明胶酶谱法
明胶酶谱法
明胶酶谱法是一种新型的蛋白质分析方法，它可以提供准确准确的蛋白质质量分析和分子量分析结果。明胶酶谱法可以快速有效地测定蛋白质中的氨基酸和糖基化激酶的活性。这种方法通过使用蛋白质，核酸和其他复合物构成的聚合物，结合相关的酶诱发反应，来分析蛋白质的质量和分子量。这些复合物可以在单独的氨基酸片段中用来测量激酶反应，从而识别活性位点，反映了蛋白质质量和分子量分析的结果。
明胶酶谱法的原理是基于胶质酶结合物，它由多种蛋白质，核酸和其他复合物组成，使用酶诱发反应来分析蛋白质的质量和分子量。该方法由激酶和聚合物组成，它们分别催化了激酶和聚合物的反应，从而产生了激酶的活性。此外，该方法还能够测量氨基酸片段的活性，这将有助于评估蛋白质的质量和分子量。
明胶酶谱法的应用可以追踪物质的合成和分解的变化，从而发现蛋白质结构及其功能的改变。它可以用来研究蛋白质结合位点分布、激动酶及蛋白质与酶类分子识别蛋白质、以及酶促反应的参与者等，这些结果将有助于改善蛋白质的性能，这将有助于提高药物的疗效和安全性，以及有效防止药物毒性事件的发生。
明胶酶谱法在蛋白质质量和分子量分析方面具有优越性。它可以快速有效地识别活性位点，由此提供了精确的蛋白质质量和分子量的分析结果。同时，该方法可以提供有效的数据，可以评估蛋白质的功能和结构。它还可以用来研究药物及其代谢物的代谢，改善药物的性
能和安全性，以及有效防止药物毒性事件的发生。由此可见，明胶酶谱法已成为药物研究和分析的一种重要的手段。
明胶酶谱法的应用可以提供准确的蛋白质质量和分子量分析结果，从而有助于研究者分析蛋白质的功能和结构，并改善药物的性能和安全性。明胶酶谱法是一种有效的、快速的、有精度的、具有易操作性的蛋白质质量和分子量分析方法，因此它已经成为药物研究和分析的一种重要手段。
明胶酶谱法
明胶酶谱法 原理：酶谱法的基本过程是先将样品进行SDS-聚丙烯酰胺（SDS-PAGE，含0.1％明胶）电泳分离，然后在有二价金属离子存在的缓冲系统中使样品中的MMP-2和MMP-9恢复活性，在各自的迁移位置水解凝胶里的明胶，最后用考马斯亮蓝将凝胶染色，再脱色，在蓝色背景下可出现白色条带，条带的强弱与MMP-2和MMP-9活性成正比。 复性原理：在电泳过程中，SDS与样品中的MMPs结合（当然是可逆性结合），破坏其氢键、疏水键而使MMPs不能发挥其分解明胶的作用，而只有当将胶置Trition中洗脱（最好是放在摇床上摇，30min／次，做2次或15min/次，4次。静置于Trition中是不妥的。）时，由于SDS被Trition结合而去除，从而使MMPs 恢复了活性。 Mmp-2 72kd mmp-9 92kd 实验步骤 1.取对数期的癌细胞在的C。 2.次日收集上清液，将上清液移入离心管中2000rpm 离心10min，-70℃储存备用。 3.根据细胞计数调整各组细胞培养上清液中的蛋白浓度（或者测定蛋白浓度调整使所上蛋白总量一致）。与5×上样缓冲液混合，13ul样本+4ul上样缓冲液。（不要用枪用力吹打，防止出现过多气泡） 4.配制分离胶和浓缩胶，16ul/孔上样（根据表达强度和蛋白浓度确定上样量），4℃进行SDS-PAGE 电泳100v约1.5小时（电泳时在周围敷上冰，有利于使条带跑直）。 5.电泳结束后,将凝胶置于洗脱液(2.5% Triton X-100，50mmol/L Tris -HCl ，5mmol/L CaCl2，pH7. 6) 中振荡洗脱2次,每次40分钟,然后用漂洗液(除不含Triton X - 100 外其余同洗脱液) 漂洗2次,每次20分钟,接着,将凝胶置于孵育液( 50mmol/L Tris - HCl , 5mmol/ CaCl2 , 0. 02% Brij-35 ,pH7.6) 中37℃孵育42h。 6.孵育结束后经染色液(0.05% Coomassic 亮蓝、30%甲醇、10%乙酸) 染色3h,及脱色液A、B、C(甲醇浓度分别为30%、20%、10 % ,乙酸浓度分别为10 %、10 %、5%) 分别脱色0.5、1、2h后，显示出MMP-2（72KD）和MMP -9（92 KD）为位于蓝色背景上的透亮带，用凝胶图像分析系统分析读取条带面积，宽度和灰度值，做统计分析。 注意事项： 1.制备聚丙烯酰胺时应注意排除气泡。 2.明胶酶谱的活性受钙离子，锌离子，和PH值等因素的影响，因此缓冲液配制应严格准确，尽量用超纯水，孵育温度也掌握好。 3.用大梳子 4.孵育液的PH最好在7.5-7.6，复性的TRITON时间长了会有絮状物，所以实验时尽量使用新鲜配置的。
内皮细胞与单核细胞相互作用对MMP-2和TIMP-2分泌和活化的影响以及普伐他汀的作用
内皮细胞与单核细胞相互作用对MMP-2和TIMP-2分泌和活化的 影响以及普伐他汀的作用 目的很多研究认为动脉粥样硬化斑块的发生、发展以及不稳定斑块的形成和破裂与动脉粥样硬化斑块中基质金属蛋白酶（Matrix Metalloproteinase，MMPs）和／或组织型基质金属蛋白酶抑制物（Matrix Metalloproteinase Tissue Inhibitor，TIMPs）平衡失调有关。其中，单核／巨噬细胞与内皮细胞分泌的MMP-2（又称明胶酶A）及TIMP-2是决定斑块进程及斑块稳定性的最重要因素之一。单核细胞可以通过细胞间相互接触诱导周围细胞表达MMP-2，而动脉粥样硬化中内皮细胞MMP-2的过度表达与单核／巨噬细胞浸润的程度和范围高度一致，提示二者可能存在某种联系。 本实验着重研究了单核细胞和内皮细胞相互作用后，MMP-2和TIMP-2分泌及活化的变化。调脂药物尤其是他汀类药物的作用具有多效性，临床上常用的普伐他汀可以稳定斑块，防止斑块破裂。但是它是否可以通过调节基质金属蛋白酶及其组织抑制物表达和分泌的途径来发挥其稳定斑块的功能，目前未见报道，本实验对此进行了初步探讨。 方法体外培养人脐静脉内皮细胞（human umbilical vein endothelial cell，HUVEC），待细胞生长至亚融合状态后，将人单核细胞白血病细胞（THP-1）以不同比例与之共同培养，取上清采用明胶酶谱法检测MMP-2活性及逆明胶酶谱法检测TIMP-2的活性。向按1：1比例培养的HUVEC和THP-1 中同时加入不同浓度的普伐他汀（0，0.1，0.5，1.0μmol／ml）作用24小时后，用同样的方法测定MMP-2和TIMP-2的活性。采用FluorchemTM Imaging System显微图像分析系统对明胶酶谱和逆明胶酶谱的实验结果进行扫
明胶酶谱法
明胶酶谱法 明胶酶谱法是一种新型的蛋白质分析方法，它可以提供准确准确的蛋白质质量分析和分子量分析结果。明胶酶谱法可以快速有效地测定蛋白质中的氨基酸和糖基化激酶的活性。这种方法通过使用蛋白质，核酸和其他复合物构成的聚合物，结合相关的酶诱发反应，来分析蛋白质的质量和分子量。这些复合物可以在单独的氨基酸片段中用来测量激酶反应，从而识别活性位点，反映了蛋白质质量和分子量分析的结果。 明胶酶谱法的原理是基于胶质酶结合物，它由多种蛋白质，核酸和其他复合物组成，使用酶诱发反应来分析蛋白质的质量和分子量。该方法由激酶和聚合物组成，它们分别催化了激酶和聚合物的反应，从而产生了激酶的活性。此外，该方法还能够测量氨基酸片段的活性，这将有助于评估蛋白质的质量和分子量。 明胶酶谱法的应用可以追踪物质的合成和分解的变化，从而发现蛋白质结构及其功能的改变。它可以用来研究蛋白质结合位点分布、激动酶及蛋白质与酶类分子识别蛋白质、以及酶促反应的参与者等，这些结果将有助于改善蛋白质的性能，这将有助于提高药物的疗效和安全性，以及有效防止药物毒性事件的发生。 明胶酶谱法在蛋白质质量和分子量分析方面具有优越性。它可以快速有效地识别活性位点，由此提供了精确的蛋白质质量和分子量的分析结果。同时，该方法可以提供有效的数据，可以评估蛋白质的功能和结构。它还可以用来研究药物及其代谢物的代谢，改善药物的性
能和安全性，以及有效防止药物毒性事件的发生。由此可见，明胶酶谱法已成为药物研究和分析的一种重要的手段。 明胶酶谱法的应用可以提供准确的蛋白质质量和分子量分析结果，从而有助于研究者分析蛋白质的功能和结构，并改善药物的性能和安全性。明胶酶谱法是一种有效的、快速的、有精度的、具有易操作性的蛋白质质量和分子量分析方法，因此它已经成为药物研究和分析的一种重要手段。
IL-35诱导中性粒细胞N2表型极化促进肿瘤生长
IL-35诱导中性粒细胞N2表型极化促进肿瘤生长目的:IL-35是新近发现的具有促肿瘤生长和转移作用的细胞因子,研究显示IL-35能够诱导调节性T细胞产生抑制抗肿瘤免疫应答,然而在缺乏成熟T、B淋巴细胞的Rag1/2-/-小鼠体内过表达IL-35也能促进肿瘤的生长和转移。因此,这意味着IL-35也可能通过调控先天性免疫细胞功能发挥促瘤作用。中性粒细胞在肿瘤的发生发展过程中具有重要作用,一方面可以通过释放细胞毒性物质来破坏肿瘤细胞,另一方面,炎性因子诱导的中性粒细胞N2极化又能够促进肿瘤的发生发展。本研究旨在探讨IL-35是否能够通过影响中性粒细胞极化进而影响肿瘤的发生发展。方法:(1)通过肌肉注射转染pIL-35质粒制备体内表达IL-35小鼠模型,然后接种H22或B16F0肿瘤细胞,10天后取外周血及剥离肿瘤,流式细胞分析外周血和肿瘤组织中性粒细胞数量,实时荧光定量PCR检测肿瘤组织内中性粒细胞趋化因子CXCL1,CXCL2,CXCL5,CXCL15,CCL2,CCL3,CCL4,CCL5 和 VEGF 表达,探讨IL-35对小鼠骨髓中性粒细胞动员及在肿瘤微环境募集的影响及机制。(2)进一步分析IL-35是否能够通过影响中性粒细胞极化促进肿瘤生长,在正常对照、pUN01空载质粒对照、pIL-35实验组小鼠采用转染pCXCL1质粒的方式在肿瘤接种部位募集中性粒细胞,并观察募集的中性粒细胞对小鼠肿瘤生长的影响。在混合接种试验中,采用Percoll密度梯度离心法分离小鼠骨髓及腹腔来源的中性粒细胞,然后与肿瘤细胞混合接种,10天后剥离肿瘤称取瘤重以评价中性粒细胞对肿瘤生长的影响。(3)采用免疫组化和免疫荧光的方法检测肿瘤
明胶酶谱法
明胶酶谱法 原理： 酶谱法的基本过程是先将样品进行SDS-聚丙烯酰胺（SDS-PAGE，含0.1％明胶）电泳分离，然后在有二价金属离子存在的缓冲系统中使 样品中的MMP-2和MMP-9恢复活性，在各自的迁移位置水解凝胶里的明 胶，最后用考马斯亮蓝将凝胶染色，再脱色，在蓝色背景下可出现白色 条带，条带的强弱与MMP-2和MMP-9活性成正比。 复性原理：在电泳过程中，SDS与样品中的MMPs结合（当然是可逆性结合），破坏其氢键、疏水键而使MMPs不能发挥其分解明胶的作用，而只有当将胶置Trition中洗脱（最好是放在摇床上摇，30min／次，做2次或15min/次，4次。静置于Trition中是不妥的。）时，由于SDS被Trition结合而去除，从而使MMPs恢复了活性。 试剂的配制 （1）配制10%SDS聚丙烯酰胺凝胶（含1.0mg/ml 明胶，配好后1周内使用，明胶含量低灵敏度高） A．分离胶的配制（注：根据你所用的电泳仪胶的大小确定配制胶的量） 10% SDS聚丙烯酰胺凝胶10ml（包括） ddH2O 4.5ml 30%储备胶（0.8%BIS+29.2%丙烯酰胺）2ml 1.5mol/l Tris（PH 8.8） 2.5ml 10% SDS 100ul 10%过硫酸铵（APS）100ul TEMED 8ul 1%明胶（1g明胶-->100ml，37°C水浴溶解）0.5ml
B.浓缩胶的配制 浓缩胶6ml ddH2O 4.5ml 30%储备胶0.75ml 1mol/l Tris-HCL( PH 6.8) 0.76ml 10% SDS 60ul 10%过硫酸铵60ul TEMED 6ul （3）5×Tris –甘氨酸电极缓冲液 0.125mol/l Tris-HCL，1.25mol/l 甘氨酸，0.5%SDS（PH 8.3） （4）4 ×上样缓冲液 0.32% Tris-HCL 6.4ml 4%SDS（PH7.2）8ml 16%甘油3.2 ml 溴酚蓝0.024g ddH2O 2.4ml (5)洗脱液:2.5% Triton X-100，50mmol/L Tris-HCl<6.057g/L> ，5mmol/L CaCl2<0.5549g/L>，pH7. 6 （40分钟两次，中间换液） （6）漂洗液：50mmol/L Tris-HCl，5mmol/L CaCl2，pH7. 6 （20分钟2次） （7）孵育液：50mmol/LTris,pH7.5,150mmol/LNaCl,10mmol/LCaCl2,0.02%NaN3（孵育42小时） （8）染色液：0.05% Coomassic 亮蓝R-250，30%甲醇，10%乙酸（染色3小时） （9）脱色液A、B、C：甲醇浓度分别为30%、20%、10 % ,乙酸浓度分别为10 %、10 %、5% （分别30min、1h、2h脱色）
MMP明胶酶谱
MMP明胶酶谱 MMP-2&MMP-9明胶酶谱法检测试剂盒这步操作很关键哦！ 基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinase, MMP)以无活性的酶原形式分泌，活化后能够降解细胞外基质的胶原蛋白，又称胶原酶。通过影响细胞外基质，胶原酶参与胚胎发育、形态发生、组织重塑等过程，并参与炎症、肿瘤、心血管、神经等许多疾病过程。血浆与组织中的MMP-2、MMP-9参与各种生理与病理过程，其在临床诊断和治疗中的意义日益受到重视。 检测步骤 1、制备含MMP底物蛋白的SDS-PAGE凝胶：推荐分离胶浓度为8%。按照标准程序制备SDS PAGE凝胶。将10 × substrate G 融化，并90 ºC 加热5分钟。分别在浓缩胶和分离胶中额外加入10 × substrate G 并使之稀释10倍，混匀后加入过硫酸铵和TEMED，等待凝胶聚合。 2、待测样品1:1 稀释于2 × SDS-PAGE non-reducing buffer (用完后可自行配制：4% SDS, 100 mM Tris-Cl pH6.8, 20% glycerol, 0.02% bromophnol blue)，混合后直接上样。切勿加热变性，并且仅使用不加还原剂的上样缓冲液。可通过预试验确定加样量，使用普通蛋白预染Marker 即可。 阳性对照(可选步骤)：可取人、小鼠、大鼠或兔100μl 全血与100μl 2 × SDS-PAGE nonreducing buffer 等体积混合，取5-15μl 上样。
注：因为全血成分复杂,MMP活性较低，的方法是将全血中白细胞进行分离做阳性对照 3、低电流恒流电泳，每一块小胶电流为20 mA/gel。溴酚蓝跑出凝胶前沿时结束电泳。 4、洗涤凝胶：取出凝胶，去除浓缩胶，放入容器内。可先用适量蒸馏水冲洗凝胶，然后加入10 ml 1× Buffer A(用蒸馏水稀释)，室温漂洗凝胶2 × 30 分钟。中间换液。 5、孵育：倒掉Buffer A。加入10 ml 1× Buffer B(蒸馏水稀释)，室温或37ºC 孵育1~5 小时。阳性对照或者血中的MMP 通常37ºC 孵育1 小时即可显示。如MMP 活性低，应延长孵育时间为10小时或过夜。 6、显色：倒掉Buffer B，加入SDS-PAGE凝胶蛋白质考马斯亮蓝染色液（操作步骤见后面所附SDS-PAGE凝胶蛋白质考马斯亮蓝染色液说明书）。凝胶的大部分区域被深染，在有MMP 条带的位置不被染色而形成透亮区域。 透明区域的位置和范围指示MMP-2、MMP-9 的大小位置(酶谱)及活性。阳性对照将在66~72 (MMP-2)、92 (MMP-9)、130 (proMMP-9)、225 (proMMP-9) kDa位置出现透明条带。 7、条带扫描：将凝胶放在扫描仪上扫描。虽然MMP条带透明，但凝胶背景并非真正全黑。解决办法：可用非透射光扫描，或用软件图像处理程序调整背景显示为灰度显示，并尽量设置为黑色。MMP 条带则为白色，这种背景黑条带白的格式是英文论文中zui常见的格式。
灯盏花素对脑缺血再灌注小鼠明胶酶及血脑屏障通透性的影响
灯盏花素对脑缺血再灌注小鼠明胶酶及血脑屏障通透性的影响卢晓梅;赵红;张海鹏 【期刊名称】《中国医科大学学报》 【年(卷),期】2006(035)005 【摘要】目的:通过检测脑缺血再灌注小鼠明胶酶A(MMP-2)、明胶酶B(MMP-9)的活性及脑组织中伊文思蓝的含量,探讨灯盏花素对脑缺血再灌注小鼠明胶酶及血脑屏障(BBB)通透性的影响.方法:复制脑缺血再灌注模型,并于术前15 min腹腔注射灯盏花素注射液10 mg/kg,采用明胶酶谱分析法检测脑组织海马区明胶酶的活性,同时经尾静脉注射2%伊文思蓝,检测脑组织伊文思蓝含量.结果:脑缺血再灌注后明胶酶(A、B)活性增加;灯盏花素组MMP-9活性明显低于脑缺血再灌注组,而灯盏花素对MMP-2作用不显著.脑缺血再灌注后4 h起脑组织伊文思蓝渗出逐渐增多,48 h达高峰,以后有下降趋势.灯盏花素组于术后伊文思蓝渗出明显低于相应时间的脑缺血再灌注组(P＜0.05).结论:灯盏花素具有降低脑缺血再灌注小鼠明胶酶B 的活性、降低血脑屏障通透性的作用. 【总页数】3页(P481-483) 【作者】卢晓梅;赵红;张海鹏 【作者单位】中国医科大学基础医学院病理生理学教研室,辽宁,沈阳,110001;中国医科大学基础医学院病理生理学教研室,辽宁,沈阳,110001;中国医科大学基础医学院病理生理学教研室,辽宁,沈阳,110001 【正文语种】中文
【中图分类】R285.5;R743.31 【相关文献】 1.高压氧对脑缺血再灌注小鼠明胶酶、一氧化氮合酶及血脑屏障的影响 [J], 赵红;朱丽娜;陈学新;卢晓梅;张海鹏 2.通窍活血汤对脑缺血再灌注小鼠血脑屏障通透性及脑内单胺类神经递质含量的影响 [J], 刘亚芳;汪宁 3.高压氧对急性脑缺血再灌注小鼠AQP-4表达及血脑屏障通透性的影响 [J], 赵红;曹士信;卢晓梅;张海鹏;陈学新 4.人参三七配伍对脑缺血再灌注损伤小鼠血脑屏障通透性及脑组织炎症反应的影响[J], 张楠;黄鑫;戴雨霖;越皓;于洋;刘淑莹 5.芳香开窍药对脑缺血再灌注损伤小鼠血脑屏障通透性的影响 [J], 倪彩霞;曾南;汤奇;许福会;苟玲;王建;夏厚林 因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买
基质金属蛋白酶9(MMP—9)的研究及临床应用进展
基质金属蛋白酶9（MMP—9）的研究及临床应用进展 基质金属蛋白酶9（MMP-9）属于基质金属蛋白酶超家族成员中明胶酶的一种，又称明胶酶B，因其作用底物广泛，表达细胞众多参与多种疾病及恶性肿瘤的侵袭和转移而备受重视，成为最近国际国内研究的焦点之一。因此，深入了解MMP-9及其与疾病的关系有助于疾病的及时发现、诊断和治疗。本文就其生物学特点、检测技术及临床应用进行了综述。 标签：基质金属蛋白酶9；检测技术；临床应用 基质金属蛋白酶（MMPs）是一类活性依赖于锌离子和钙离子的蛋白水解酶，其主要的生理作用是降解细胞外基质。现已发现26种MMPs（MMP-1～26），称为MMP家族，MMPs几乎能降解细胞外基质的所有成分，如胶原、明胶、黏性蛋白、纤维黏连蛋白、蛋白多糖等，参与人体许多生理和病理过程[1]。在MMPs 中MMP-9，属于基质金属蛋白酶超家族成员中明胶酶的一种，是人体内最重要的蛋白酶之一。 1 MMP-9的生物学特点[2-3] 1.1概述MMP-9是MMPs家族成员之一，是Reponen和Sahlbergl994年在小鼠胚胎发育中的破骨细胞内发现的。分子量Mr92×103，根据作用底物又名明胶酶B，依据发现的先后顺序MMP-9又名基质金属蛋白酶9，主要作用是保持酶的稳定性。MMP-9前体可由单核细胞、巨噬细胞、中性粒细胞、血管平滑肌细胞、内皮细胞、泡沫细胞、成纤维细胞、小胶质细胞及肿瘤细胞等分泌，在87位氨基酸残基或附近被酶解激活，参与炎性反应、组织构形、创伤修复、基质结合的生长因子的动员及细胞因子的表达。 1.2 MMP-9的基因结构和功能人MMP-9基因全长26000bp，位于20q11.2～q13.1，含有13个外显子和12个内含子，编码相对分子质量为92×103的蛋白。MMP-9的启动子区位点，人的MMP-9启动子区还有核因子κB、表达序列标签结合位点和转化生长因子β控制元件。MMP-9表达的原始调控是在转录水平上，这些启动子区的特定反应元件是多种刺激调控MMP-9的最终作用靶点。 1.3 MMP-9的蛋白结构和功能MMP-9的蛋白组成从N端到C端主要包括信号肽序列、前肽序列、催化域（包含锌离子结合位点）、纤维粘连蛋白样功能域（可结合明胶）和Ⅴ型胶原样功能域（提供多种低聚糖结合位点）。Ⅴ型胶原样功能域为MMP-9所特有，借此与MMP-2（即明胶酶A）相区别，而前肽序列在MMP-9的酶原活化中有重要作用。MMP-9是降解Ⅳ型胶原的最主要成员之一，其底物包括变性的Ⅰ型胶原（凝胶）、天然Ⅳ、Ⅴ、Ⅶ、Ⅹ和Ⅺ型胶原、纤维蛋白原、层粘连蛋白及多功能蛋白聚糖等。 1.4 MMP-9的活性调节MMP-9在机体内的激活、表达及对底物的分解均受到严格调控。在正常成人体内，其表达水平很低，但在特定的生理或病理重塑过
CD147分子与MMPs在肝癌细胞系中表达的有关性
CD147分子与MMPs在肝癌细胞系中表 达的有关性 【关键词】 CD147 关键词: CD147;基质金属蛋白酶;肝癌细胞 摘要:目的研究CD147与MMPs（基质金属蛋白酶）在肝癌细胞系中表达的相关性. 方法流式细胞仪检测正常肝细胞QZG及不同肝癌细胞系（BEL-7402，QGY-7404，SMMC-7721，HHCC和HHCC-9204）中CD147的表达;酶谱法分析其产生MMPs 的含量及活性. 结果正常肝细胞株QZG中CD147表达阴性，其余5株肝癌细胞系CD147表达阳性;MMP-2和MMP-9在QZG和肝癌细胞系中均表达，但在肝癌细胞系中表达明显增高;MMP-9以酶原和活性形式表达，MMP-2仅以酶原形式表达;统计学分析CD147与MMPs表达成正相关. 结论 CD147可作为判断肝癌细胞具备高侵袭转移潜能的标志. Keywords:CD147;MMPs;hepatoma cells Abstract:AIM To study the relation between CD147and the expression of MMPs in hepatoma cell lines.METHODS Expression of CD147in human liver cell QZG and different hepatoma cell lines（BEL-7402，QGY-7404，SMMC-7721，HHCC，HHCC-9204）was investigated by flow cytometer.Zymograph was used to study the content and types of posi-tive MMPs.RESULTS CD147was positively presented in five hepatoma cell lines，but in normal liver cell was nega-tive.MMP-2and MMP-9were detected by all the hepatoma cell lines and normal liver cell but the expression in hepatoma cell lines was obviously high.The relation between CD147molecule and the expression of MMPs was a positive one.CONCLUSION CD147could be used as a marker to judge the invasion and metastasis of hepatocellular carcinoma. 0 引言 大量研究显示MMPs（基质金属蛋白酶）与多种肿瘤的侵袭转移有关［1］， 其中IV型胶原酶（MMP-2明胶酶A和MMP-9明胶酶B）通过降解基底膜IV型胶原在恶性肿瘤早期的侵袭中起重要作用［2，3］ .CD147是新的细胞表面粘附分子，介导细胞间的粘附，具有TCSF/EMMPrin（肿瘤细胞起源的胶原酶刺激因子/细胞外基质金属蛋白酶诱导因子）的作用，而有助于癌细胞的侵袭转移［4，5］ .然而CD147在肝癌细胞表面的表达，以及肝癌细胞产生MMPs的形式及活性，尤其是两 者的相关性研究未见报道.我们利用酶谱法（zymograph）及流式细胞仪对MMPs和CD147在肝细胞及肝癌细胞的表达进行研究，以揭示CD147与MMPs的相关性，并 探讨以CD147为标志判断肝癌细胞具备高侵袭转移潜能的可能性.
PM2.5对人绒毛膜外滋养层细胞HTR8-SVneo迁移与侵袭力的影响及机制研究
PM2.5对人绒毛膜外滋养层细胞HTR8-SVneo迁移与侵袭 力的影响及机制研究 秦喆;侯海燕;徐忠伟;张立文;韩斌;陈亚琼;吴思雨;姚婷 【摘要】目的:探讨PM2.5对人绒毛膜外滋养细胞HTR8-SVneo存活率以及迁移与侵袭能力的影响,寻找PM2.5致不良妊娠结局可能的机制.方法:不同浓度PM2.5染毒HTR8-SVneo细胞建立实验模型,CCK8(Cell Counting Kit-8)法分析细胞增殖情况,最终选取0、30、60、120和200 μg/mL 5个浓度进行后续实验,其中以0μg/mL染毒组为对照组.激光全息细胞分析及成像系统分析细胞迁移力;Transwell 侵袭实验分析细胞侵袭力;qPCR和Western Blot分别检测基质金属蛋白酶 2(MMP2)、MMP9及其组织抑制剂TIMP1、TIMP2的mRNA和蛋白表达水平;明胶酶谱法检测细胞分泌的明胶酶MMP2和MMP9活性.结果:PM2.5对HTR8-SVneo细胞增殖有显著抑制作用(P＜0.05);PM2.5使HTR8-SVneo细胞迁移距离和穿膜细胞数均减少(P＜0.05);qPCR和Western Blot结果显示,PM2.5使HTR8-SVneo细胞MMP2、MMP9、TIMP1及TIMP2的mRNA及蛋白表达水平升高(P＜0.05),且MMPs升高程度低于TIMPs;明胶酶谱结果显示,HTR8-SVneo细胞MMP9活性在30、60、120和200 μg/mL染毒组均升高(P＜0.05).结论:PM2.5在造成HTR8-SVneo细胞损伤的同时,可能通过打破MMPs/TIMPs的动态平衡影响人绒毛膜外滋养细胞HTR8-SVneo的迁移与侵袭力,从而造成不良妊娠结局,而具体信号机制有待深入研究. 【期刊名称】《国际生殖健康/计划生育杂志》 【年(卷),期】2016(035)005
免疫酶法测定桔霉素
免疫酶法测定桔霉素 摘要：一种快速测定饲料当中的桔霉素的方法，采用间接竞争酶联免疫吸附实验，分析提取乙腈水试验样品。桔霉素所分析的浓度范围是20-500μg/kg，相对重复性（精密度）和实验室中等精密度（重复性）的分析结果分别为0.11和0.16。 桔霉素[（3R,4S)-4,6-二氢-8-羟基-3,4,5-三甲基-6-羰-3氢-2-苯吡-7-羧酸]是青霉、曲霉和红曲霉等丝状霉菌代谢产生的一种毒素，这类霉菌主要污染饲料和谷类食品。这种化合物在商业上被称为“红曲”，谷物饲料和配合的饲料是主要的被污染物。免疫化学检测技术的发展是Vrabcheva等人进行的谷物污染检查，这是执行的第一次大规模粮食污染检查。 这项工作的目的是开发一个快速的方法测定各种饲料中的桔霉素，材料和混合材料是基于间接竞争酶联免疫吸附试验。 试验 桔霉素（C1017; Sigma公司，美国），甲醛（33号220; Fluka公司，德国），牛血清白蛋白（BSA），卵白蛋白（EA），兔血清白蛋白（RSA），明胶，葡萄糖氧化酶（GOX EC1.1.3.4）（G2133; Sigma公司，美国）这些药品是用于制备免疫试剂。国内生产的辣根过氧化物酶（EC1.11.1.7）和驴兔免疫球蛋白血清是用于酶联免疫吸附实验中抗物种酶的结合物。 紫外光谱是用于记录的仪器日立-557（日本日立公司），进行酶联免疫吸附试验使用的聚苯乙烯板（第9018号;联合，美国）和AKI-TS-01（俄罗斯），IFA-OEP-A（俄罗斯），Dynatec公司的MR-250（德国）光度计。 活性酯法和甲醛缩合法，如先前所描述的，可以在自发结合的条件下，被用来合成桔霉素结合物和蛋白质。 对于甲醛缩合反应，是用于计算溶液当中桔霉素的含量，2ml二甲基甲酰胺溶液和37％的甲醛水溶液100，200，和300μL（相当于1230，2460， 3690μ摩尔），在加入牛血清白蛋白溶液（0.07μmol），卵白蛋白（0.1μmol），兔血清白蛋白（0.08μmol），明胶（0.05μmol）和葡萄糖氧化酶（0.05μmol）。将混合液在室温下静置16h或者加热至30−33°C并不断搅拌24h。然后透析三个1000体积0.2％的氯化钠溶液。用紫外吸收光谱法测定溶液的抗原表位密度（每摩尔的半抗原载体蛋白的摩尔数）（λ= 333 nm 处的摩尔吸收系数为16000） 牛血清白蛋白结合物，能与286倍摩尔质量毒素蛋白合成牛血清白蛋白 (286)，与葡萄糖氧化酶（400）经甲醛缩合后用于动物免疫接种。雄性灰兔（2−3公斤），第一次注射100ug弗氏完全佐剂免疫原，第二次注射100ug的生理溶液。 所有合成的结合物吸附在聚苯乙烯孔中，在0.05米处加入碳酸盐-碳酸氢盐缓冲溶液（PH9.5）浓度为0.15ug/ml作为固相抗原。对免疫试剂进行测试，并按照前面描述的程序对分析条件进行了优化。 饲料混合物（粮食、添加剂、和浓缩物），谷物（小麦，大麦，黑麦，燕麦，小黑麦和玉米），谷物产品（米糠和面筋），葵花粕，和葵花油被选为试验材料。将样品研磨成粉末，通过孔径大小为1毫米的筛子。此后，50毫升乙腈和水按体积比为6：1混合，再加入10g的样品，批量提取14h，快速搅动，在整个过程中。分别进行描述分析。 准确性、重复性（精度）和中等精密度（重复性）评价方法，根据GOSTRISO 5725-2002.。在粮食、饲料混合物、玉米蛋白等中加入20，100，和500μg/kg的桔霉素进行实验评价。由于测定的时间不同，操作者不同，以及仪器误差，测定被污染的样品当中桔霉素的含量，来确定其中等精密度特性。
CD147抗体对破骨细胞中基质金属蛋白酶活性影响的体外研究
CD147抗体对破骨细胞中基质金属蛋白酶活性影响的体外研 究 余世明;初同伟;廖通权;胡旭;刘栓得;周跃 【期刊名称】《中国免疫学杂志》 【年(卷),期】2012(028)003 【摘要】目的:建立人破骨细胞( Osteoclast,OCs)体外诱导分化模型,研究CD147单克隆抗体对OCs分化过程中基质金属蛋白酶-9( Matrix metalloproteinases 9,MMP-9)和基质金属蛋白酶-2(Matrix metalloproteinases 2,MMP-2)表达及活性的影响.方法:通过采集健康成年志愿者外周血所分离的单个核细胞贴壁培养,应用NF-κB配体激活因子(Receptor or Activator of NF-KB Ligand,RANKL)与巨噬细胞集落刺激因子(Macrophage colony stimulating factor,M-CSF)诱导单个核细胞向OCs分化.本实验分为抗体组(RANKL+ M-CSF+ CD147单克隆抗体)与对照组(RANKL+ M-CSF).抗酒石酸酸性磷酸酶染色(Tartrateresistant acid phosphatase,TRAP)与骨吸收实验检测鉴定OCs分化及活性情况,Real-Time PCR 技术检测CD147、MMP-9和MMP-2 mRNA在破骨前体细胞(Osteoclast precursor cells,OPCs)中表达情况,明胶酶谱法检测细胞培养上清中MMP-9、MMP-2酶蛋白的活性变化情况.结果:①对照组经TRAP染色和骨吸收实验检测到破骨样细胞形成并具有骨吸收功能,而抗体组OCs分化及活性均受到抑制；②在24、48小时时相点上抗体组CD147、MMP-2及MMP-9 mRNA的相对表达量均低于相应的对照组(P＜0.05),且MMP-2、MMP-9 mRNA的相对表达量与 CD147 mRNA的表达量呈正相关.③明胶酶谱检测细胞培养上清,可见在24、48小时两时相点上抗体组OCs细胞中MMP-2、MMP-9酶原及活性酶的酶解量均
欧阳发 明胶在生物医学材料中的应用
学年论文 （课程论文、课程设计） 题目：明胶在生物医学材料中的应用进展姓名：欧阳发 学号：201004174060 专业年级：10 级化工与制药 成绩： 指导教师（职称）：吴飞跃（助教） 2012年12月20日
明胶在生物医学材料中的应用进展 摘要明胶是一种天然的高分子材料，在生物医用材料中具有广泛应用，如创面修复材料、组织修复材料、止血材料、制备缓控释材料、血液代替材料。综述了明胶在生物医学材料中的应用。 关键词明胶，生物医学材料，应用 明胶是由胶原部分水解而得到的一类蛋白质，是已知的用途最广的天然产品之一，具有重要的生物学性质—力学性能高、促进细胞生长、止血、生物相容性和生物降解性。明胶在医药工业、临床医学和临床治疗中有广泛的应用，如可应用于创面修复材料、组织修复材料、止血材料、血液替代材料以及制备控缓释材料等。明胶的用途已经知道的罗列起来似乎是没有止境的，而新的用途仍不断被发现。本文就明胶在生物医学材料中的应用进行综述。 1 创面修复 创面修复是整个医学界所面临的最重要、最基本的问题之一，随着分子生物学的发展，创面修复的基础研究已深入到细胞、分子及基因水平。组织工程学的出现,使烧伤创面皮肤移植有了新的突破，即由活细胞应用组织培养方法，以某种方式连接到天然的、人造的或二者混合物构成的基质或支架上，形成人工复合皮，然后进行皮肤移植[1]。人工复合皮不仅能够促进皮肤愈合，而且没有免疫原性，具有来源充足、使用方便安全等优点。因此开发与天然皮肤[2]结构和功能相似的人造生物皮肤，对于救治重度烧伤病人具有非常重要的意义。以明胶[3]为基础制备或合成组织工程材料，特别是用壳聚糖与明胶进行复合是目前生物材料的研究热点之一。如尹玉姬等人将体外扩增的角质形成细胞2次接种于人工真皮结构物上，经过空气界面培养，可在体外构建具有模拟真皮和表皮双层结构的真皮替代物。壳聚糖－明胶双层支架[4]表层的小孔可防止下层成纤维细胞向上生长，也防止表层角质形成细胞落入成纤细胞层面。该支架的致密层虽然隔离了角质形成细胞与成纤维细胞，但同时又允许营养物质和生长因子及生物信便的传递。这说明将成纤维细胞在壳聚糖－明胶支架内培养一段时间后，形成细胞支架结构物，可作为人工真皮。Mao J S等人还证明了透明质酸和壳聚糖－明胶网络复合制成的双层支架也能用作人工皮肤支架[5]。 姜广建、赵沉浮等人[6]也研制出了明胶-壳多糖混合膜，通过实验论证发现明胶－壳多糖膜具有良好的透气率和吸水率，这对于膜吸收伤口渗出液非常有利。加入适量的甘油作为增塑剂和保湿剂，使明胶－壳多糖膜具有良好的透气性、
Transwell原理
Transwell trans-这个词根有转移、转运、穿过等意思，well有小室的意思，可以从字面上理解，这是一类有通透性的杯状的装置，根据Corning公司的Transwell说明书中的介绍，可以认为这是一种膜滤器（Membrane filters），也可认为是一种有通透性的支架（permeable supports）。更准确地说，Transwell应该是一种实验技术，这项技术的主要材料是Transwell小室（Transwell chamber，Transwell insert），其外形为一个可放置在孔板里的小杯子，不同厂家对Transwell会有不同的命名，而不同型号也可有不同形状，不同大小，根据实验需要，可有不同选择。但无论是何种外形，其关键部分都是一致的，那就是杯子底层的一张有通透性的膜，而杯子其余部分的材料与普通的孔板是一样。这层膜带有微孔，孔径大小有0.1－12.0µm，根据不同需要可用不同材料，一般常用的是聚碳酸酯膜（polycarbonate membrane）。 将Transwell小室放入培养板中，小室内称上室，培养板内称下室，上室内盛装上层培养液，下室内盛装下层培养液，上下层培养液以聚碳酸酯膜相隔。我们将细胞种在上室内，由于聚碳酸酯膜有通透性，下层培养液中的成分可以影响到上室内的细胞，从而可以研究下层培养液中的成分对细胞生长、运动等的影响。 应用不同孔径和经过不同处理的聚碳酸酯膜，就可以进行共培养、细胞趋化、细胞迁移、细胞侵袭等多种方面的研究。当然不同细胞其体积不同，具体选择时要考虑到细胞大小。这里主要谈几种大家常用的实验： （1）共培养体系： 小于3.0um孔径条件下，细胞不会迁徙通过，因此，若研究不涉及细胞运动能力，不需要细胞穿过聚碳酸酯膜，则应选择3.0µm以下孔径。常用0.4、3.0µm。我们实验室用的是0.4µm。将细胞A种于上室，细胞B种于下室，可以研究细胞B分泌或代谢产生的物质对细胞A的影响。 （2）趋化性实验： 可用5.0、8.0、12.0µm膜，上室细胞可穿过聚碳酸酯膜进入下室，计数进入下室的细胞量可反映下室成分对上室细胞的趋化能力。 ①细胞B对细胞A的趋化作用：将细胞A种于上室，细胞B种于下室，可以研究细胞B分泌或代谢产生的物质对细胞A的趋化作用。 ②趋化因子对细胞的趋化作用：将细胞种于上室，下室加入某种趋化因子，可研究该趋化因子对细胞的趋化作用。 （3）肿瘤细胞迁移实验： 常用8.0、12.0µm膜，上室种肿瘤细胞，下室加入FBS或某些特定的趋化因子，肿瘤细胞会向营养成分高的下室跑，计数进入下室的细胞量可反映肿瘤细胞的迁移能力。
基质金属蛋白酶在心肌缺血再灌注损伤中的研究进展
基质金属蛋白酶在心肌缺血再灌注损伤中的 研究进展 【关键词】基质金属蛋白酶；心肌；缺血再灌注损伤 最近几年研究说明，基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinases，MMPs)参与血小板聚集、心肌缺血再灌注损伤等急性进程。在多种心血管疾病如动脉粥样硬化、心肌梗死、心衰、心室重构、动脉损伤后新生内膜形成中发挥重要作用。适当抑制MMPs 有望成为医治心血管疾病的药物靶点。本文就MMPs的结构、功能与生化和在缺血再灌注损伤中的作用综述如下。 1 MMPs 的三维立体结构〔1〕 由一个5端β折叠片，3个螺旋和连接环组成主链。整体来讲，蛋白水解酶区域是由一个起触媒作用的锌、一个结构(上)的锌和三个钙离子组成。底物连接裂口是由IV链、β螺旋和β螺旋后的延长环区域组成。三个组氨酸配位活性位点锌。环区域包括保守的“蛋氨酸旋转”，它是起触媒作用的锌周围起支持结构的基础。 2 MMPs功能与生化 自从1962年Gross和Lapiere发觉第一种MMPs胶原酶以
来，目前已发觉约有66 种MMPs (包括25 种人类的MMPs) 。依照它们的结构与底物的不同，可分为六大类：胶原酶、基质溶素、基质溶解因子、明胶酶、膜型MMPs（MT MMP）、其他MMPs基质金属蛋白酶。 MMPs是结构上与锌相关的肽链内切酶家族。MMP在细胞外基质正常的降解进程中发挥重要的作用，这些生理进程包括：组织形成、组织修复、血管生成等。另外它也参与细胞外基质的过度降解进程。病理进程包括：风湿性关节炎、骨关节炎、动脉粥样硬化、牙周炎和皮肤的自身免疫水泡病、皮肤的光老化、肿瘤浸润和肿瘤转移等〔2〕。 3 MMPs的激活与调剂 大多数情形下，MMPs的蛋白水解的活化是慢慢的。初期的蛋白水解发生在酶原的第一个和第二个螺旋之间的显露区域。一个MMP 序列的发觉表述了“诱饵”区域裂口特异性。一旦酶原的一部份被移动，这就可能阻碍酶原的其他部份，包括半胱氨酸开关锌彼此作用，将通过部份MMPs媒介物活化或其他有活性的MMPs致使分子间的彼此作用。 MMPs的活化方式要紧为：细胞内的活化和细胞表面活化。Pei 和 Weiss第一次证明了成对碱性氨基酸蛋白酶在细胞内活化MMP 11。MMP2的要紧活化发生在细胞表面受 MT MMP介导。
Gadd45α对绒毛外滋养细胞迁移和侵袭能力影响的相关研究
Gadd45α对绒毛外滋养细胞迁移和侵袭能力影响的相关研究刘西茹;慕华桥;罗欣;漆洪波 【期刊名称】《重庆医科大学学报》 【年(卷),期】2014(39)11 【摘要】目的:研究人生长阻滞和DNA损伤45α(growth arrest and DNA damage 45 alpha,Gadd45α)基因对滋养细胞HTR8/SVneo增殖、凋亡、迁移和侵袭等生物学功能的影响,探讨其在子痫前期(preeclampsia,PE)发生发展中的可能作用。方法:构建Gadd45α短发夹干扰RNA,以阴性对照组作为参照,转染人滋养细胞HTR8/SVneo,即分为实验组(si-Gadd45α)和阴性对照组(si-NC)进行实验;应用流式细胞仪检测转染效率,并应用q RT-PCR和Western blot检测转染后各组细胞中Gadd45αm RNA和蛋白表达水平;采用四甲基偶氮唑蓝(methyl thiazolyl tetrazolium,MTT)显色法检测转染后各组细胞增殖能力;应用流式细胞仪对转染后各组细胞进行细胞凋亡分析;采用Transwell法检测转染后各组细胞迁移和侵袭能力;采用早孕绒毛外植体培养模型观察敲除Gadd45α基因后对绒毛外滋养细胞外生性迁移能力的影响;收集各组细胞培养上清液,明胶酶谱法检测基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinases,MMPs)的表达,蛋白免疫印迹检测基质金属蛋白酶组织抑制因子(tissue inhibitors of MMPs,TIMPs)的表达。结果:流式细胞仪检测转染效率约为90%;转染后实验组较对照组Gadd45αm RNA的表达量约降低80%,蛋白表达水平约下降70%,差异均有统计学意义(P<0.01),证明干扰Gadd45α表达成功。MTT法和流式细胞仪检测细胞增殖和凋亡,结果显示实验组和对照组细胞增殖和凋亡均无统计学差异(P>0.05)。Transwell实验表明干扰Gadd45α后 HTR8/SVneo侵袭能力明显增加,约为对照组的1.65倍;迁移能力也明显增加,约为
Transwell实验原理与操作步骤
Transwell实验原理与操作步骤 Trans-这个词根有转移、转运、穿过等意思，well有小室的意思，可以从字面上理解，这是一类有通透性的杯状的装置，根据Corning公司的Transwell说明书中的介绍，可以认为这是一种膜滤器（Membrane filters），也可认为是一种有通透性的支架（permeable supports）。更准确地说，Transwell应该是一种实验技术，这项技术的主要材料是Transwell 小室（Transwell chamber，Transwell insert），其外形为一个可放置在孔板里的小杯子，不同厂家对Transwell会有不同的命名，而不同型号也可有不同形状，不同大小，根据实验需要，可有不同选择。但无论是何种外形，其关键部分都是一致的，那就是杯子底层的一张有通透性的膜，而杯子其余部分的材料与普通的孔板是一样。这层膜带有微孔，孔径大小有0.1－12.0µm，根据不同需要可用不同材料，一般常用的是聚碳酸酯膜（polycarbonate membrane）。 将Transwell小室放入培养板中，小室内称上室，培养板内称下室，上室内盛装上层培养液，下室内盛装下层培养液，上下层培养液以聚碳酸酯膜相隔。我们将细胞种在上室内，由于聚碳酸酯膜有通透性，下层培养液中的成分可以影响到上室内的细胞，从而可以研究下层培养液中的成分对细胞生长、运动等的影响。 应用不同孔径和经过不同处理的聚碳酸酯膜，就可以进行共培养、细胞趋化、细胞迁移、细胞侵袭等多种方面的研究。当然不同细胞其体积不同，具体选择时要考虑到细胞大小。这里主要谈几种大家常用的实验： （1）共培养体系： 小于3.0um孔径条件下，细胞不会迁徙通过，因此，若研究不涉及细胞运动能力，不需要细胞穿过聚碳酸酯膜，则应选择3.0µm以下孔径。常用0.4、3.0µm。我们实验室用的是0.4µm。将细胞A种于上室，细胞B种于下室，可以研究细胞B分泌或代谢产生的物质对细胞A的影响。 （2）趋化性实验： 可用5.0、8.0、12.0µm膜，上室细胞可穿过聚碳酸酯膜进入下室，计数进入下室的细胞量可反映下室成分对上室细胞的趋化能力。 ①细胞B对细胞A的趋化作用：将细胞A种于上室，细胞B种于下室，可以研究细胞B分泌或代谢产生的物质对细胞A的趋化作用。 ②趋化因子对细胞的趋化作用：将细胞种于上室，下室加入某种趋化因子，可研究该趋化因子对细胞的趋化作用。 （3）肿瘤细胞迁移实验： 常用8.0、12.0µm膜，上室种肿瘤细胞，下室加入FBS或某些特定的趋化因子，肿瘤细胞会向营养成分高的下室跑，计数进入下室的细胞量可反映肿瘤细胞的迁移能力。