出，MMP-9上调MMP-1的过程需要p38 MAPK的参加。本研究发现，visfatin激活p38和ERK1/2 MAPK，而p38和ERK1/2 MAPK抑

制剂能抑制visfatin对MMP-9的调节作用，说明visfatin对MMP-9的调节需要p38和ERK1/2 MAPK的参与。

RXR及PPARγ属于激素核受体，均有抗AS的作用[9-10]。在众多核受体中，RXR显得非常特殊。这是因为它能与其他核受体(如PPARγ)形成异二聚体而起作用。PPARγ已被证实具有下调炎症因子(肿瘤坏死因子-α、血管细胞黏附因子和MMPs等)的作用。在本研究中，RXR天然配体9-cis RA抑制visfatin对MMP-9的作用，提示RXR参与了抑制visfatin的作用。而PPARγ的天然配体PGJ2及合成配体吡格列酮均未能下调visfatin的这种作用。同时，在visfatin刺激下，PPARγ蛋白表达水平也无改变，说明PPARγ未参与visfatin上调MMP-9的过程。

综上所述，我们证实visfatin促进炎症因子的表达可能会引起心血管事件的发生。

Visfatin通过激活p38 MAPK和ERK1/2 MAPK，上调MMP-9的表达，而RXR 配体可以抑制这种作用。但是，9-cis RA是否通过激活RXRs促进其与核受体(PPARγ或RAR等)形成异源二聚体，从而调控MMP-9的表达和活性，还有待进一步研究。

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