CAST(钙蛋白酶抑制蛋白酶)功能缺失(LOF)的突变,导致皮肤缺损白甲病、肢体末端点状角质化口唇炎指关节垫

CAST（钙蛋白酶抑制蛋白酶）功能缺失(LOF)的突变，导致皮肤缺损、白甲病、肢体末端点状角质化、口唇炎、指关

节垫

一：研究背景

皮肤剥落综合征(PSS)一种皮肤角质层持续的脱落症状，从婴幼儿时发病持续终生，皮肤脱落可伴有红斑、水泡和其它外胚层组织病变，比如脱发、异常指甲。PSS可分为两种临床类型：肢端PSS(APSS)和广泛性PSS(GPSS)。APSS患者发生在手足部位的手掌面、足底、背面，和谷氨酰胺转氨酶-5突变有关。此外，导致常染色隐性遗传病鱼鳞病的半胱氨酸蛋白酶抑制酶-A(CSTA)的基因突变也和APSS有关；GPSS个体和角膜黏连蛋白突变(CDSN)有关；山姆综合征(一种严重皮炎)和桥粒心黏连蛋白-1(GSD1)突变有关;Exampl…….。然而，一些APSS 病人的遗传机制尚不清楚。

CSAT基因突变为常染色隐性遗传，大量APSS患者该突变基因型为纯合子，临床表现白甲、肢体末端点状角质化、口唇炎、指关节垫，疾病缩写“PLACK”。通过显子测序和Sanger测序，证实了在三个互相隔离的家庭成员PLACK患者中，不同的纯合子的CSAT功能缺失。

二：研究目的

验证CSAT在表皮稳态中的作用。

3.1 样本采集：一个28岁的PLACK中国女性患者(individual1)、一个尼泊尔PLACK儿童患者(individual2)、两个欧洲先天性厚甲症患者(individual3、4)的血液和唾液样本；

3.2 Sanger测序：排除其它皮肤炎症遗传病中TGM5, CSTA, CDSN, 和CHST8基因突变；

3.3 individual-1 和individual 2全外显子测序，外显子捕获先通过罗氏NimbleGen SeqCap EZ Library外显子捕获系统富集，然后Illumina HiSeq2000测序；

3.4 individual-1 和individual 2突变通过dbSNP137、1000 G、HapMap和BGI内部数据库过滤；

3.5 RT-PCR对individual 1皮肤中CAST的mRNA表达进行定量，设定阴性对照；

3.6 individual 1胫前皮肤CAST抗体免疫组化染色，individual 2左大腿皮肤

进行CAST抗体免疫荧光染色，同时设置阴性对照；

3.7 通过TUNEL实验(原位细胞凋亡检测试剂盒)检测individual 1的破损皮肤的细胞凋亡情况，荧光显微镜观察基底层上层细胞，对总细胞和凋亡细胞计数，健康人皮肤为对照，；

3.8 研究CAST功能缺失突变对细胞CAST表达影响：

选择角质形成细胞系HaCaT进行研究，使用siRNA介导的CAST基因低表达技术处理(CAST KD cells)，对照组不进行靶基因siRNA干扰(NTP cells)；

3.8.1免疫荧光染色镜下观察两组细胞CAST表达水平；

3.8.2免疫印迹法分析两组细胞CAST蛋白表达水平；

四：研究结果

4.1 全外显子测序结果：

4.1.1 individual-1 148个纯合子突变，15个在外显子区和剪接区，CAST 基因上发现一个核苷酸重复(c.607dup)导致移码突变，使蛋白合成终止。改突变为为纯合子类型，在她家人中为杂合子；

4.1.2 individual 2，CAST基因上点突变(c.424A>T)；

4.1.3 individual 3和4 ，CAST基因上一位点G碱基缺失(c.1750delG)。

这个突变在很多数据库中都没有记录。

4.2 RT-PCR结果：

individual 1皮肤中CAST的mRNA含量非常低；

4.3 individual 1免疫组化和individual 2免疫荧光结果

4.3.1 CAST含量在individual 1和2的皮肤中明显低于正常人皮肤中含量。

4.3.2 individual 1破损的皮肤免疫组化结果显示：兜甲蛋白、角蛋白-1、角蛋白-10表达微量上调(表皮破损的代偿作用)；于此相反的，individual 1和individual 2其皮肤丝聚蛋白、紧密连接蛋白-1含量与对照无明显差别(无代偿)。

4.4 细胞凋亡荧光显微镜及电镜结果：

破损皮肤凋亡细胞数明显多于健康人(Fig3A、B)，其超微结构观察，细胞间隙增大(Fig3D)，染色质聚缩、边集(Fig3E)。

4.5 CAST功能缺失突变对细胞CAST表达影响：

4.5.1 免疫荧光染色镜下观察结果：NTP细胞CAST表达量(绿色荧光染色)显著高于CAST KD细胞(Fig4A\B)；

4.5.2 免疫印迹法蛋白表达检测结果：NTP细胞CAST表达明，CAST KD 细胞CAST蛋白含量很弱(Fig4C)；

4.6 压应力刺激加载实验：

CAST KD细胞在拉伸后细胞间连接断裂，相反，对照组细胞间角蛋白纤维伸长，无明显断裂发生(Figures4D–4G)。

4.7 角质形成细胞迁移能力检测：

CAST KD cells和NTP cells无明显区别。

4.8 CAST在角质形成细胞间黏附机制研究结果：

1号和2号病人皮肤细胞桥粒上桥粒芯斑蛋白，含量明显增加(Fig4H/I)。五讨论：

钙蛋白酶/钙蛋白酶抑制酶(CAST)在存在于非溶酶体蛋白系统中，广泛存在于哺乳动物细胞中。钙蛋白酶催化靶蛋白水解，同时在不同细胞活动中起重要作用，比如细胞的增殖、分化、迁移及细胞周期性变化；同时，活化的钙蛋白酶也能促进细胞凋亡。钙蛋白酶抑制酶基因上发生突变，使其丧失了抑制钙蛋白酶作用，因此引起角质细胞凋亡增加，TUNEL(凋亡细胞测定)和TEM(投射显微镜)结果显示了这种作用。过量的角质形成细胞凋亡会导致皮肤角质化，其临床表现为：肢端皮肤点状角质化、指结垫、白甲。

之前报道研究，钙蛋白酶促进细胞间黏附蛋白水解，我们的CAST KD实验(CAST进行siRNA干扰使其表达下调)证实了钙蛋白酶/钙蛋白酶抑制酶系统可能在细胞间黏中起重要作用。由于CAST活性丢失的突变导致钙蛋白酶活性增加，从而使某些细胞桥粒中蛋白水解过多，引起桥粒功能减弱，使表皮细胞抗拉伸能力降低，引起表皮脱落等症状。这种猜测在PLACK综合征和其它伴随桥粒功能降低的遗传性疾病中进一步得到验证，包括GPSS、SAM综合征、内瑟顿综合征等。

在两个病人皮肤中角质形成细胞内增加的桥粒斑蛋白，可能是因为桥粒中蛋白水解的一种代偿机制。尽管CSAT在神经系统、肌肉骨骼组织、眼组织中起着不同的生理作用，但我们观察的病人并没有明显相关的症状，需要进一步研究

在这些器官组织中是否有其它的钙蛋白酶水解系统。

值得注意的是CSAT-基因敲除小鼠，其钙蛋白酶活性增加，但在正常环境下没有疾病表现，在刺激环境下，也仅有轻微的行为改变。这些表型的差异说明了在人和小鼠体内钙蛋白酶/钙蛋白酶抑制酶系统具有不同的生理功能。

六研究结论：

PLACK 综合征是一种纯合子的CAST功能缺失突变, 由于CAST含量降低引起，而CAST是唯一的已知的钙蛋白酶抑制因子。

蛋白酶抑制因子突变能够引起皮肤性疾病。比如Netherton 综合征由SPINK5突变引起，长岛型掌跖角化症SERPINB7突变，我们的研究拓展了皮肤蛋白水解机制的研究思路。