酶谱法测定肝星状细胞合成的明胶酶活性

酶谱法测定肝星状细胞合成的明胶酶活性

王晓丹;时晓明;曲显俊;程艳娜;史桂云;高允生

【摘要】目的建立检测肝星状细胞(HSC)合成的明胶酶(MMP-2,MMP-9)活性的方法.方法用含SDS-明胶的聚丙烯酰胺凝胶电泳为基础的酶谱法,检测体外培养的HSC所合成的明胶酶活性.结果酶谱法能灵敏地检测到HSC分泌到培养基中的MMP-2和MMP-9,培养基中MMP-2活性高于MMP-9,并观察到药物作用以后酶活性的改变.结论酶谱法是研究HSC调节肝纤维化过程中细胞外基质(ECM)代谢的有效手段.

【期刊名称】《泰山医学院学报》

【年(卷),期】2010(031)007

【总页数】2页(P513-514)

【关键词】肝纤维化;肝星状细胞;明胶酶;酶谱法

【作者】王晓丹;时晓明;曲显俊;程艳娜;史桂云;高允生

【作者单位】泰山医学院,山东,泰安,271016;泰山医学院,山东,泰安,271016;山东大学药学院,山东,济南,250014;山东大学药学院,山东,济南,250014;泰山医学院附属医院,山东,泰安,271000;泰山医学院,山东,泰安,271016

【正文语种】中文

【中图分类】R282.71

肝纤维化(hepatic fibrosis,HF)是继发于各种原因引起的肝脏炎症或损伤后组织修

复过程中的代偿反应,以细胞外基质(extracellular matrix,ECM)在肝内过量沉积为病理特征[1]。近年的研究[2]表明肝星状细胞(HSC)在肝纤维化的病理生理过程中起着关键作用,HSC从静止转化为激活状态可合成肝脏几乎全部 ECM,因此 HSC的激活是肝纤维化发生的中心环节,同时合成大量 ECM,并通过其合成的基质金属蛋白酶(MMPs)和金属蛋白酶组织抑制因子(TIMPs)调节 ECM降解。为了研究 HSC在ECM降解中的作用及用 HSC研究具有促进 ECM降解的药物,我们尝试了 HSC明胶酶谱的测定方法。

1 材料与方法

1.1 实验材料明胶酶(gelatinase,17104-019,美国 Gibco BRL公司产

品);TEMED(N,N,N,N-四甲基乙二胺),过硫酸胺(amnonium persulfate,AP,A-6761)均为美国 Sigma公司产品;考马斯亮蓝(Coomassie brilliant blue R-250),丙烯酰胺(acrylamide),甲叉双丙烯酰胺(bisacrylamide)均为美国 Bio.Basic.Inc.BBI 公司产品 ;Triton X-100、SDS等,美国SERVA公司产品。其余试剂均为分析纯。

1.2 试剂配制 1%明胶：称 1.0 g明胶溶于 100 ml蒸馏水,37℃溶解,4℃保存。样品缓冲液：0.25 mol/L Tris-HCl(pH 6.8),10%SDS,4%蔗糖,0.1%溴酚蓝。电泳缓冲液：0.025 mol/L Tris,0.192 mol/L甘氨酸(pH 8.5),0.1%SDS。洗脱缓冲液：

2.5%Triton X-100。明胶酶缓冲液：50 mmol/L Tris,10 mmol/L CaCl2,200 mmol/L NaCl,1μmol/L ZnCl2。染色液：0.25%考马斯亮蓝 R-250(溶于 1︰4.5︰ 4.5的冰乙酸、甲醇和 H2 O中)。脱色液：冰乙酸︰甲醇︰ H2O=1︰ 4.5︰4.5。

1.3 细胞培养 HSC细胞株购于中国医学科学院肿瘤研究所生物检测中心细胞库,生长于 DMEM培养基(Gibco BRL,Rockville,MD,USA)+15%胎牛血清(含 2 mM L-glutamine,penicillin and streptomycin)中 ,置37°C(5%CO2 ～ 95%air)培养箱生长,以0.05%EDTA-PBS分散成为单细胞。取处于对数生长期的细胞用于实验。

1.4 明胶酶的酶谱法测定

1.4.1 制胶与普通的聚丙烯酰胺凝胶的制胶过程相同,只在分离胶中加入 1%的明胶,使明胶的终浓度为 0.1%。

1.4.2 样品制备 HSC培养 24 h后的细胞培养基离心后以 2︰ 1与样品缓冲液混匀,取15μl上样电泳。

1.4.3 电泳于 BIO-RAD电泳槽中,常温 80 V电压电泳 30 min,100 V电压电泳1.5 h。

1.4.4 洗脱将胶置于洗脱缓冲液中,脱色摇床上洗脱 15 min,蒸馏水中漂洗 3次,充分除去 SDS。

1.4.5 反应将胶置于反应缓冲液中37℃反应过夜。

1.4.6 染色及脱色将胶自反应液中取出,三蒸水漂洗 2次,染色液中常温染色 4 h,蒸馏水漂洗 2次,置脱色液中常温脱色 15 min,照相、记录。

2 结果

2.1 培养的 HSC 图 1显示培养 10d的 HSC,细胞呈星形、多边形、棱形,有很长的细胞突起。细胞复苏以后传代培养,此时的 HSC是研究 ECM合成与降解的良好材料。

图1 培养 10d的HSC(×400)

2.2 酶谱法检测到的 MMPs活性条带此方法能够灵敏地检测到 HSC分泌到细胞外的 MM--2和MMP-9,并且 MMP-2的活性高于 MMP-9(图 2)。当A3处理

24h以后,培养基中的 MMPs活性发生了改变,培养基中检测到 MMP-9和 MMP-2并且 MMP-2活性增加(图 3)。

图2 酶谱法检测到MMPs

图3 A3处理 24h后 MMPs活性

3 讨论

肝纤维化是肝脏 ECM合成与分解代谢失衡所造成的不良结局,是临床上常见的病理生理改变。HSC在肝纤维化的病理生理过程中起着关键作用,既参与 ECM合成,也

调节其降解,是造成 ECM在细胞外过度堆积的重要原因。酶谱法为研究 HSC MMPs基因表达差异,内源及外源性激活条件,酶活性的调节,从而研究肝纤维化的

病理生理机制和研究具有促进肝纤维化过程中ECM降解的药物和方法有重要意义。用含明胶的聚丙烯酰胺凝胶电泳为基础的酶谱法,能够检测到 HSC细胞内和培养基中的 MMP-2和 MMP-9,并且培养基中 MMP-2活性高于MMP-9,这与文献报道

的 HSC较高的表达 MMP-2 mRNA相一致[3]。当药物作用后,培养基中 MMP-2

显著增加,表明 MMPs的表达发生了改变,或者酶被激活。目前,常用于检测 MMPs 的方法主要是ELISA和放免法,这些方法只能检测其含量,不能检测其活性。而MMPs活性受到 TIMPs调节,TIMPs通过与 MMPs非共价结合,从而抑制 MMPs

的活性和 ECM降解,MMPs的数量不反应其对 ECM的降解能力,因此,测定 MMPs 活性更有意义[4]。酶谱法不影响 TIMPs与 MMPs的结合,能够测定 MMPs的活性,反映其在 ECM降解过程中的作用,并且此方法经济、简便、重复性好。

参考文献：

[1] 高润平,齐晓艳.肝纤维化的发生机制与治疗进展[J].世界华人消化杂

志,2006,14(23)：2263-2269.

[2] 赵稳兴,.梁崇礼.酶谱法测定肝星状细胞合成的基质金属蛋白酶活性[J].中国应用生理学杂志,2002,18(2)：56-58.

[3] Lichtinghagen R,Breitenstein K,Arndt B,et https://www.360docs.net/doc/3519225105.html,parison of matrix metalloproteinase expression in normal and cirrhotic human

liver[J].Virchows Arch,1998,432：153-158.

[4] Herron GS,Banda MJ,Clart E J,et al.Secretions of metelloproteinase by

stimulated capillary endothelial cells[J].JBiol Chem,1986,261：2814-2818.